专利名称：：编码猪链球菌毒性特征的dna序列及衍生的多肽的抗体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及人和兽预防医学领域，特别是涉及由猪链球菌(Streptococcussuis)之致病性菌株引起感染的诊断和预防领域。自1983年来，小猪在差不多断奶时感染猪链球菌血清2型已在荷兰成为一个越来越严重的问题。疾病的特征是出现脑膜炎、关节炎、脓毒血症以致死亡(Clifton-Hadley，1983，ref.6;Vechtetal.，1985，ref.44;Windson1977，ref，50)。据估计，5-10%的饲养场有这样的问题。估计死亡率为2.5%，在受影响的饲养场中平均发病率为2-5%。现有治疗和预防措施的作用很有限。因此所造成经济损失是很大的。该病是一种动物传染病。人也是该病的感染对象，有导致脓毒血症和脑膜炎危险并可能造成持久性后遗症;已报导了一例死亡病例(ArendsandZanen1988，ref，2)。人类病例与皮肤受伤进而与被感染猪肉接触有关。特别是猪饲养场和屠宰场工作人员即属于危险人群。有证据表明，自1983年以来，荷兰猪饲养场中该发病率升高是由于进口厂携带2型猪链球菌的种畜。带菌动物常常是在扁桃体内隐藏有链球菌的健康成年猪。感染通过这些带菌猪传染给敏感动物，特别是处在断奶期的小猪。对已患病或死亡动物的诊断是基于从临床标本和器官材料中分离并检出2型猪链球菌。确定带菌者是基于使用选择培养基对咽拭子或扁桃体活检组织作细菌学检查(VanLeengoedetal.，-1987，ref.27)。在诊断学试验的基础上确定带菌个体，进而有可能建立控制方案。然而为检查带菌个体须处理大量样品，故消费许多时间;而且由于污染菌的过度生长而出现假阴性结果。最后，对实验数据的整理分析需要有大量的实践经验。再者，诊断和在诊断的基础上进行的可能的控制将因2型猪链球菌菌种内不同菌株在致病性上的差异而进一步复杂化。如果2型猪链球菌的毒性菌株确实与无毒性菌株有结构上的差异，也许有可能对控制程序内的带菌个体进行结构试验，但目前的诊断技术还不能作出这种区分。因此，有针对性的控制仍不可能实现。毒性差异本身取决于是否存在毒性因子。早在1984年，Arends和Zanen(ref.1)已描述了感染人体之菌株中的“溶菌酶阳性”蛋白质。在动物实验中发现，“溶菌酶阳性”菌株(D-282)对无菌猪是有致病性的，相反“溶菌酶阴性”菌株(T-15)则对其无致病性(Vechtetal.1989，ref.43)。菌株D-282的“溶菌酶阳性蛋白质”可能与“胞壁质酶释放蛋白质”(MRP)相同。荷兰和其他一些国家的猪养殖业均呈锥体结构，即顶部是小数量的繁殖场，动物从这里提供给饲养场。最终由这些饲养场提供给大量增肥养殖场，再从这里将动物产品送到屠宰场。在诊断的基础上建立的控制战略(确认各场、清除阳性带菌个体、进口要求)应须针对该锥体中高处的场所。疫苗也应能在锥体中的较低场中使用。此外，诊断猪链球菌感染的工具和方法在人类医学中可能是有价值的。本发明的目的是以迄今更为有效方式，提供一种一方面可能用于检验猪链球菌感染，另一方面又可预防这种感染的方法和工具。该目的是通过使用来自编码猪链球菌之毒性特征的基因的DNA序列而实现的。在这里，毒性特征应理解为一个多肽，其存在与生物体-在这种情况下是指猪链球菌，特别是2型猪链球菌-的毒性有关。已发现了两个分别编码定名为MRP(胞壁质酶释放蛋白质)和EF(细胞外因子)，并且似乎与毒性特征有关(即毒性因子)之两种蛋白质的2型猪链球菌毒性菌株的基因。MRP和EP均为高分子量蛋白质。MRP(136KD)是一种与细胞外膜有关并可在胞壁质酶作用下由细胞壁释放的蛋白质。EP(110KD)是一种从细菌体内分泌到生长培养基中的细胞外蛋白质。根据本发明，已基于这些基因和其表达产物建立了能够区分毒性和非毒性菌株的诊断方法。迄今为止，已在由所说的基因表达一种或两种蛋白质的基础上，发现了2型猪链球菌的三个不同的表型即MRP+EF+表型、MRP+EF-表型和MRP-EF-表型。发现从有临床病症的猪器官中分离的菌株中，有77%(n＝111)具有MRP+EF+表型，而从无可疑感染之正常屠宰猪扁桃体中分离的菌株，有86%(n＝42)属于MRP+EF+表型。MRP+EF-表型最常见于有2型猪链球菌感染的病人(74%，n＝27)(参见图21)。为此有可能确定猪链球菌毒性菌株的带菌者并进而开发相应疫苗。使用该疫苗，例如可建立在猪养殖场使用的控制2型猪链球菌感染的方法。因此本发明涉及除编码特异性高分子量多肽外，还编码作为猪链球菌毒性特征之90-120KDa多肽的DNA序列和其等价序列及其部分，该下文中所称的ef基因具有如图1A所示的2型猪链球菌菌株D-282的核苷酸序列。