专利名称：一种检测猪链球菌的试纸及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测猪链球菌的试纸，具体涉及一种检测猪链球菌2型的免疫层 析试纸，还涉及该试纸的制备方法及用途。
背景技术：
人猪链球菌病属国家规定的二类动物疫病，是一种人畜共患传染病。人感染猪链 球菌病是人类感染猪链球菌2型(Str印tococcus suis serotype 2，SS2)等所致的一种 人畜共患疾病。猪链球菌属于兰氏分类法的R群，有35个血清型，以猪链球菌2型流行最 广，致病性最强。猪链球菌不仅可以引发猪脑膜炎、心内膜炎、败血症、关节炎、多浆膜炎、肺 炎甚至突然死亡，还可以经破损皮肤或黏膜侵入人体，导致人感染发病，对农场和屠宰场工 人的构成了威胁。人感染猪链球菌临床表现为败血症、中毒性休克综合征(TSS)和脑膜炎。 人感染猪链球菌病的主要传染源是病死猪，主要传播途径为宰杀病死猪，切割、清洗病死猪 肉等，手部皮肤有损伤的人员尤易感染。进食未煮熟、煮透的病死猪肉也可引起感染。近年 来我国面临着猪链球菌感染暴发流行加重的威胁，1998年与2005年猪链球菌在我国两次 爆发流行，共造成229人感染，其中死亡53例。在我国猪链球菌引起人、猪共感染发病，不 但给养猪业造成严重经济损失，也给公共卫生和食品安全带来了威胁。该病引起了世界范 围的公共卫生领域的高度重视，越来越多的研究者开始对猪链球菌进行更深入的研究。传统的对猪链球菌病原的分离鉴定主要依靠传统的分离培养和生化鉴定，然后用 猪链球菌高免血清进行凝集试验分型。生化鉴定虽然能较可靠的检测鉴定出猪链球菌2 型，但其必需以分离出的纯菌为基础，但是这两种方法操作繁琐，不利于进行现场的快速诊 断。为提高我国对突发公共事件相关的安全监控能力，迫切需要建立我国具有高效、敏感、 快速、高特异性的检测技术。胶体金免疫快速诊断技术(快速诊断试纸条)是20世纪90年代以来在单克隆抗 体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术。该 技术主要是将特异性的抗原或抗体以条带状固定在硝酸纤维素膜(NC)上，胶体金标记试 剂吸附在结合垫上，当待测样品加到试纸条一端的样品垫上后，通过毛细作用向前移动，溶 解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待测物 和金标试剂的复合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，通过可目测的胶 体金标记物得到直观的显色结果。而流离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分 离的目的。胶体金免疫层析快速诊断技术可以在短时间内提供结果，该检测法快捷、方便、 精确、可靠、廉价而且操作简易的。到目前为止，尚未见到采用胶体金免疫层析技术检测猪链球菌2型的报道。
发明内容
本发明公开了一种检测猪链球菌2型的免疫层析试纸，还公开了该试纸的制备方 法及该试纸的用途。
