专利名称：一种葡萄球菌蛋白a及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及ー种葡萄球菌蛋白A及其制备方法和用途。
背景技术：
葡萄球菌蛋白AGtaphylococal Protein A, SPA)是ー种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。1940年，Vevwey发现在某些金黄色葡萄球菌中，含有ー种物质，在双向扩散试验中，能与正常人血清形成沉淀。1959年，Jensen也发现了类似现象，将其命名为A抗原；1960年Grov将其命名为葡萄球菌蛋白A，简称SPA蛋白A，1963年Lofkvist等分离了 A抗原，并证明它是ー种蛋白质，且与糖有区別。葡萄球菌蛋白A是抗体纯化的重要介质。随着我国生物技术产业，特别是以单克隆抗体药物为代表的生物制药产业的快速发展，葡萄球菌蛋白A的市场需求将迅速増加。但在使用含有葡萄球菌蛋白A的亲和层析技术吋，存在亲和カ低、纯化效率低等问题，因此在使用该亲和层析技术时，需要一种改进的葡萄球菌蛋白A，来实现更高的亲和力，提高纯化的效果。
发明内容
本发明的目的之一在干，提供ー种葡萄球菌蛋白A，以克服现有技术的不足。本发明的第二个目的在干，提供编码该葡萄球菌蛋白A的基因序列。本发明的第三个目的在干，提供含有该葡萄球菌蛋白A基因的载体。本发明的第四个目的在干，提供含有该葡萄球菌蛋白A基因的表达载体转化宿主細胞。本发明的第六个目的在干，提供该葡萄球菌蛋白A的用途。本发明的第七个目的在干，提供一种由该葡萄球菌蛋白A和层析介质载体組成的亲和层析介质。本发明提供的葡萄球菌蛋白A的氨基酸序列如SEQ ID NO :1、5、7或11所示。本发明提供的编码如权利要求1所述的葡萄球菌蛋白A的核苷酸序列如SEQ ID NO :2、6、8 或 12 所示。本发明提供的重组表达载体含有本发明提供的核苷酸序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。本发明提供的宿主細胞由本发明提供的表达载体转化，优选的，宿主細胞是大肠杆菌，更优选的，大肠杆菌是BL21 (DE3)。本发明提供的葡萄球菌蛋白A的用途为用于抗体检测、分离、纯化。本发明提供的亲和层析介质由本发明提供的葡萄球菌蛋白A与层析介质载体组成，优选的层析介质载体是琼脂糖凝胶、葡聚糖、纤维素、硅胶或带羟基的高分子聚合物。本发明的葡萄球菌蛋白A基因的表达产物葡萄球菌蛋白A可用干与各种不同的层析介质载体如琼脂糖凝胶、葡聚糖、纤维素、带羟基的高分子聚合物、硅胶等偶联成为亲和层析介质用于抗体的分离纯化。使用本发明提供的葡萄球菌蛋白A制备的亲和层析介质具有蛋白结合特异性強， 亲和カ高，纯化效率大大改善的优点，与市售的ftOteinA Sepharose 4Fast Flow相比，其动态吸附载量明显提高。
具体实施例方式以下结合实施例进ー步说明本发明，下述实施例不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主細胞的方法以及经典的細胞融合和单克隆抗体筛选及纯化的方法等。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，Fritsch，Ε. F. and Maniais， Τ. (1989)MolecularCloning :A Laboratory Manual,2nd edition, Cold spring Harbor Laboratory Press.在本发明的下述实施例中，使用的
缓冲液A为pH7. 4的PBS溶液；缓冲液B为pH4. O的20mM柠檬酸缓冲液，其配制方法如下柠檬酸2. Ig加水 950ml，用 5M NaOH 调至 pH4. 0，加水至 IOOOml ；缓冲液C为pH3. O的0. 5M醋酸缓冲液，其配制方法如下0. 5M醋酸溶液用固体 NaOH 调至 pH3. 0。在本发明的下述实施例中，使用的人IgGl按中国发明专利01132225. X中公开的方法制备。实施例1、合成葡萄球菌蛋白A基因单体通过化学合成的方法，设计合成葡萄球菌蛋白A基因一个重复片段的序列，其序列包括长度为174bp，前端加入与表达载体相连的NcoI酶切位点，6个His (用于亲和层折， 与镍柱结合，减少纯化步骤)、EK酶切位点(用于将His和DDDDK切去，形成正确的Protein Α)和AccI酶切位点(用于连入多个重复片段)。另外，还包括终止密码子TAA，及克隆用 BamH I限制性内切酶接头共9bp。通过化学合成的方法，设计合成葡萄球菌蛋白A基因一个重复片段的序列，其序列包括长度为174bp，两端为AccI酶切位点，用于构建含有多个重复片段的序列。其中，重复片段序列如SEQ ID NO 2的41-214位核苷酸所示。实施例2、构建含ー个葡萄球菌蛋白A基因単体的pET3h载体用限制型内切酶NcoI和BamH I将上述葡萄球菌蛋白A基因単体切下，与经NcoI 及BamH I酶切的载体pET3h连接，转化大肠杆菌，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子，经质粒提取，酶切鉴定后证明葡萄球菌蛋白A基因単体已克隆至pET3h中。实施例3、含有葡萄球菌蛋白A基因的pET3h-P载体的构建将上述含ー个葡萄球菌蛋白A基因単体的pET3h载体及葡萄球菌蛋白A基因单体以AccI酶切，回收相应片段后连接，转化大肠杆菌，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子， 经质粒提取，酶切筛选获得含有3个蛋白A基因単体的葡萄球菌蛋白A的pET3^-P载体，
