专利名称：：猪链球菌耐药抑制剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种耐药抑制剂，尤其涉及连翘提取物的新用途，本发明还涉及由连翘提取物和阿莫西林组成的复方药物以及它们在抑制猪链球菌耐药林中的用途，属于猪链球菌的防制领域。
背景技术：
：猪链球菌(Str印tococcus.suis)属条件致病菌，在健康动物鼻腔、扁桃体、上呼吸道和支气管均有本菌存在，一定条件下，可引起脑膜炎、关节炎、心内膜炎以及败血症等多种疾病类型，严重者可使动物突然死亡。猪链球菌病是多年来一直困扰养猪业发展的重要传染病之一。根据荚膜多糖抗原的差异，可将猪链球菌分为35个血清型，即1-34以及1/2型，而2型猪链球菌是近年来引起兽医工作者关注的人畜共患病病原。我国于1990年在广东省首次发现类似此血清型的链球菌存在。1998、1999、2005年先后3次从暴发急性败血症死亡的猪中分离到此菌。由于该菌在自然界分布广泛，抗原结构复杂，血清型众多，所以用疫苗控制该病效果不理想，现在临床上普遍应用大环内酯类、四环素类和氟喹诺酮类等药物进行预防和治疗。随着大环内酯类、四环素类和氟全诺酮类等药物的广泛应用，猪链球菌对其耐药性也逐渐增多。丹麦Danish兽医实验室从1995-1996年间共分离猪链球菌265林，其中9.7%血清2型菌沖朱对林可霉素耐药，12.9%对螺旋霉素耐药，56.8°/。血清型对林可霉素及螺旋霉素产生耐药性。1967-1981年Aarestr叩等在丹麦分离的2型猪链球菌对大环内酯类药物均敏感，而从1992-1997年分离的菌林，20.4%的菌林对大环内酯类药物产生了耐药性，据分析这与在过去15年中养猪业中大量应用泰乐菌素有关。2004年王丽平等采用琼脂两倍稀释法和改良的双纸片法，测定出兽医临床分离的40林猪链球菌对部分大环内酯类抗生素、克林霉素、林可霉素、青霉素的体外最小抑菌浓度及红霉素耐药菌的耐药表型。实验结果显示，猪链球菌对红霉素、罗红霉素、泰乐菌素及替米考星的耐药率分别达72.5%、67.5%、72.5%和62.5%,对林可霉素和克林霉素的耐药率高达65.0%和62.5%,对青霉素耐药率为40.0%,青霉素耐药菌林对其他药物的交叉耐药率显著地高于青霉素敏感林。BinChang等分析1996-2006年间的七例猪链球菌的耐药性状况，发现所有菌抹对环丙沙星都敏感。2001年在波兰分离到的链球菌对环丙沙星、奈啶酸、恩诺沙星的敏感率均为100°/。，对培氟沙星和恩诺沙星的敏感率分别为75.0%和83.3°/。。2005年从西班牙分离到151抹猪链球菌，其中98.0°/的菌林都对恩诺沙星敏感。Jose等分析了2003-2006年分离到的992林猪链球菌中对壹诺酮类药物的耐药性，发现1.2°/。的菌抹对此类药物耐药。2006年从欧洲各国分离到的384林猪链球菌对恩诺沙星的敏感率为100°/。。我国2001-2003年间在河南六个地区分离到的50林猪链球菌中，对环丙沙星敏感率为95.0%,对恩诺沙星敏感率为50.0°/。。M03年从浙江省一猪场分离到的71抹猪链球菌中对环丙沙星耐药率为28.0%，对恩诺沙星耐药率为31.0%。2003-2004年间/人河南分离的22才朱猪l连球菌，43.0%对环丙沙星耐药，50.0%对氧氟沙星耐药。