已确定了编码EF之整个区域的核苷酸序列及其侧翼序列。对ef基因之序列(图1A)的分析，提供了编码843个氨基酸之多肽(计算的分子量为(90，014)的2529核苷酸开放读码(openreadingframe)。产生了抗110KDaEF的单克隆抗体，此抗体可识别所有38个有MRP+EF-表型之菌株的培养物上清液中的高分子量蛋白质。这表明110KDaEP和高分子量蛋白质的某些抗原决定基是相同的。发现所有91个带MRP+EF+表型的菌株都不产生这些高分子量蛋白质。同时发现基于编码110KDaEF之基因的DNA探针可与编码MRP+EF-菌株之高分子量蛋白质的基因杂交。这表明110KDaEF和高分子量蛋白质相关，提示来自带MRP+EF-表型之菌株的ef基因的至少一部分与来自MRP+EF+表型菌株的ef基因相同。这里将蛋白质EF的较高分子量对应物称为EF＊，并将其编码基因称为ef＊基因。相应的核苷酸和氨基酸序列示于图1B中。本发明涉及编码135-136KDa多肽之基因的DNA序列，其等价序列和其部分，所说的多肽也是猪链球菌的毒性特征，其基因-下文中称为mrp基因-具有猪链球菌血清2型菌株D-282的如图2所示的核苷酸序列。已确定了编码MRP之完整区域的核苷酸序列及其侧翼序列。对mrp基因序列(图2)的分析显示了编码1256氨基酸多肽(计算的分子量为135，794)的3768核苷酸开放读码。本文中，等价序列应理解为基本上与所示序列相同但可能表现出少许差异的序列，如由定点突变或经取代、缺失、插入或加入等修饰作用造成的差异;同样，等价序列也理解为不管核苷酸序列有什么差异，但仍能与所示序列或其互补物杂交的序列，以及由之产生的序列，即是说尽管核苷酸有差异但仍能编码同一氨基酸序列。本发明还涉及在调节序列存在下，含有上述ef基因和/或mrp基因序列的重组多核苷酸。这种类型的重组体，正如病毒载体、质粒或细菌一样，可用于在理想环境中表达该基因或其相关部分，例如产生用于诊断毒性猪链球菌感染或用于控制毒性菌株感染的免疫原性肽。含有衍生于编码猪链球菌毒性特征之基因的上述序列的多核苷酸探针也构成本发明的一部分。这种类型的探针具体是与上述的一个或两个基因的核苷酸序列相对应的。适用的探针一般至少有10个核苷酸长。可用探针直接检测猪链球菌毒性菌株序列的存在。作为诊断方法和预防方法的一部分，也可用探针作为扩增多肽(如在聚合酶链反应中)的引物。发现适当的多肽探针是含有来自mrp基因之序列1100-1934的至少10个核苷酸，较好至少15个核苷酸，至多835个或至多532个核苷酸的部分序列。发现另一个适用的多肽探针含有来自ef＊基因之序列2890-3306的10-417个，较好15-360个核苷酸的部分序列。其中每个探针都能有效地区分开猪链球菌的致病性和非致病性菌株。也可将基于mrp的探针和基于ef＊的探针联合使用，作为更有效力的诊断工具。本发明还涉及衍生于上述多肽序列的多肽。该类型的多肽可由所说基因编码，或者是通过表达所说的序列得到的，并且基本上相当于猪链球菌毒性特征性蛋白质或其部分。例如，该类型的多肽可在免疫学试验中用作抗原，在免疫动物时用作免疫原，或在生产用于诊断目的的抗体时用作免疫原。以这种方式产生的抗体也构成本发明的一部分。这种类型的抗体可以是单克隆或多克隆的，并且可提供标志物(酶、放射性核素、发光物质或复合物形成剂);抗体也可与固相载体结合。本发明还涉及检验猪链球菌致病菌株感染的方法，其中使用了上述的一个或多个多核苷酸探针、多肽和/或抗体。“感染”在本文中是指有疾病症状(狭意感染)和无疫病症状(广意感染，或污染)的情况下存在病原生物体。在进行免疫检验时，如检测样品或临床材料中猪链球菌抗原和/或抗体的存在时，例如可在微量滴定板上使用已由ef/ef＊基因或其部分衍生的多肽(110KDa)，和/或已产生的抗该多肽的抗体。另外，也可使用衍生于mrp基因或其部分的多肽(136KDa)。可使用已知的程序完成诊断方法。如酶联免疫吸附法(ELISA)和双抗体夹心(DAS)-ELISA法。可借助诊断试剂盒实践上述方法。本发明的诊断试剂盒分别含有至少一种相当于或衍生于ef/ef＊基因或mrp基因之序列或其部分的多核苷酸或多肽，或者含有已产生之抗衍生于所说ef/ef＊和mrp序列之一的多肽的抗体。其中也可联合使用探针及其他诊断剂，特别是ef＊诊断剂和mrp诊断剂，或者联合使用进行PCR的各引物。试剂盒还可含有完成诊断所需的其他组份，如标记物质、染料等试剂，滤纸、平皿等载体，培养基和标定剂以及诊断操作手册。本发明还涉及保护动物免于猪链球菌感染的方法，该方法中使用了上述的多核苷酸、多肽或抗体。当使用抗体时，该方法为被动免疫，即直接提供抗病原生物体的抗体;因为衍生于EF、EF＊和MRP的抗体是针对大多数毒性猪链球菌的，所以这种方法对于预防或控制感染为一种有效的方法，特别是在被保护动物本身不能产生足够的抗体时，例如在感染已经发生或感染发生在幼小动物的情况下。