本发明的免疫层析试纸为胶体金免疫层析试纸，包括样品垫、胶金垫、NC膜和吸收 垫四部分。在胶金垫上有胶体金探针，NC膜上有检测带和指控带，检测带和指控带分别包被 有猪链球菌2型抗体及抗猪链球菌2型抗抗体。上述猪链球菌2型抗体为猪链球菌2型。 猪链球菌2型抗体可以为猪链球菌2型免疫不同动物获得的抗体，优选兔抗猪链球菌2型 抗体；制备猪链球菌2型抗体，可以选择醛化的猪链球菌2型抗原免疫而成，如甲醛和戊二 醛，优选甲醛于37°C灭活7d即可作为免疫原，可保证抗体良好的特异性。抗猪链球菌2 型抗抗体可以通过免疫不同动物获得，优选羊抗兔免疫血清，可以购买商业化抗体。上述两 种在检测带和指控带上包被的抗体可以采用不同浓度，优选浓度分别为兔抗猪链球菌2型 抗体浓度为2. Omg/ml，羊抗兔免疫血清浓度为0. 5mg/ml。本发明的检测猪链球菌2型的免疫层析试纸的制备方法包括制备猪链球菌2型抗 体；胶体金的制备；胶体金探针的制备；将猪链球菌2型抗体和抗猪链球菌2型抗抗体在NC 膜上进行包被；将吸收垫、样品垫及处理后的胶金垫和NC膜叠加粘到PVC板上，组装成完整 的试纸等步骤。制备猪链球菌2型抗体采用直接用猪链球菌2型免疫动物的方法进行，获得的抗 体为多克隆抗体。首先需要制备猪链球菌2型抗原，先将猪链球菌2型培养，收集菌液后甲 醛灭活即可作为抗原。然后用抗原免疫动物，免疫按常规方法进行，免疫前和每次免疫后采 血通过ELISA方法测定动物抗体滴度。经过6次免疫后抗体滴度达到一般免疫反应水平， 为107，所获得的抗体可用于胶体金免疫层析试纸条的制备。获得的猪链球菌2型先要经过 纯化，可以采用蛋白A-琼脂糖亲和层析法进行。纯化好的抗体透析后-70°C保存备用。胶体金的制备采用柠檬酸钠还原法进行制备，获得直径约25nm的胶体金。胶体金探针的制备将制备的猪链球菌2型抗体用纯水透析，而且在使用抗体前 一般要先离心去除易形成的二聚体。用碳酸钾溶液调节胶体金溶液的PH值，与制备的猪链 球菌2型抗体混合，离心去上清后用含1 % BSA的PBS溶解沉淀，离心后再次重悬沉淀，离心 取上清即为标记好的胶体金探针。其中胶体金溶液的PH值为>8.5，优选8.5。猪链球菌 2型抗体的最适抗体保护量为22 μ g/mL。接着是将猪链球菌2型抗体和抗猪链球菌2型多抗抗体在NC膜上进行包被。首先 将猪链球菌2型抗体用PBS工作液透析，然后将稀释好的猪链球菌2型抗体和羊抗兔抗体， 分别在NC膜上划线进行包被，成为T带和C带，见图1。包被的抗体浓度为彡2. Omg/ml,以 2. Omg/ml为最佳，用BSA溶液进行封闭，1. 5%为最佳浓度。本发明还公开了检测猪链球菌的免疫层析试纸的用途。该用途是通过下列试验进 行验证的。首先验证本发明试纸的敏感性，将培养的猪链球菌稀释成不同浓度的菌液，加样 品稀释液进行检测，以不含猪链球菌2型的样品液为空白对照。本发明的胶体金免疫层析 试纸检测猪链球菌的灵敏度为1. OX 106CFU/ml。然后验证本发明试纸的特异性。将培养的猪链球菌、其它链球菌属以及金色葡萄 球菌、单增李斯特菌、甲型副伤寒沙门氏菌、大肠埃希菌、产气荚膜梭菌分别培养，稀释成浓 度> 108CFU/ml的菌悬液，用本发明检测猪链球菌的免疫层析试纸进行检测。用该试纸条检 测猪链球菌2型国内及国外的流行株与非流行株以及致病株与非致病株，结果均为阳性； 尤其令人惊奇的是，尽管该抗体采用醛化的猪链球菌粗抗原制备，但具有良好的血清特异