2004年在长春分离的猪链球菌对环丙沙星的耐药率为82.0%,2004到2005年在广西分离到的32抹猪链球菌对环丙沙星的耐药率为49.0%,对恩诺沙星的耐药率为57.0%。王丽平等分析全国不同地区的猪链球菌对喹诺酮类药物的耐药性状况时，发现氧氟沙星对猪源链球菌呈现较好的抗菌活性，其敏感率达63.11%,其次为环丙沙星，敏感率为53.18%,而恩诺沙星、培氟沙星和诺氟沙星的效果较差，敏感率分别为41.15%、21.15%和34.14%。2006年在湖南分离到的13抹猪链球菌中对环丙沙星的壽文感率为30.8%,对左氧氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星的^:感率均为38.4%。同年从浙江一屠宰场分离到的义乌、萧山和河南各地的38抹猪链球菌中对环丙沙星和氧氟沙星的敏感率为15.7%,对恩诺沙星的敏感率为10.5%,对诺氟沙星的敏感率为31.6%。本课题从2005-2006年在东北地区共分离到114抹猪链球菌，经过药敏试验检测，其中对环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星的敏感率分别为40.0%、34.0%、39.0%,敏感菌抹大多集中在辽宁省鞍山、台安等地。国内外调查表明，猪链球菌对四环素类药物表现出极高的耐药性，耐药率达95.oy。以上。在药物选择性的压力下，耐药菌株不断出现，耐药现状不断恶化，影响了抗菌药物的有效应用。为此，世界各国科研工作者均在考虑如何解决细菌耐药性的问题，试图遏制猪链球菌不断耐药的趋势。而中草药具有来源广泛，价格便宜，毒副作用小、不易产生耐药性的优点，用于畜禽疾病的防治。
发明内容本发明的目的之一是将连翘提取物应用于抑制猪链球菌耐药抹；本发明的目的之二是提供一种用于抑制猪链球菌耐药抹的复方药物；本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的本发明首先选取桂枝、紫苏、荆芥、防风、羌活、白芷、薄荷、牛蒡子、桑叶、菊花、柴胡、升麻、知母、芦根、栀子、决明子、黄芩、连翘、黄柏、龙胆草、苦参、白鲜皮、双花、中药1、蒲公英、穿心莲、大青叶、板蓝根、贯众、鱼腥草、山豆根、玄参、牡丹皮、紫草、大黄、茵陈、小蓟、地榆、白茅根、艾叶、川芎、桔梗、百部、紫苑、五味子、乌梅、诃子、石榴皮、五倍子、吴茱萸等50味中药的水提物和乙醇提取物，采用纸片扩散法和微量稀释法，分别测定了上述50味中药的7K提物和乙醇提取物对5抹猪链球菌临床分离耐药林的体外抗菌活性。实验结果表明，50种中药中，连翘提取物对猪链球菌临床分离耐药林有较好的抑制作用，其余49种中药的提取物对猪链球菌临床分离耐药抹均无抑制作用。所述的连翘提取物可以是水提取物或乙醇提取物，其中，所述的乙醇提取物可以是10-95%乙醇提取物，优选为75%乙醇提取物。本发明进一步连翘提取物中的活性成分连翘酯苷、连翘苷和卢丁分别分离出来，并分别测定了这些活性成分对猪链球菌的抑菌活性，实验结果表明，连翘酯苷为连翘提取物中的抑制猪链球菌的主要活性成分。本发明将连翘提取物分别与P-内酰胺类药物中的头孢噻肟钠、头孢瘙呋钠、阿莫西林、青霉素钾、头孢拉定、氨节西林钠、头孢唑啉钠和头孢曲松钠联合使用，分别测定了它们的体外或体外的抑制猪链球菌的活性；试验结果表明，连翘提取物和阿莫西林联合使用时，对于猪链球菌的抑制活性呈显著的协同增效功效。