对猪的另一种形式的被动免疫是通过母猪的初乳给小猪提供抗体。在这种情况下，是在母猪妊娠期间，即小猪出生前用一种或两种肽对其进行主动免疫。当使用多肽或多核苷酸(也可选择以重组生物体形式的)时，该方法是一种主动免疫法，即借助直接使用的、或以待表达之基因形式使用的免疫原性多肽来刺激被保护动物产生抗体。另一种免疫方法是给动物使用负责中和毒性的活性多肽。这种形式的多肽已不再有致病性，而只保留了免疫原性特征。例如，已借助缺失作用对原始ef/ef＊或mrp基因进行了修饰，然后表达该基因以得到这样的多肽。用于保护动物免于遭受猪链球菌感染的疫苗，即含有上述多核苷酸、多肽或抗体的疫苗也构成本发明的一部分。本发明的特定疫苗是含有并不或并不完全引起相当于EF和MRP之至少一种多肽表达的猪链球菌的疫苗。该材料可来源于一种无毒性或较少毒性的可能的活菌株，或者可由之形成。已在体内借助就特定毒性因子(MRP和EF)来说带有2型猪链球菌的无菌小猪研究了涉及2型猪链球菌之致病性的毒性因子的作用。以血液学、细菌学和(组织)病理学分析技术监测动物实验结果。图1Aef基因的核苷酸序列和相邻序列以及由之衍生的EF氨基酸序列。并标出了推测的核糖体结合位点、推测之启动子的-35和-10区域，以及带互补对称性的区域。信号肽酶的可能裂解位点在核苷酸498-499之间。在图1A中，SEQIDNO1序列类型核苷酸及相应蛋白质序列长度4376碱基对链型单链拓朴学线性分子类型基因组DNA原始来源生物体Ⅱ型猪链球菌(致病性的)性质细胞外蛋白因子(EF)基因特性从bp66到71启动子-35区域从bp89到94启动子-10区域从bp153到158启动子-35区域从bp176到181启动子-10区域从bp350到356核糖体结合位点从bp361到498信号肽从bp499到2890成熟肽从bp4186到4198和bp4203到4215双对称性区域从bp4243到4257和bp4263到4276双对称性区域图1B编码菌株1890的2型猪链球菌ef＊基因之片段的核苷酸序列和推导的1类EF＊蛋白质的氨基酸序列。指出了推测的核糖体结合位点、推断之启动子序列的-35和-10位域、重复区域R1-R11、以及推测的终止信号。在编码110KDaEF蛋白质的基因中没有核苷酸2859和5228之间的区域。在编码Ⅳ类和Ⅴ类EF＊蛋白质的基因中没有核苷酸3423和4456之间的区域。在图1B中，SEQIDNO2序列类型核苷酸及相应蛋白质序列长度6744碱基对序列类型单链拓朴学线性分子类型基因组DNA原始来源生物体Ⅱ型猪链球菌(非致病性的)性质细胞外因子相关蛋白质(EF＊)基因特征从bp66到71启动子-35区域从bp86到94启动子-10区域从bp153到158启动子-35区域从bp176到181启动子-10区域从bp350到356核糖体结合位点从bp361到498信号肽从bp499和5826成熟肽从bp2869、3097、3292、3520、4087、4381、4609、4837、5065、5293、5521重复单位R1-R11的起始点从bp2932、3160、3355、3583、4150、4444、4672、4900、5128、5356、5584重复序列Asn-Pro-Asn-Leu起始点从bp6554到6566和bp6571到6583双对称性区域从bp6611到6625和6631到6644双对称性区域图2.含2型猪链球菌mrp基因炎4.6KbEooRI-HindIII片段的核苷酸序列和由之衍生的MRP氨基酸序列。指出了可能的核糖体结合位点、推测之启动子序列的-35和-10区域、mrp基因后面的互补对称性区域、推测的信号肽的切割位点、富脯氨酸区域、重复氨基酸序列和外膜固着区域。在图2中，SEQIDNO3序列类型核苷酸及相应蛋白质序列长度4118碱基对链型单链拓朴学线性分子类型基因组DNA原始来源生物体Ⅱ型猪链球菌(致病性的)性质胞壁质酶释放蛋白(MRP)基因特征从bp4到9启动子-35区域从bp29到34启动子-10区域从bp40到45启动子-35区域从bp63到68启动子-10区域从bp147到152核糖体结合位点从bp159到299信号肽从bp300到3926成熟肽从bp2757到3014富脯氨酸区域从bp3015到3176、3423到3584及3585到3743重复单位从bp3825到3926膜固着序列从bp4069到4080和bp4087到4098双对称性区域图3亚克隆到质粒载体pKUN19(10)中的、含ef片段的限制性酶切图。方框内是开放读码。限制性位点B-BamHI;Bg-BglII;E-EcoRI;K-KpnI;N-NarI;P-PstI;S-SnaBI;Sa-SalI;Sp-SpeI。