4性，除猪链球菌1/2型外，该试纸条与其它血清型的猪链球菌无交叉反应。说明该试纸条检 测范围广，特异性好。该免疫试纸与常见的致病菌和链球菌属的15个群也均无交叉反应。 依据以上的结果显示，该试纸条具有良好的特异性。接着是验证本发明试纸的稳定性。分别在4°C和室温保存3个月，在37°C存放15 天后，检测结果均未发生变化，说明试纸稳定性好。本发明的试纸还经过了模拟标本的检测。通过检测，本发明试纸的灵敏度结果可 达到106CFU/ml，空白样本的检测结果为阴性。本发明的检测猪链球菌的免疫层析试纸是应用猪链球菌2型的多克隆抗体，根据 双抗体夹心法的原理研制而成。克服了传统细菌免疫学诊断试剂的采用全菌抗原制备抗 体、特异性较差、常与近缘细菌存在交叉反应、实用性较差等缺陷。利用本发明试纸检测猪 链球菌2型，标本处理简单，10分钟即可观察结果，最低可检出106CFU/ml。通过对模拟样 品的检测，其灵敏度高、特异性好。尤其令人惊奇的是，尽管该抗体采用醛化的猪链球菌粗 抗原制备，但具有良好的血清特异性，除猪链球菌1/2型外，该试纸条与其它血清型的猪链 球菌无交叉反应。也就是说，本发明使用的抗体虽然是多抗，但制备的胶体金免疫层析试纸 具有较高的特异性，这是本领域技术人员所不能想到的，具有意想不到的效果。本发明的试 纸具有敏感性、特异性、简便性和快速性等特点，适于在临床和现场使用，可以作为一种人 猪链球菌初筛的诊断方法，该试纸的应用有利于我们对猪链球菌疫情的了解和控制。
图1为检测结果判读示意2为猪链球菌2型血清效价测定结果图3为试纸条的敏感性检测。其中1为空白对照2，3，4，5，6为猪链球菌2型，其 中 2 为 1. OX 108CFU/ml，3 为 1. OX 107CFU/ml，4 为 1. OX 106CFU/ml，5 为 1. OX 105CFU/ml，6 为 1. 0X104CFU/ml。图4为试纸条的稳定性检测。其中1为金色葡萄球菌108CFU/ml，2为猪链球菌2 型 108CFU/ml，3 为 S. suis 149 IO6 CFU/ml，4 为空白对照
具体实施例方式实施例一猪链球菌2型抗体制备一、材料菌株猪链球菌2型(猪链球菌S. suis 149或98012，也可采用相同血清型猪链 球菌2型菌株)，金色葡萄球菌，甲型副伤寒沙门氏菌，大肠埃希菌，猪链球菌2型，产气荚膜 梭菌由军事医学科学院微生物所提供，15种血清型的猪链球菌由哈尔滨兽医研究所提供， 其余菌株购于中国药品生物制品检定所。实验动物2kg左右新西兰大耳白兔2只，雌性。由军事医学科学院实验动物中心 提供。培养基LB培养基，THB培养基，血平板均按常规方法制备主要设备与仪器生物安全柜(美国NUAIR公司)，Spectra Max Plus全自动蛋 白核酸酶联检测仪(美国Molecular Devices公司)，ST-I微型半干转移电泳仪(大连竞迈生物科技公司生产)，AKTA FPLC蛋白纯化分析仪(瑞典AmershamPharmacia Biotech 公司)，隔流喷金划线机(美国IMAGEN ARISTA公司)，ND-1000超微量蛋白定量仪(美国 NanoDrop公司)，酶联免疫吸附仪，868型pH计(美国Thermo公司)。二、方法结果1.猪链球菌2型抗原的制备病原菌为完全抗原，可以直接免疫动物获得抗体，所以记数并灭活的S. suis 149 即为制备猪链球菌2型多克隆抗体的抗原。将保存的猪链球菌S. suisl49接种至THB液体 培养基中，于37°C静置培养7h，无菌水收集菌液，血平板计数。1 %甲醛于37°C灭活7d即可 作为免疫原。2.猪链球菌2型多克隆抗体的制备和鉴定2. 1猪链球菌2型多克隆抗体的制备猪链球菌2型多克隆抗体通过免疫2kg左右的新西兰大白兔获得。在第一次免疫 前耳静脉取血ELISA测定免疫动物是否具有天然抗体，若有则弃用。