其中，为了达到更好的抑菌功效，优选的，将连翘提取物和阿莫西林按照4:1的重量比例进行配伍；所述的连翘提取物可以是水提取物或乙醇提取物，其中，所述的乙醇提取物可以是10-95%乙醇提取物，优选为75%乙醇提取物。具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例5一、材料与方法1.1材料1.1.1菌林与病料质控菌抹金黄色葡萄球菌ATCC29213购于中国兽药监察所。病料系2006~2007年分别从东北三省各猪场通过灭菌棉拭子采集的猪鼻腔分泌物。编号为l-2、15、36b、36c、SS2。根据实验室药敏结果，均为耐药才朱，其耐药谱见表l。表l5株猪链球菌临床分离耐药株对9种抗菌药物的耐药情况<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注R耐药1.1.2试剂及4义器脑心浸液培养基、琼脂、生理盐水、温箱、电子天平、震荡培养箱、冰箱、电炉子、旋转蒸发仪、涂布棒、移液枪、Tip头、酒精灯、试管、平皿。1.1.3药物桂枝、紫苏、荆芥、防风、羌活、白芷、薄荷、牛蒡子、桑叶、菊花、柴胡、升麻、知母、,根、栀子、决明子、黄芩、连翘、黄柏、龙胆草、苦参、白鲜皮、双花、中药l、蒲公英、穿心莲、大青叶、板蓝根、贯众、鱼腥草、山豆根、玄参、牡丹皮、紫草、大黄、茵陈、小蓟、地榆、白茅根、艾叶、川芎、桔梗、百部、紫苑、五味子、乌梅、诃子、石榴皮、五倍子、吴茱萸。购自哈尔滨世一堂。1.2方法1.2.1中药水提取物的制备精密称取每味中药各15.OOg,加8倍量蒸馏水煎制沸腾，改为文火煎lh,期间始终保持8倍量水，用4层绢布过滤后取药液；滤渣再加6倍量蒸馏水按上述方法进行操作后过滤，合并两次过滤药液，用文火浓缩至15ml，使其浓度为lg/ml。1.2.2中药75%乙醇提^4勿的制备精密称取每味中药各15.OOg,力口10倍量75%乙醇，超声30min，用4层绢布过滤后取药液；滤渣再加8倍量75°/。乙醇，超声15min,过滤，合并两次过滤药液，用旋转蒸发仪(50°C)回收醇，将剩余液体用水浴锅(6(TC)蒸发水份，残渣用曱醇溶解，再用蒸馏水调节使其浓度为lg/ml。1.2.3抗耐药菌中药的筛选1.2.3.1纸片扩散法药敏片的制备选用新华滤纸l号，用打孔器制成6.OO腿的小圓纸片，高压灭菌后放入药液中浸泡l2h,真空干燥，装入灭菌青霉素瓶中，4'C水箱备用。菌液的制备取临床分离耐药抹冻存菌抹接种至脑心浸液琼脂平板，37'C孵育过夜。取单个菌落接种于脑心浸液培养基中，37。C过夜培养。比浊法将菌液浓度先调整为O.5麦氏管悬液(1.5xl08cfu/ml),然后用脑心浸液培养基稀释为约5x105cfu/ml。取l.5xl()5cfu/ml菌液100ijL接种于脑心浸液琼脂平板上，用涂布棒均匀涂开。将含有不同药物的药敏片贴于平板上。于37。C培养48后，取出观察，测量抑菌圈直径。1.2.3.2体外最小抑菌浓度(MIC)测定选择对猪链球菌临床分离耐药株的抑菌圈直径>10mm的中药水提取物，采用试管二倍稀释法(黄青云.畜牧微生物学[M].中国农业出版社)测定其对猪链球菌临床分离耐药抹的MIC。先将中药水提取物用蒸馏7jc做1:IO倍稀释，菌液的制备同纸片扩散法，分别取11支灭菌试管，加入调制好的被测菌种悬液各2mL,在第1管加入2mL浓度为0.lg/mL的药液，按照倍比稀释的方法使l10管药物依次成1:2,1:4,…1:1024浓度梯度，第11管作无药生长对照，于37。