图4图解说明编码110KDaEF蛋白质的基因和其侧翼区。110KDaEF蛋白质由开放读码1(ORF1)编码。ORF1的3′端与ORF2的5′端重迭。ORF2和ORF3被TAA终止密码子分开。指出了有意义的限制性酶切位点。图5图解说明5个不同类ef＊基因和ef基因的PstI-SnaBI片段。箭头指示重复的氨基酸单位。横线标示存在可不同菌株中的区域。间隙标示在不同的菌株中缺少的区域。图6靠近Ⅳ和Ⅴ(A)类ef＊基因中及ef基因(B)中缺少之片段的末端的核苷酸序列。最上面和中间的序代表侧接缺少片段之左和右侧端的区域。下面的序列显示见于Ⅳ和Ⅴ类ef＊基因(A)和ef基因(B)中的接合点。直接重复序列示于方框中。黑体核苷酸标示转译三联子的第一个碱基。序号是指Ⅰ类ef＊基因中的核苷酸位置(图1A)。图7推断的MRP阳性重组噬菌体之DNA插入段的限制图。粗线指示存在于所有这些克隆中的DNA区。限制性位点E-EcoRI;H-HindIII;X-XbaI;K-KpnI;S-SacI。DNA插入段的B部分被亚克隆到质粒载体pKUN19(24)中。图8对由重组质粒和重组噬菌体编码之蛋白质(已用抗MRP的单克隆抗体分离出来)的Western印迹分析。泳道1阴性对照;从MRP阴性猪链球菌菌株之细胞壁中提取的蛋白质。泳道2含有从菌株D282之细胞壁中提取之蛋白质的粗MRP制剂。泳道3pMR7-1。泳道4pMR7-2。泳道5pMR9-1。泳道6pMR9-2。泳道7pMR10-1。泳道8pMR10-2。泳道9带控制插入子的λGEM11。泳道10λ克隆7。泳道11λ克隆9。泳道12λ克隆10。泳疲乏13λ克隆11。图9用抗MRP/EF兔K191血清(1∶500稀释的)探查之原生质体上清液(PPS)、培养物上清液(Cult.Sup.)和膜囊泡(Membr)部分的Western印迹。各泳道名称均由编号的菌株命名表示。图10用兔抗MRP/EF血清(K191)、抗MRP血清和抗EF血清(1∶500稀释的)探查的选择之猪链球菌2型菌株细胞培养物上清液的Western印迹。PAb揭示了三个猪链球菌2型表型MRP+EF+、MRP+EF-和MRP-EF-。各泳道命名即相应菌株名称。参考菌株1(D-282)和菌株3至9(MRP+EF+)是从患猪链球菌性脑膜炎和猪体内分离的。参考菌株2(T-15)和菌株10、12、16和17是从健康猪的扁桃体中分离的。菌株22、23、24、25、26、28和29是从病人体内分离的。图11MRP的水亲和性图形。水平线上方和下面的序列分别代表疏水和亲水区域。图12MRP和几种革兰氏阳性菌之细胞包膜相关蛋白质C未端氨基酸序列间的同源性。猪链球菌MRP与化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的M6蛋白质(20)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)之蛋白质A(16)、G群链球菌之蛋白质G(10)、化脓链球菌之AP4(13)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)之LP(46)、变异链球菌(S.mutans)炎WAP4(11)、化脓链球菌之T6和金黄色葡萄球菌之Fn-Bp(39)的氨基酸序列相比较。图13MRP中重复单位之氨基酸序列的比较。同源区括在方框内。图14用作探针的mrp和ef基因的片段。各图上方是用于产生探针之限制性位点的定位。用作探针的片段以实心纵线标示。实心纵线左边是探针缩写符号。箭头指示各基因的开放读码(ORF)。图14amrp基因的探针。SacI和HindIII位点尚未完全证实，但它们是通过亚克隆mrp基因的片段而产生的。图14bef基因的探针。图14cef＊基因的探针。开放纵线标示不是ef基因部分的ef基因的插入段序列。实施例1编码致病性猪链球菌2型菌株110KDa细胞外蛋白质之基因的克隆及核苷酸序列分析材料和方法细菌菌株和生长条件使用大肠杆菌菌株JM101(29)和LE392(33)作为重组质粒和噬菌体的宿主。用2型猪链球菌的致病性MRP+EF+菌株D282(43)分离染色体DNA。大肠杆菌菌株生长在LB肉汤(Luriabroth)(30)中。必要时加入终浓度为50μg/ml的氨苄青霉素。猪链球菌菌株生长于Todd-Hewitt培养液(Oxoid，Ltd.，London，England)中。DNA文库的构建和免疫学筛选按克隆载体制造者(Promega，Madison，USA)推荐的方法在λGEM-11中构建猪链球菌2型菌株D282的DNA文库。将重组噬菌体铺敷在大肠杆菌菌株LE392平皿上并于37℃下保温16小时。将硝酸纤维素滤膜(SchleicherandSchuell，Inc.