专利名称：一种猪链球菌密度感应系统阻断多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种猪链球菌密度感应系统阻断多肽及其应用。
背景技术：
密度感应(quorum sensing, QS)是指微生物群体在其生长过程中，由于群体密度的增加，导致其生理和生化特性的变化，显示出少量菌体或单个菌体所不具备的特征(Fuqua WC, Winans SC, Greenberg EP (1994) Quorum sensing in bacteria: theLuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators. JBacteriol 176: 269-275)。它是细菌彼此之间传递信号的一种特殊机制，利用一种激素 样的化合物作为信号分子(autoinducer, Al)来调节细菌基因的表达(Lerat E, MoranNA (2004) The evolutionary history of quorum-sensing systems in bacteria. MolBiol Evol 21: 903-913)。随着细菌密度的增加，信号分子浓度也随之增加，当信号分子的浓度也达到一定的水平，通过包括受体蛋白在内相关蛋白的信号传递，诱导或抑制信号最终传递到胞内，影响特定基因的表达，调控微生物群体的生理特征，如生物发光、抗生素合成、生物被膜形成等。利用QS机制进行“细胞对细胞的交流”，微生物能够在复杂的环境中协调一致，以“团队作战能力”使整个种群更好地存活下来(Swift S，DownieJA, Whitehead NA, Barnard AM, Salmond GP, et al. (2001) Quorum sensing as apopulation-density-dependent determinant of bacterial physiology. Adv MicrobPhysiol 45: 199-270.)。近年来的研究发现了另一种新型的细菌群体感应机制，即由LuxS蛋白参与合成的AI-2型信号分子介导的种间群体感应。LuxS基因是产生AI-2分子所必需的，在许多革兰氏阴性和阳性菌中都存在高度保守的LuxS类似物。AI-2是唯一的细菌非特异性信号分子，细菌可以利用AI-2感知其它细菌数量来调节自身行为，参与对其他种属细菌的群体感应，从而在同一个生存环境中协调自身基因的表达。由于在革兰氏阴性菌与阳性菌中广泛存在，故被看作细菌种群间的系统。目前细菌与细菌之间的信息交流已成为微生物研究的热点，现已发现细菌的许多生理功能都受LuxS/AI-2系统的调节，包括细菌发光，抗生素的合成，质粒的转移，毒力的变化，基因的表达，生物被膜的形成等。在复杂的调控网络中LuxS所起的作用不仅有正调控还有负调控。由于使用抗生素带来种种弊端，迫切需要找到一种能够替代抗生素的东西来控制致病菌。目前认为通过干扰致病菌的QS系统是一种行之有效的新手段。因此QS已成为农业、医学和环境领域的研究热点之一。由于QS控制细菌许多病基因的表达，因此任何能够阻止QS信号分子集聚或受体识别信号分子的过程都可以阻断依赖细菌QS的毒力基因表达。群体淬灭(Quenching quorum-sensing)是通过干扰微生物细胞间的QS系统,阻止QS依赖型基因表达而防御病原菌感染的一种现象。目前已发现的群体淬灭主要有竞争性抑制和信号分子降解两种方式。由于QS介导的是微生物病原性,干扰QS体系不会对病原菌产生选择压力，因此，这使得对QS猝灭剂和抑制机制的研究具有潜在的意义。猪链球菌(Streptococcus suis, SS)是猪的重要致病菌,可以引起脑膜炎、败血症、心内膜炎、关节炎、肺炎等疾病，也可导致生猪从业人员感染和死亡。猪群带菌率接近100%，而致死率能达到近20%。由猪链球菌引起的猪链球菌病给我国养殖业和生猪从业人员带来了极大的威胁。
发明内容
本发明目的在于提供一种猪链球菌密度感应系统阻断多肽不仅能够抑制猪链球菌，而且能够消除抗生素所带来的种种弊端。本发明采取的技术方案是一种猪链球菌密度感应系统阻断多肽及其应用，所述多肽具有用序列号I表示的氨基酸序列，序列号I表示的序列为TTMHSIRTNRHN。所述阻断多肽体外抑制猪链球菌AI-2分子产生的应用。 所述阻断多肽提高动物体内机体抵抗细菌感染的应用。猪链球菌密度感应系统阻断蛋白的表达将质粒P⑶NA3. I用HindiΙΙ/XhoI双酶切后与寡聚核苷酸 P (5-AGCTT ACCACCATGCACCCAATCCGCACCGACCGCCACGACC-3)用 T4DNA 连接酶连接，将连接产物转化入大肠杆菌DH5a中，得到携带有序列号I中氨基酸序列质粒的工程菌。本发明具有以下优点