若无则从第二次免疫 开始每次免疫后1周耳静脉取血，进行间接ELISA测抗体效价。免疫方案见表1。表1猪链球菌2型免疫方案 2. 2猪链球菌2型抗体效价测定免疫后耳静脉取血500μ L，37°C放置lh，然后3000rpm离心lOmin，再IOOOOrpm离 心3min，上清即为免疫血清。以间接ELISA测定血清中抗体的效价。方法如下1)用包被缓冲液稀释的菌为109CFU/mL，100 μ L/孔，4°C包被过夜或37°C 1 2小 时，2)用 PBST 洗孔，100 μ L/ 孔，洗 3 遍，每次 3min，3)用含3% BSA的PB封闭，200 μ L/孔，置于37°C孵箱内进行封闭2小时，4) PBST 洗 3 遍，100 μ L/ 孔，每次 3min，5)用含3% BSA的PBST梯度系列稀释一抗，每孔加100μ L，37°C作用Ih6) PBST 洗 3 遍，100 μ L/ 孔，每次 3min7)用含 3% BSA 的 PBST 稀释酶标抗体(1 2000)，每孔 100 μ L，37°C，30 45min8) PBST 洗 4 遍，100 μ L/ 孔，3min/ 次9)加A、B显色液，每孔各1滴，避光显色，当阴性对照出现蓝色时加终止液 (2NH2S04)终止，450nm测得0D，以空白孔调零，若待测孔0D450值大于或等于阴性对照孔 2. 1倍，即判定为阳性，从而得出血清效价。经过7周6次免疫后，抗体滴度可达107，已达到一般免疫反应的程度，因此，本试
6验获得的猪链球菌2型抗体可用于胶体金免疫层析试纸条的制备。具体结果见图2。2. 3多克隆抗体的纯化采用蛋白A-琼脂糖亲和层析法纯化抗体，用MabTrapTMG亲和层析柱纯化抗 体，样品经平衡缓冲液(PB，5mmol/L，pH7. 0)适当稀释后，上样于用平衡缓冲液平衡好的 MabTrapTMG亲和柱，用A液彻底洗去杂蛋白后，换洗脱液B液将抗体洗下，收集洗下的抗体， 收集试管事先已加10%的lmol/L，pH 9. 0的Tris-HCI，使pH恢复至7. 0左右，以免失去活 性。纯化好的抗体用PBS工作液透析4°C两天，再lOOOOr/min离心30min，收集上清，_70°C 保存备用。实施例二猪链球菌2型胶体金测试纸的制备一、材料采用市购化学试剂，同实施例一。二、方法结果1.胶体金的制备采用柠檬酸钠还原法制备直径约25nm的胶体金。将HAuC14先配成1 %的水溶液， 取99ml纯水加热至沸腾.搅动下加入ImLl %的HAuC14，再同时加1. 5mL柠檬酸三钠水溶 液。继续加热煮沸15min左右，观察到加入液体后颜色先变成黑，随后慢慢变成酒红色，看 到酒红色后继续加热3 5min后停止加热，去离子水补至体积lOOmL。得到的即为直径为 25nm的胶体金，冷却后4°C避光保存。2.猪链球菌2型胶体金测试条的制备2. 1猪链球菌2型抗体标金前的处理由于猪链球菌2型抗体既要用于标金，也要用于喷膜，所以抗体在使用前的处理 也是有所不同。把猪链球菌2型抗体分别用PBS工作液和纯水透析，以此来确定适于标金 和喷膜的最佳抗体处理方法。结果根据发明人实际试验摸索的条件显示，不同的使用目的有不同的要求用 于喷膜的猪链球菌2型抗体要用PBS工作液透析，使其有一定的离子强度，而利于包被。 用于标金的猪链球菌2型抗体要求不含有盐离子，必须用纯水透析；抗体在使用前一般置 于-20°C保存，很容易形成二聚体而影响标金，特别是抗体浓度较高时，所以在使用抗体前 一般要先 4°C IOOOOrpm 离心 30min。