，Dassel，Germany)放在噬斑上，并将平皿继续在37℃下保温2小时。用抗EF的单克隆抗体(Mabs)显示产生EF的重组体(实施例4)。按Sambrook等人(28)所述方法用连接了碱性磷酸酶的抗小鼠血清(ZymedLaboratories，Inc.SanFrancisco，USA)检测结合的抗体。经几次单个噬斑分离和免疫学筛选法纯化选择的EF阴性克隆。十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺电泳(PAGE)和Western印迹分析用SDS凝胶电泳法分离蛋白质，其中使用4%的堆积胶和6%的分离胶。将分离的蛋白质转移到置于半干(SemiDry)转移小室(Bio-RadLaboratories，Richmond，USA)中的硝化纤维素膜上。使用多克隆抗体(Pab，实施例4)或抗EF的Mabs并与磷性磷酸酶结合的抗兔或抗小鼠血清(ZymedLaboratories)显现特异性蛋白质。DNA操作和核苷酸序列分析按常规分子生物学技术(28)将分离的片段(亚)克隆到质粒载体pKUN19(24)中。用购自Promega(Madison，USA)的Erase-a-Base系统造成连续单向性缺失。用双脱氧链终止法(37)测定DNA序列。用软件接口装置PCGENE(Intelli-geneticCorp.，MountainView，CA)和WisconsinGCG(UniversityofWisconsin)分析DNA和蛋白质序列。结果ef基因的克隆。从2型猪链球菌的菌株D282中分离染色体DNA，构建DNA文库。用限制性酶Sau3A部分消化该DNA，并克隆到噬菌体λGEM11置换载体中。该文库中每微克DNA大约含有5×105个重组体。使用抗EF单克隆抗体(Mab)检验重组噬菌体的2，000个噬斑中是否存在EF的抗原决定基。其中两个噬斑为阴性。用Western印迹法分析由噬斑中洗脱的蛋白质，以研究两个选择的重组噬菌体的EF表达。两重组体均编码与猪链球菌分泌的EF共迁移并被抗EFMabs识别的蛋白质。因此两重组噬菌体都含有EF的完整遗传信息。使用限制性酶分析法定位重组的噬菌体上的遗传信息，两个克隆都有一个大约13Kb的DNA区域。将此共同DNA区域的部分亚克隆到质粒pKUN19中(图3)并用Western印迹法分析由重组质粒表达的蛋白质。含有6.8KbKpnI-SalI片段的质粒(pEF2-19，图3)编码一分子量与EF相同，且可被抗EFMabs识别的蛋白质。但含有5.8KbEcoRV-SalI或5.3KbBglII-SalI片段的质粒则不表达EF。这些数据表明，EcoRV和BglII位点是在EF表达所需的区域内。ef基因的核苷酸序列。检测含有EF编码区之片段的核苷酸序列。结果显示该序列(图1A)中存在三个分别编码含843氨基酸、201氨基酸和197氨基酸之多肽的主要开放读码(ORF)，即ORF1(从核苷酸361到2890)、ORF2(从核苷酸2856到3459)和ORF3(从核苷酸3462到4053)。ORF1含有一个推测的ATG起始密码子，其前面是一个与几种类型革兰氏阳性细菌之核糖体结合位点相似的序列(17)。相反，在ORF2和3的上游既没见有起始密码子，也波找到核糖体结合位点。ORF1的3′端与ORF2的5′互相重迭，尽管它们是在不同的读码中。ORF2和3被一单个的TAA终止密码子分隔开。发现了ORF1两个推测的启动子序列的上游区与常见于革兰氏阳性菌中启动子的-35和-10相符序列(consensussequence)相似(图1A)。ORF3的下游，存在着两个外延的双对称性区域。因为两区域均含有一段处在可能的柄一环结构之末端的胸苷残基，所以这些潜在的转录终止子可能是不依赖于P因子(34、40)的。由于序列数据没有明显揭示ORF2和ORF3上游或其中的转录和转译信号，故不能肯定这些ORF均表达蛋白质。另一种可能性是整个已测定了序列的区域中只含有一个大的开放读码。如果只存在两处序列错误即会出现这种情况在区域2856至2892中有+1碱基对移码，并且在位置3459处终止密码子中有一处错误。但这种可能性被测定来自三个另外的、独立选择之克隆的ef基因的序列得以排除了。使用最初克隆的片段作杂交探针，以从染色体中分离3个克隆。这些片段的核苷酸序列与图1A中所示者相同。EF的氨基酸序列。因为只有ORF1前面接有适当的表达/起始信号，所以该ORF可能编码EF。这一点通过将下述两个片段亚克隆到质粒PKUN19中得以证实一个是含有整个ORF1和ORF2的SpeI-SnaBI片段;一个是含有ORFS1和ORF2的5′端的SpeI-NarI片段(图3)。以Western印迹法分析由重组质粒表达的该蛋白质。在大肠杆菌中两重组质粒编码被抗EF单克隆抗体识别的、并且与猪链球菌分泌的EF有相同分子量的蛋白质。