4经检測，其基因序列如SEQ ID No:2所示。实施例4、表汰葡萄球菌蛋白A的大肠杆菌菌株的构建用CaC12法将pET3^_P转化BL21 (DE3)，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，经质粒检测和酶切分析获得含有pET3^的重组转化子BL21/pET32a。实施例5、牛产葡萄球菌蛋白A5. 1、菌种的培养发酵挑取大肠杆菌工程菌BL21/pET32a，接种于LB培养基中，接种量1 2% V/V，于 30°C培养过夜，次日在无菌条件下将上述培养好的种子培养基按1 10-1 5接种于发酵培养基上，30°C发酵至0. D600达到0. 4 0. 8，升温至42°C诱导，3 5小时后离心收菌。取少量細胞加2X上样缓冲液，进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果显示重组蛋白 A已在BL21/pET32a中诱导可溶表达。5. 2、表达的葡萄球菌蛋白A的纯化将步骤5. 1中收集的菌体用磷酸盐缓冲液(0. 2M，pH7. 0-8. 0，含有0. IMNaCl)悬浮，超声破碎，4°C离心，收集上清，得粗提液。将粗提液使用SDS-PAGE电泳检測，结果显示大部分葡萄球菌蛋白A被粗提，残存于菌体的量极微将粗提液进行kphacryl 5200分子筛纯化，收集特征峰(第二洗脱峰) 即为纯化的葡萄球菌蛋白A(命名为ftOtein A 1)，其纯度可达90%以上，其氨基酸序列如 SEQ ID No 1 所示。采用与实施例1-5相同或相似的方法，分别制备、纯化了 5种不同的葡萄球菌蛋白 A (分别命名为ProteinA2-6)，核苷酸序列分别如SEQ ID No :4、6、8、10和12所示，对应的氨基酸序列分别如SEQ ID No :3、5、7、9和11所示。实施例6、ELISA检测葡萄球菌蛋白A与抗体结合活性采用ELISA法检测葡萄球菌蛋白A与抗体结合活性，具体过程如下1)包被在96孔板中每孔包被葡萄球菌蛋白A样品100ul，37°C，Ih ；2)封闭每孔以 IOOul 的的 BSA 封闭，37°C，lh ；3)加ー抗每孔加入约IOOug人IgG抗体，37°C，Ih ；4)加ニ抗每孔加入约IOOul，1 1000辣根过氧化物酶标记抗体，37°C，Ih ；5)显色。经ELISA检测显示，Protein A 1、3、4、6与人IgG抗体结合活性强，每孔包被 2. 5-4. 5ng葡萄球菌蛋白A即可获得明显的检测信号，因此可用于抗体的检测，而ftOteinA 2和ftOteinA 5的效果相对较差，分別需要8. 2和9. 6ng葡萄球菌蛋白A才可获得检测信号。实施例7、葡萄球菌蛋白A琼脂糖凝胶5S CP的制备分別使用实施例5制备的ftOtein A 1-6制备葡萄球菌蛋白A琼脂糖凝胶5S CP, 具体过程如下1、用环氧氯丙烷、氢氧化钠与琼脂糖(5%的交联琼脂糖凝胶)在水介质中进行反应，在30-60°C的温度下反应2-3小吋，反应完后用蒸馏水清洗至中性后抽干；2、将上述产物分别与ftOteinA 1-6在5_25°C温度下反应15_20小时，反应完后清洗再抽干，即得到葡萄球菌蛋白A琼脂糖凝胶5S CP，分别对应ftOtein A 1_6命名为5SCP-1-5SCP-6。经检测，制备的葡萄球菌蛋白A琼脂糖凝胶5S CP1-6特性如表1所示表1、制备的5S CP的特性
权利要求
1.ー种葡萄球菌蛋白A，其特征在干，所述葡萄球菌蛋白A的氨基酸序列如SEQ ID NO 1、5、7或11所示。
2.编码如权利要求1所述的葡萄球菌蛋白A的核苷酸序列，其特征在干，所述核苷酸序列如 SEQ ID NO :2、6、8 或 12 所示。
3.—种重组表达载体，其特征在干，所述表达载体含有权利要求2所述的核苷酸序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。
4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在干，所述表达载体是pET3^-P。
5.ー种宿主細胞，其特征在干，所述宿主细胞转化有权利要求3或4所述的表达载体。
6.如权利要求5所述的宿主細胞，其特征在干，所述及的宿主細胞是大肠杆菌。
7.如权利要求6所述的宿主細胞，其特征在干，所述及的大肠杆菌是BL21(DE3)。
8.如权利要求1所述的葡萄球菌蛋白A用于抗体检测、分离、纯化的应用。
9.一种亲和层析介质，其特征在干，所述亲和层析介质由权利要求1所述的葡萄球菌蛋白A与层析介质载体組成。
10.如权利要求10所述的亲和层析介质，其特征为，所述层析介质载体是琼脂糖凝胶、 葡聚糖、纤维素、硅胶或带羟基的高分子聚合物。
全文摘要
本发明公开了一种葡萄球菌蛋白A、编码葡萄球菌蛋白A的核苷酸序列以及该葡萄球菌蛋白A与层析介质载体组成的亲和层析介质。本发明提供的葡萄球菌蛋白A的氨基酸序列如SEQ ID NO1、5、7或11所示。使用本发明提供的葡萄球菌蛋白A制备的亲和层析介质具有蛋白结合特异性强，亲和力高，纯化效率大大改善的优点，与市售的ProteinA Sepharose 4Fast Flow相比，其动态吸附载量明显提高。
文档编号G01N33/53GK102558315SQ20101058141
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者倪华, 王进秋, 胡辉, 郭亚军 申请人:上海抗体药物国家工程研究中心有限公司