C培养16-18h观察结果，以无菌生长的最低稀释度为MIC。再将对猪链球菌临床分离耐药抹的抑菌圈直径>1Omm的中药乙醇提取物以同法测定MIC值。由于国内尚无统一的中药抑菌效果的MIC标准，参考刘忠仪的文章(刘忠仪，张国威，何云志.解脲支原体中药药敏试验[J].中华皮肤科杂志，1996,29(5):349.),MIC<7.82mg/ml,为高度敏感，介于7.82mg/ml~250mg/ml,为中度敏感，>250mg/ml,为不敏感。1.2.4复方药物配方的确定1.2.4.1体外复方药物配方的确定连翘提取物分别与(3-内酰胺类药物中头孢塞將钠、头孢塞呋钠、阿莫西林、青霉素钾、头孢拉定、氨千西林钠、头孢唑啉钠和头孢曲松钠对17抹猪链球菌(分别为1—2、卜17、59a、B9、T9、15、1—4、D6、42a、C2、36b、2—22、49a、36c、1-13、64a、D9)进行琼脂扩散试验(剂量比暂定为4:1)，具体方法见1.2.3.1纸片扩散法。1.2.4.2体内复方药物配方的确定利用15号猪链球菌在昆明鼠体内进行病理模型的复制，其对昆明鼠的LD50为9.61x108cfu/Ml。将连翘提取物分别与头孢噻肟钠、头孢噻呋钠、阿莫西林、青霉素钾、头孢拉定、氨千西林钠、头孢唑啉钠和头孢曲松钠(剂量比暂定为4:1)制成复合物。当每只小鼠腹腔注射菌液9.61xI08cfu/Ml0.5mL，灌药7天，每天三次，观察2周，记录小鼠的死亡情况。1.2.5连翘中抗猪链球菌耐药菌成分的确定1.2.5.l药材提取液的制备将连翘粉碎，过20目筛，称取500g,放入圆底烧瓶，按液料比8:1加入75°/。的乙醇水溶液回流提取两小时，提取温度6(TC。提取液趁热抽滤，滤去药渣，滤液收集好静置。同法连续回流4次，滤液合并在一起。将静置的滤液浓缩至浓缩液无醇味，加入适量蒸馏水溶解，并转移至离心管中，用离心才几离心，收集上清液。将上清液通过D101大孔吸附树脂，用不同浓度的乙醇梯度洗脱，再把洗脱液分别经硅胶柱色谱，然后用氯仿-甲醇梯度洗脱，经反复硅胶柱色谱，并对洗脱液用薄层层析跟踪检测，最后通过连翘酯香、连翘香标准品作为对照，确定其成分并收集洗脱液。将收集洗脱液，旋转蒸发减压浓缩，将分别得到的样品进行薄色色谱。以苯丙酮乙酸乙酉旨曱酸水=20:25:30:3:3作展开剂为最佳展开条件，5%香草醛浓硫酸作为显色剂进行薄层层析。1.2.5.2连翘中抗猪链球菌耐药菌成分的确定将得到的连翘酯苷、连翘苷分别进行对上述17抹猪链球菌耐药菌进行纸片扩散试验，具体实验方法见1.2.3.1纸片扩散法。二、实验结果与讨论(一)抗耐药菌中药的筛选选取桂枝、紫苏、荆芥、防风、羌活、白芷、薄荷、牛蒡子、桑叶、菊花、柴胡、升麻、知母、,根、栀子、决明子、黄芩、连翘、黄柏、龙胆草、苦参、白鲜皮、双花、中药1、蒲公英、穿心莲、大青叶、板蓝根、贯众、鱼腥草、山豆根、玄参、牡丹皮、紫草、大黄、茵陈、小蓟、地榆、白茅根、艾叶、川芎、桔梗、百部、紫苑、五味子、乌梅、诃子、石榴皮、五倍子、吴茱萸50味中药的水提物和75%乙醇提取物对5林猪链球菌临床分离耐药林的体外抗菌活性。对猪链球菌临床分离耐药抹分别进行纸片扩散法和微量稀释法，目的是通过对抗菌效果的比较，篩选出对耐药菌抗菌活性好的中草药。