2. 2胶体金标记猪链球菌2型抗体的最佳pH值的测定试验用0. lmol/L的碳酸钾溶液将胶体金溶液的pH值分别调节到6. 0,6. 5,7. 0,7. 5、 8. 0,8. 5,9. 0，各取ImL加入用0. 01mol/L的PBS (pH7. 2)稀释为0. 2mg/ml的兔抗猪链球 菌2型抗体100 μ L，混合均勻，室温反应10分钟，静置2小时，观察溶液颜色变化。然后 12000rpm离心10分钟，去掉上清，加入含1 % BSA的PBS溶解沉淀，以沉淀完全溶解呈均勻 的透明紫红色溶液管的PH值为最佳。试验结果如表2-4所示，pH ( 7. 5各管中溶液颜色呈不同程度的蓝色，pH彡7. 5， 各管中溶液颜色无变化，离心后pH彡8. 0的标记管中沉淀不能完全溶解，pH ^ 8. 5的标记 管中沉淀完全溶解，溶液呈透明酒红色，如表2. 4所示。因此，胶体金标记的最佳pH值为 8. 5。表2. 4猪链球菌2型抗体胶体金最佳pH值的测定 2. 3猪链球菌2型抗体最佳标金量的测定试验(试管观察法)胶体金是一种很不稳定的胶体，特别是调节好pH值后，但是加入适当的蛋白后能 使胶体金稳定。所以必须确定胶体金标记猪链球菌2型抗体的最佳标记量。测量其最佳 标记量必须在最佳PH值和离子浓度情况下进行。将胶体金调至最佳pH。用O.Olmol/L的 PBS (pH7. 2)稀释兔抗猪链球菌2型抗体至0. 2mg/mL。按表2操作。表2试管观察法测定稳定胶体金最小标记量 静置后观察，含抗体量少的管呈现出由红变蓝的聚沉现象，而加入抗体达到或超 过最低稳定量的试管中的溶液则保持红色不变。使红色保持不变的抗体含量最低的试管的 抗体量就是抗体的最适保护量，在此基础上增加20%为稳定胶体金的抗体的最佳标记量。将胶体金调至pH8. 5，用0. 01mol/L的PBS (pH7. 2)稀释兔抗猪链球菌抗体0. 2mg/ mL。按表2加入各种试剂后，观察溶液凝聚状况，如表3结果显示，含抗体量少的管呈现出由 红变蓝的聚沉现象，而加入抗体达到或超过最低稳定量的试管中的溶液则保持红色不变。 因此，猪链球菌2型胶体金探针的最适抗体保护量为22 μ g/mL。表3猪链球菌2型抗体胶体金最佳标记量的测定 2. 4胶体金探针的制备用0. lmol/L的K2CO3调整胶体金pH至8. 5，取Iml置于1. 5mlEP管中，加0. 2mg/ ml的猪链球菌2型抗体110 μ 1，混勻30min后，加10% BSA 100 μ 1，混勻30min后(或4°C 过夜)在 4°C下，12000r/min 离心 30min 后，用 Iml 重悬液(0. 01mol/L Tris_HCl，pH 8.2，
BSA，5%蔗糖)重悬沉淀；再于4°C下12000r/min离心30min后，用500 μ 1重悬液重悬 沉淀4°C下lOOOr/min离心4min，上清即为胶体金探针，4°C保存。