因此可知ORF1编码EF。但根据序列计算的ORF1产物的分子量(90，000)不同于根据SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳估测的EF的分子量(110，000)。由于EF全都无例外地见于猪链球菌培养物的上清液中，故预想该蛋白质的前面接有信号肽。推断的EF氨基酸序列的前46个氨基酸确实具有典型信号肽的特征。含有6个带正电荷氨基酸之N末端部分后面是有21个氨基酸的疏水核心和推测的信号肽酶裂解位点(45)。推断之氨基酸序列的水处理曲线(25)显示，除信号肽外，EF蛋白质是亲水的，而且并不含有延伸的疏水区域。发现推断的EF氨基酸序列与EMBL数据库中的蛋白质序列之间没有明显的相似性。虽然在ORF2和ORF3的上游没有发现适当的转译起始信号，但推测的ORF2和ORF3之氨基酸序列所显示的某些性质不大会使人们产生这些读码未得以表达的见解。推断的ORF2蛋白质的N末端显示了两个57氨基的高度重复单位(82%相同)。推定的ORF3蛋白质的C末端在功能上相似于几个革兰氏阳性菌细胞包膜定位的蛋白质的C末端(10、12、13、16、41)。疏水区的前面是保守序列Leu-Pro-X-Thr-Gly-Glu，且后面跟着一个亲水区。这一相似性提示推定的ORF3蛋白质是与细胞包膜相关联的。实施例2编码非致病性猪链球菌2型菌株细胸外蛋白质之基因的克隆及核苷酸序列分析材料和方法细菌菌株及生长条件。用大肠杆菌菌株JM101(29)作为重组质粒的宿主。从病人体内分离17个2型链球菌的MRP+EF＊菌株，从屠宰的猪扁桃体中分离5个菌株、从患病猪的器官中分离7个菌株，并有两个菌株来源不明(实施例4)。大肠杆菌菌株生长于LB肉汤(30)中。必要时加入终浓度为50μg/ml氨苄青霉素。猪链球菌菌株生长在Todd-Hewitt培养液(Oxid，Ltd.，London，England)中。基因组DNA及寡核苷酸。经在蛋白酶K/SDS溶液中溶解、用苯酚/氯仿提取并用乙醇沉淀以分离基因组DNA。用于聚合酶链反应(PCR)的寡核苷酸序列是5'-ATGTAATTGAATTCTCTTTTTAAGT-3'和5'-AAACGTCCGCAGACTTCTAGATTAAAAGC-3'。这些寡核苷酸相应于2型猪链球菌ef基因中的位置35至59和4308至4279。划下线的序列为限制性酶EcoRI和XbaI的识别位点。DNA操作和核苷酸序列分板按实施例1中所述方法进行。SDS-PAGE和Western印迹分析按实施例1中所述方法进行。Southern杂交。按Sambrook等人所述方法(28)将DNA转移到Gene-ScreenPlus膜(NewEnglandNuclearCorp，Dveieich，Germany)上。使用随机引物标记试剂盒(BoehringerGmhH，Mannheim，Germany)，用[C32P)dCTP](3000Ci/mMol，AmershamCorp，ArlingtonHeights，USA)标记DNA探针。按Geen-ScreenPlus膜提供者推荐的方法使印迹与DNA探针杂交。杂交后用2×SSC(1×SSC是0.15MNaCl加0.015M柠檬酸三钠，pH7.0)将滤膜于室温下洗两次，每次5分钟，再用0.1XSSC加0.5%SDS的溶液于65℃下洗两次，每次30分钟。用聚合酶链反应(PCR)技术扩增基因组DNA片段。使用PCR技术扩增ef＊序列。用得自2型猪链球菌之不同MRP+EF＊菌株的基因组DNA作为模板(实施例4)。用琼脂糖凝胶电泳法分离并用GeneClean(Biol101，LaJolla，USA)从凝胶中提取已扩增的DNA片段。用EcoRI和XbaI消化纯化的片段并克隆到质粒PKUN19(24)中。为了排除PCR过程中产生的DNA序列错误，将6个独立选择的克隆混合后用于核苷酸序列分析。结果EF＊蛋白质的Western印迹。属于MRP+EF＊表型之猪链球菌2型菌株的培养物上清液中含有可被抗EF单克隆抗体识别的蛋白质(实施例4，6)。这些蛋白质的分子量(MW)有所不同，并且都高于EF的分子量。将31个MRP+EF＊表型菌株分泌的蛋白质与由MRP+EF＊表型之菌株分泌的蛋白质相比较，发现了五类不同分子量的EF＊蛋白质。有三个菌株合成了约195KDa的EF＊蛋白质(Ⅰ类);18个菌株合成了约180KDa的EF＊(Ⅱ类);1个菌株合成了约175KDa的EF＊(Ⅲ类);5个菌株合成了约160KDa的EF＊(Ⅳ类);4个菌株合成了约155KDa的EF＊(Ⅴ类)。ef＊基因的Southern杂交。研究了编码110KDaEF和EF＊蛋白质之基因间的相互关系。用限制性酶PstI消化不同的MRP+EF＊菌株(每类中各取两个有代表性的)和MRP+EF+菌株D282的染色体DNA(43)。