50种中药中，连翘提取物对猪链球菌临床分离耐药林有较好的抑制作用，其余49种中药的提取物对猪链球菌临床分离耐药抹均无抑制作用，抑菌圏直径为0。连翘水提取物和75°/。乙醇提取物对猪链球菌临床分离耐药抹的抑菌圈直径见表2。表2中药水提取物和75%乙醇提取物对10株猪链球菌临床分离耐药株的抑菌圈直径样液1-21536b36cSS21-1759aB9T915平均值连翘1418202211161517191616.8水提取物连翘1520222213181718201918.475%乙醇提取物其余的0000000000049种中药水提取物其余的0000000000049种中药75%乙醇提取物由表2可以看出，连翘提取物对10抹猪链球菌临床分离耐药抹的抑菌圈直径>10mm,连翘水提取物对10抹猪链球菌临床分离耐药抹的平均抑菌圈直径为16.8mm,连翘75°/。乙醇提取物的平均抑菌圈直径为18.4mm;采用微量稀释法分别测定连翘对1O林猪链球菌临床分离耐药抹的MIC。由表3可以看出，连翘不同提取物对10抹猪链球菌临床分离耐药抹的MIC〈7.82mg/ml，但75%乙醇提取物对猪链球菌临床分离耐药林的MIC都较相应水提取物的MIC小，为2.3872mg/ml;综合以上结果，可以看出，连翘水提取物或乙醇提取物对于猪链球菌有显著的抑制活性。表3连翘水提取物和75y。乙醇提取物对5株猪链球菌临床分离耐药株的MICCmg/ml)9样液1-21536b36cSS21-1759aB9T915平均值连翘水6.2503.1253.1253.1253.1253.1253.1253.1253.1253.1253.4375提取物连翘5.1253.1251.5621.5623.1251.5621.5621.5621.5623.1252.387275%乙醇提取物(二)抑制猪链球菌的复方药物的筛选1、连翘提取物与(3-内酰胺类药物体外抗菌试验选取连翘提取物分别与P-内酰胺类药物中头孢漆肟钠、头孢漆呋钠、阿莫西林、青霉素钾、头孢拉定、氨卡西林钠、头孢唑啉钠和头孢曲松钠对17林猪链球菌进行琼脂扩散试验(剂量比暂定为4:1),结果表明连翘提取物分别与头孢噻肟钠、头孢噻呋钠、阿莫西林、青霉素钾、头孢拉定、氨千西林钠、头孢哇啉钠和头孢曲松钠对174朱猪链球菌抑菌圈直径平均值分别为0mm、22mm、29mm、17咖、16mm、15mm、21mm、18mm。只有阿莫西林和连翘提取物共同使用时，抑菌圈直径最大并且差异显著。2、连翘提取物与|3-内酰胺类药物体内抗菌试验利用15号菌在昆明鼠体内进行病理模型的复制，其对昆明鼠的LD50为9.61xl08cfu/Ml。将连翘提取物分别与头孢p塞將钠、头孢瘗呔钠、阿莫西林、青霉素钾、头孢拉定、氨千西林钠、头孢唑啉钠和头孢曲松钠(剂量比暂定为4:1)制成复合物。当每只小鼠腹腔注射菌液9.61x108cfu/Ml0.5mL，灌药7天，每天三次，观察2周，记录小鼠的死亡情况。