2. 5最佳喷膜浓度和最佳封闭浓度的确定试验用O.Olmol/L的PB(pH7.2)把猪链球菌2型抗体和羊抗兔抗体分别(稀释为 3. 5,2. 5,2. 0,1. 5,1. 0,0. 5mg/mL浓度，而且每个浓度的抗体均含有2. 0 % U. 5 % U. 0 %, 0.75%、0.5%BSA的各一管，用于封闭。取稀释好的猪链球菌2型抗体(T带)和羊抗兔抗 体(C带)，见图1，用隔流喷金划线机在NC膜上划线，把划完线的NC膜置于37°C干燥2h。 用猪链球菌2型的菌悬液和不含猪链球菌2型的空白对照同时检测以确定最佳的抗体包被 浓度和封闭浓度。试验结果显示，随着抗体包被浓度的增加，指示线的色泽也逐渐加深，在到达 2. Omg/ml以上后色泽不再加深，因此确定2. Omg/ml为最佳兔抗猪链球菌2型IgG抗体包被 点样浓度。以空白对照不出现假阳性时的BSA浓度为最佳封闭浓度，因此确定1. 5%为最佳 封闭浓度。2. 6试纸条的组装胶体金测试条由样品垫、胶金垫、NC膜和吸收垫四部分组成。样品垫和胶金垫采用 玻璃纤维，吸收垫采用吸水滤纸。胶金垫上加胶体金探针，37°C干燥2h。NC膜上检测带和指 控带分别包被兔抗猪链球菌2型抗体2. Omg/ml (溶解于lOmmol/L PB, pH 7. 2,1.5% BSA) 及羊抗兔免疫血清0. 5mg/ml (溶解于lOmmol/L PBS, pH 7. 2)。喷好膜后37°C干燥1. 5h。 将吸收垫、样品垫及处理后的胶金垫、NC膜叠加粘到PVC板上，组装成完整的试纸条，然后 切割成4mm/条，干燥避光保存。2. 7检测结果判读取50 μ 1 的待测样品和 50 μ 1 样品处理液(1% Tween-20，IOmmol PBS，pH8. 5)加 到制备好的试纸条样品垫上，15min后观察检测结果。对结果的判定阳性(+):检测带(T) 和质控带(C)均出现红色条带；阴性结果(_)仅质控带(C)出现一条红色条带，在检测带 ⑴无红色条带出现；无效质控带(C)未出现红色条带。如图1所示实施例三猪链球菌2型胶体金测试纸的评价一、材料同实施例一二、方法结果1.猪链球菌2型试纸条的敏感性试验将菌株S. suis 149划线接种于含5%羊血的哥伦比亚琼脂血平皿上，37°C，5% C02培养24h，挑取菌落，转接THB液体培养基中，37°C,5% C02培养6h，4°C 8000r/min离心 lOmin，再以PBS稀释成不同数量级的菌悬液，涂布血平板进行菌落记数。取100 μ 1不同稀 释度的菌液加等体积样品稀释液(1% Tween 20, IOmmol/L PBS, ρΗ8. 0)用于检测。从1. OX 108CFU/ml猪链球菌2型样本10倍系列稀释，不含猪链球菌2型的样品 液为空白对照，检测结果见图3，免疫层析条检测灵敏度为1.0X106CFU/ml。2.猪链球菌2型试纸条的特异性试验取甘油冻存的猪链球菌2型菌种按常规方法复苏，接种于含5%羊血的哥伦比亚 琼脂血平皿上，培养时挑取单个菌落转接Todd-Hewitt broth (THB)培养基，37°C，5 % C02 培养；金色葡萄球菌、单增李斯特菌、甲型副伤寒沙门氏菌、大肠埃希菌、产气荚膜梭菌，用 比浊法制备108CFU/ml菌液，取100 μ 1菌液加等体积样品稀释液用于检测。取不同菌株的新鲜菌悬液(浓度> 108CFU/ml)，用免疫试纸进行检测。应用该法
9检测猪链球菌15个血清型，仅与SS1/2有交叉反应。SS1/2同时含有1型和2型抗原菌株， 因此试纸条不能区分SS2与SS1/2。用该试纸条检测猪链球菌2型国内及国外的流行株与 非流行株以及致病株与非致病株，结果均为阳性，说明该试纸条检测范围广，特异性好。该 免疫试纸与常见的致病菌和链球菌属的15个群均无交叉反应。依据以上的结果显示，该试 纸条具有良好的特异性。3.