各不同的DNA均与含有完整ef基因的32P标记的EcoRV-SnaBI片段杂交(图4，参见实施例1)。结果显示，MRP+EF＊及MRP+EF＊菌株的DNA消化产物含有两个与探针强杂交的PstI片段。这些数据表明，编码110KDaEF和EF＊蛋白质的基因是密切相关的。在所有菌株中，最大杂交片段的长度都相同。相反，各菌株间最小杂交片段的长度则彼此不同。此外，最小杂交片段之长度的变异与不同菌株分泌之EF＊蛋白质的分子量变异密切相关。因为最小杂交片段位于ef基因的3′端(图4，实施例1)，这些数据提示ef和ef＊基因不同主要是在它们的3′端。ef＊基因的克隆。使用PCR扩增含ef＊的DNA以得到编码不同EF＊蛋白质的基因。使用5个不同之2型猪链球菌MRP+EF＊菌株(每类各取1个有代表性的菌株)的基因组DNA作为模板。用限制性酶EcoRI和XbaI消化已扩增的片段并克隆到大肠杆菌中。Ⅰ类ef＊基因。测定含完整Ⅰ类ef＊基因及其侧翼区域的6.8KbEcoRI-XbaI片段的核苷酸序列。序列分析揭示了两个开放读码(ORFs，图1B)。第一个ORF(从核苷酸361到5827)和第二个ORF(从核苷酸5830到6421)分别编码1822氨基酸和197氨基酸的多肽。根据其大小，预期第一个ORF编码EF＊蛋白质(195KDa)。ORFs被单个TAA终止密码子分隔开。第一个ORF含有一推断的ATG起始密码子，该密码子的前面是相似于细菌核糖体结合位点的序列(17)。相反，第二个ORF前面既没有适当的起始密码子，也没有推定的核糖体结合位点。在推定的EF＊蛋白质之氨基酸序列中，前46个氨基酸具有典型信号肽的特征(45)。蛋白质成熟部分的C末端含有许多不完全的76氨基酸重复。在Ⅰ类EF＊蛋白质中存在有十个半重复单位(记为R1至R11，图1B)。前4个重复单位是相邻接的，后六个半重复单位也是相邻的。但第四和第五个重复单位被113个氨基酸分开，且第五和第六个单位被22个氨基酸分开(图5)。后五个半单位的氨基酸序列是高度保守的，而前五个单位是可变的。一个特定氨基酸序列，Asn-Pro-Asn-Leu保留在所有的重复单位中。发现Ⅰ类EF＊序列和EMBL数据库中的任何蛋白质序列间都没有明显同源性。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ类ef＊基因。因为编码各种EF＊蛋白质的基因间主要差异在于它们的3′端，所以测定了Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ类基因之小PstI片段的核苷酸序列。比较这些核苷酸序列，显示各不同ef＊基因在该区域是高度同源的。但各ef＊基因在重复单位的数目和排列上彼此有所不同(图5)、(51)。与Ⅰ类ef＊不同，Ⅱ和Ⅳ类ef＊基因缺少R9和R10区域;Ⅲ类缺少R6、R7和R9区域，且Ⅳ类缺少R7、R8和R9区域。另外，Ⅳ和Ⅴ类ef＊基因缺少一个含有R4、R5及部分R3和R6区域的1，032bp片段。该区域的转译读码定位在保留了上述区域之缺失片段的3′端。在该1，032bp片段之左和右侧端区域中的核苷酸序列显示了9bp的直接重复(图6A)。ef＊和ef基因间的同源性因为EF＊蛋白质可被抗110KDa蛋白质的Mab识别，并且ef＊基因可与ef探针产生强杂交，所以推想ef(实施例1)和ef＊基因是部分相同的。比较Ⅰ类ef和ef＊基因的核苷酸序列，显示位在ef和ef＊编码区之5′端的2，499个核苷酸是完全相同的。与编码Ⅰ类EF＊蛋白质的基因不同，编码110KDaEF蛋白质的基因缺少一个2，368bp的片段。由于这一缺失而改变了读码，并且使位在2，368bp片段之3′端的区域在ef和ef＊基因中以不同的读码被转译。因此，110KDaEF蛋白质将不含有重复的氨基酸单位。分析2，368bp片段之左和右侧端区域上的核苷酸序列，显示了10bp的直接重复(含有1处错配)(图6B)。据此，推测编码110KDaEF蛋白质的基因可能是特异性缺失ef＊基因内2，368片段的结果。这将意味着非致病性的猪链球菌菌株可变成致病性的菌株。实施例3编码2型猪链球菌136KDa表面蛋白质(MRP)之基因的克隆和核苷酸序列材料和方法细菌菌株和生长条件。用大肠杆菌菌株JM101(SupE，thi，(lac-proAB-)[F′traD36，lacIqZ△M15]29)作为重组质粒DNA的宿主。用大肠杆菌菌株LE392[F，hsdR574(rK-，mK+)，SupE44，SupF58，lacY1，或△(laclZY)6，galK2，galT22，melB1，trpR55](33)作为重组噬菌体的宿主。从2型猪链球菌的致病性MRP+EF+菌株D282(43)中分离染色体DNA。