实验结果见表4:表4连翘提取物与P-内酰胺类药物的药效学比较实验药物存活数存活率平均死亡时间(h)阳性对照510%(5/10)阴性对照10100%(10/10)连翘70%(7/10)12头孢噻JB钠060%(7/10)9头孢噻呋钠670%(7/10)20阿莫西林70%(6/10)24青霉素钾460%(7/10)18头孢拉定550%(7/10)18氨苄西林钠650%(7/10)20头孢唑啉钠650%(7/10)20头孢噻躬钠-连翘复方药物060%(7/10)18头孢噻呋钠-连翘复方药物770%(7/10)24阿莫西林-连翘复方药物8100%(8/10)36青霉素钾-连翘复方药物560%(7/10)24头孢拉定-连翘复方药物550%(7/10)24氨苄西林钠-连翘复方药物660%(7/10)24头孢唑啉钠-连翘复方药物660%(7/10)24综合上述2个实验，相比于单独的抑菌活性，从体内外实验结果可以看出将连翘提取物和阿莫西林配伍在一起使用时具有显著的协同抑制猪链球菌的功效。(三)连翘中抗耐药菌成分的确定将中药连翘药材上清液通过D101大孔吸附树脂，用不同浓度的乙醇梯度洗脱,再把洗脱液分别经硅胶柱色谱，然后用氯仿-甲醇梯度洗脱，经反复硅胶柱色谱，并对洗脱液用薄层层析跟踪^:测，最后通过样品对照，确定其成分并收集洗脱液。将收集洗脱液，旋转蒸发减压浓缩，最后分别得到连翘酯苷、连翘苷、卢丁。将得到的连翘酯苷、连翘苷、卢丁分别进行对上述17抹猪链球菌耐药菌进行琼脂扩散试验，分别进行连翘酯苷、连翘苷、卢丁对上述17林猪链球菌耐药菌抑菌圏的直径平均为20mra士2.74、0mm、0mm。连翘酯苷对17抹猪链球菌耐药抹的MIC值平均值为3.125mg/ml。所以得出连翘中抗猪链球菌耐药株的主要成分是连翘酯苷，而连翘武无抗菌活性，因此把测定连翘戒的含量作为考察指标无意义，在建立连翘原料药及制剂的质量标准时应选择具有抗菌活性的成分连翘酯戒作为考察的指标。权利要求1、连翘提取物在制备抑制猪链球菌药物中的用途。2、按照权利要求1所述的用途，其特征在于所述连翘提取物的有效部位是连翘酯苷；其中，所述连翘提取物是连翘水提取物或连翘乙醇提取物。3、按照权利要求2所述的用途，其特征在于所述的连翘乙醇提取物是10-95%乙醇提取物。4、按照权利要求3所述的用途，其特征在于所述的连翘乙醇提取物为75%乙醇提取物。5、一种抑制猪链球菌的复方药物，其特征在于包括连翘提取物和阿莫西林组成。6、按照权利要求5所述的复方药物，其特征在于由连翘提取物和阿莫西林按照4:1的重量比例组成。7、按照权利要求5或6所述的复方药物，其特征在于所述连翘提取物的有效部位是连翘酯苷；其中，连翘提取物是连翘7K提取物或连翘乙醇提取物。8、按照权利要求7所述的复方药物，其特征在于所述连翘乙醇提取物是10-95%乙醇4是取物。9、按照权利要求8所述的复方药物，其特征在于所述连翘乙醇提取物是75°/。乙醇提取物。10、一种预防或治疗由猪链球菌所导致疾病的药物组合物，其特征在于由有效量的权利要求5所述的复方药物和药学上可接受的赋料或载体所组成。全文摘要本发明公开了一种猪链球菌耐药抑制剂，属于猪链球菌的防制领域。本发明分别测定了50种中药提取物对猪链球菌的体外和体内的抑制活性，最终发现，连翘提取物对于猪链球菌耐药株无论是体外还是体内均有显著的抑制作用，可作为猪链球菌耐药抑制剂使用。在此基础上，本发明又发现，将连翘提取物与阿莫西林联合使用时，该复方药物有显著的协同抑制猪链球菌的功效，可与猪链球菌耐药抑制剂共同应用。文档编号A61K36/634GK101612204SQ20091015991公开日2009年12月30日申请日期2009年7月21日优先权日2009年7月21日发明者逊刘,琳崔,李明雁,李艳华,王瑞雪,盛尊来,栋边,陈俭清申请人:东北农业大学