猪链球菌2型试纸条的稳定性试验将胶体金免疫层析试纸条分别于4°C和室温保存3个月，37°C存放15d后取猪链 球菌2型菌悬液(浓度为108CFU/ml和106CFU/ml)和金黄色葡萄球菌(浓度为109CFU/ml) 进行检测，并与同样的PBS溶液做为样品空白对照。试验结果显示将胶体金免疫层析试纸条分别于4°C和室温保存3个月，37°C存放 15d后取出检测，结果见图4，检测结果未见改变。4.模拟标本检测绞碎的瘦肉50mg和血清100 μ 1，分别加入到Iml含不同浓度猪链球菌2型的样品 稀释液中，混勻，静置IOmin或短暂离心(SOOOrpm离心15s)，取样品进行检测。检测结果表明，对瘦肉和血清模拟标本检测灵敏度结果仍可达到106CFU/ml。空白 样本的检测结果为阴性。血清由于其组分和粘稠度等的原因，在NC膜上的层析速率慢，但 检测检测灵敏度也能达到106CFU/ml。
权利要求
一种检测猪链球菌2型的免疫层析试纸，包括样品垫、胶金垫、NC膜和吸收垫，其特征在于胶金垫上有胶体金探针，该探针标记有猪链球菌2型抗体，NC膜上有检测带和质控带，检测带包被有猪链球菌2型抗体，其中猪链球菌2型抗体为针对猪链球菌2型抗原的多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述检测猪链球菌2型的免疫层析试纸，其中猪链球菌2型抗体为 采用醛化灭活的猪链球菌2型抗原免疫制备的兔抗猪链球菌2型抗体。
3.根据权利要求2所述检测猪链球菌2型的免疫层析试纸，其中兔抗猪链球菌2型抗 体浓度为2. Omg/ml。
4.权利要求1或2所述检测猪链球菌2型的免疫层析试纸的制备方法，包括如下步骤(1)制备猪链球菌2型抗体；(2)胶体金及标记有猪链球菌2型抗体的胶体金探针的制备；(3)将猪链球菌2型抗体和抗猪链球菌2型多抗抗体喷于NC膜上进行包被；(4)将吸收垫、样品垫及处理后的胶金垫和NC膜叠加粘到PVC板上，组装成完整的试纸。
5.根据权利要求4所述方法，其中制备猪链球菌2型抗体采用直接用醛化灭活的猪链 球菌2型抗原免疫动物进行，获得的抗体为多克隆抗体。
6.根据权利要求4或5所述方法，其中制备猪链球菌2型抗原采用甲醛灭活，猪链球 菌2型抗体及抗猪链球菌2型抗抗体分别为兔抗猪链球菌2型抗体和羊抗兔免疫血清，二 者浓度分别为2. Omg/ml和0. 5mg/ml。
7.根据权利要求4或5所述方法，其中样品垫和胶金垫采用玻璃纤维，吸收垫采用吸水 滤纸ο
8.权利要求1或2所述免疫层析试纸在检测猪链球菌2型中的用途。
9.根据权利要求7所述用途，检测猪链球菌2型灵敏度达到106CFU/ml。
全文摘要
本发明公开了一种检测猪链球菌2型的试纸，还公开了该试纸的制备方法和用途。本发明的检测试纸包括样品垫、胶金垫、NC膜和吸收垫四部分，采用胶体金免疫层析技术制备。本发明的检测试纸的制备包括制备猪链球菌2型多克隆抗体、制备胶体金、制备胶体金探针、喷膜和试纸条组装等步骤。采用本发明的检测猪链球菌2型的试纸进行检测，10分钟即可观察结果，最低可检出106CFU/ml猪链球菌2型菌。该胶体金试纸具有很强的特异性，仅与2型和1/2型猪链球菌反应，而与其它血清型猪链球菌和其它族的链球菌无交叉反应。该试纸具简便和快速等特点，可以作为一种人猪链球菌2型初筛的诊断方法，适于在临床和现场使用。
文档编号G01N33/532GK101900729SQ20091013349
公开日2010年12月1日 申请日期2009年5月29日 优先权日2009年5月29日
发明者杨圣佐 申请人:杨圣佐