I.本发明的阻断因子能够与密度感应系统中的LuxS作用，并特异性干扰LuxS/AI-2密度感应系统，在体外能抑制信号分子AI-2的产生，起到显著降低猪链球菌感染实验动物的作用。2.本发明的阻断因子是一种蛋白质，有两种获得该蛋白的途径，可以人工合成，也可以通过原核表达高效获得。3.本发明的阻断因子是一种分泌性小肽，可以对多种细菌中的密度感应系统做出干扰，因而其作用范围广泛。
具体实施例方式下面对本发明的实施例做详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。载体P⑶NA3.1 ( + )购自invitrogen公司；限制性内切酶、连接酶等试剂购自TAKARA公司；S腺苷同型半胱氨酸(SAM)购自sigma公司。质粒提取、DAN纯化、DNA回收试剂盒购自天根生物科技有限公司。实施例I
一种猪链球菌密度感应系统阻断多肽，其氨基酸序列为TTMHSIRTNRHN。猪链球菌密度感应系统阻断多肽的构建方法表达猪链球菌密度感应系统阻断多肽的质粒P⑶NA-P构建将质粒P⑶NA3. I用Hindlll/Xhol双酶切后与寡聚核苷酸P(5-AGCTT ACCACCATGCACCCAATCCGCACCGACCGCCACGACC-3)用 T4DNA 连接酶室温连接 2-4 小时，将连接产物转化入大肠杆菌DH5a中，并涂布于含有氨苄青霉素(100 μ g/ml)的LB固体培养基上培养30小时，挑取转化子，提取质粒，即为质粒pCDNA-P，具有序列号I中氨基酸序列。实施例2
多肽抑制猪链球菌信号分子AI-2实验。SRH的制备将I mg/mL纯化的Pfs重组蛋白与I mM SAM在10 mM磷酸钠(sodiumphosphate buffer, pH 7. 5)缓冲液中，37° C 作用 I 小时,反应液用 Millpore (10，000 Dacutoff)的超滤膜，进行超滤，去除反应液中的蛋白。滤液即为SRH，滤液冻存于-80° C。将人工合成的多肽溶于IOmM磷酸钠缓冲液中，同时加入纯化的重组蛋白LuxS，37°C 作用 I 小时，加入 ImM SRH, 37°C 作用 I 小时，反应液用 Millpore (IOOOOODa cutoff)的超滤膜，进行超滤，去除反应液中的蛋白。取适量滤液用IOOmM磷酸钠，O. ImM EDTA，pH 7. 2缓冲液作20倍稀释。取200ul上述稀释液，加入IOOul的5mM Ellman’ s试剂(DTNB，溶于IOOmM磷酸钠，O. ImM EDTA, pH 7. 2缓冲液)，37° C作用15min，在412nm的波长下测光吸收值。表I多肽抑制性实验
权利要求
1.一种猪链球菌密度感应系统阻断多肽，其特征在于所述多肽具有用序列号I表示的氣基酸序列，序列号I表不的序列为TTMHSIRTNRHN。
2.根据权利要求I所述的一种猪链球菌密度感应系统阻断多肽的应用，其特征在于所述阻断多肽用于在体外抑制猪链球菌AI-2分子的产生。
3.根据权利要求I所述的一种猪链球菌密度感应系统阻断多肽的应用，其特征在于所述阻断多肽用于提高动物体内机体抵抗细菌感染。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种猪链球菌密度感应系统阻断多肽及其应用。该多肽的氨基酸序列如序列号1所示，本发明的多肽能够与密度感应系统中的LuxS作用，并特异性干扰LuxS/AI-2密度感应系统，在体外能抑制信号分子AI-2的产生，起到显著降低猪链球菌感染动物的作用。本发明的阻断因子是一种蛋白质，有两种获得该蛋白的途径，可以人工合成，也可以通过原核表达获得。此外，本发明的阻断因子是一种分泌性小肽，可以对多种细菌中的密度感应系统做出干扰，作用范围广泛。
文档编号A61K38/10GK102942617SQ20121046132
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月16日 优先权日2012年11月16日
发明者汪洋, 易力, 张才, 王臣, 李宏伟, 陆承平, 刘一尘, 李小康, 余祖华, 程相朝 申请人:河南科技大学