大肠杆菌菌株生长在LB培养基(30)上。固体LB培养基含有1.5%琼脂。需要时可加入终浓度达50μg/ml的氨苄青霉素。猪链球菌菌株生长在Todd-Hewitt培养基(OxoidLtd.)中。Southern杂交按实施例2中所述方法进行。DNA文库的构建和免疫学筛选按实施例1中所述方法进行，只是其中以MRP代替了EF。SDS-PAGE和Western印迹分析按实施例1中所述方法进行，只是其中以MR代替了EF。核苷酸序列分析按实施例1所述方法进行。结果文库的构建和筛选。用限制性酶Sau3A部分消化从2型猪链球菌菌株D282中分离的染色体DNA。然后在噬菌体λGEM11置换载体中构建DNA文库，得到大约5×105个重组体/μgDNA。用抗MRP的MAb筛选，1，400个重组噬菌体，以确定MRP抗原决定基的存在。得到5个呈阳性反应的噬斑。免疫反应性重组体的特征。用Western印迹法分析从噬斑中洗脱的蛋白质，以研究5个选择的重组噬菌体对MRP的表达。所有5个重组体都编码可被抗MRP之MAb识别的蛋白质。但这些蛋白质的分子量(MW)比MRP低。有两个克隆编码约70KDa的蛋白质(克隆10和11);两个克隆编码约80KDa的蛋白质(克隆9和12)，一个克隆编码约90KDa的蛋白质(克隆7)。因此，可以认为这5个重组体都不含MRP的完整遗传信息。用限制性酶切分析法比较5个重组体的DNA插入段。所有克隆都有一个大约17Kb的DNA区域(图7A)。但该DNA插段在3′和5′端有所不同。插段3′端长度的变异与剪短之MRP蛋白质的MW变异有着密切地关联(参见图7A)。这种相互关系表明MRP编码序列是定位在DNA插段的3′端。另外将衍生于克隆7、9和10之DNA插段3′端的片段(图7B)克隆到质粒载体pKUN19(24)中也进一步证实了这一点。这些构建体编码的剪短形式的MRP蛋白质与重组噬菌体编码的剪短之MRP蛋白质没有明确可见的区别(图8)。从这些构建体中缺失0.7KbEcoRI-KpnI片段将终止剪截之MRP蛋白质的表达。这一点提示mrp的表达是由0.7KbEcoRI-KpnI片段起始的。完整mrp基因的克隆。使32P标记的pMR7-2的KpnI-SacI片段与用EcoRI或KpnI消化的2型猪链球菌菌株D282之染色体DNA杂交(图7B)，得到完整的MRP基因。7KbEcoRI片段和7KbKpnI片段都与探针杂交。基于其大小，预期EcoRI片含有完整的mrp基因，又因为mrp的表达是从0.7KbEcoRI-KpnI片段开始的，所以预期KpnI片段只包含基因的3′端。从EcoRI和KpnI消化的染色体DNA中分离大小范围为6-8Kb的片段，并连接到pKUN19的EcoRIKpnI位点中，然后用此连接混合物转化大肠杆菌JM101。所得到的50个选择的重组克隆中，有13个带有与MRP探针杂交的KpnI片段。所有这些重组体克隆都含有带7KbKpnI插的质粒(pMR-C)。相反，所得的2，500个带EcoRI片段的选择的重组克隆都不与探针杂交。因为预期7KbEcoRI片段含量完整的mrp基因，故这一发现表明MRP的表达在大肠杆菌中是有毒性的。然而，可通过强行克隆手段，使mrp基因的5′端(分离自pMR7-2)与该基因的3′端(分离自pMR-C)结合，以构建携带完整mrp基因的质粒(pMR11)。与pKUN19的拷贝数相比，该质粒的拷贝数似乎显著减少了，大约减少20倍。低拷贝数可能会使MRP在大肠杆菌中高水平表达的毒性作用减低到可耐受的水平。用Western印迹法分析由含有pMR11的大肠杆菌细胞产生的蛋白质。正如所期望的那样，这些细胞产生了与MRP共迁移的并可被抗MRP多克隆抗体(PAbs)识别的136KDa蛋白质。mrp基因的核苷酸序列。检测含有完整mrp基因及其测翼区域之4。6kbEcoRI-HindIII片段的核苷酸序列。如图2所示，序列分析揭示了编码含1，256个氨基酸(计算的MW为135，794)之多肽的3，768个核苷酸的开放读码。推断的ATG起始密码子的前面是与几种类型革兰氏阳性菌中的核糖体结合位点相似的序列(17)。mrp上游的核苷酸序列相似于常见于革兰氏阳性菌中之启动子的-35和-10相符序列。在mrp基因的下游，可检测到显示延伸之双对称性的区域。在相应mRNA中潜在的发夹结构有一个被6bp环分离开的12bp柄(按照Tinoco等人(40)的规则计算，△G＝-15.9Kcal/mol)。由于该双对称性区域后面没有富胸苷区，所以这个潜在的转录终止信号似乎是P因子依赖性的(34)。MRP的氨基酸序列。MRP是一种细胞包膜相关蛋白质，而且必须易位越过胞浆膜。因此成熟蛋白质必须含有信号肽。MRP的前47个氨基酸确实有典型信号肽的特征。包含7个带正电残基的N末端部分后面按着一个21氨基酸的疏水核心，再后是一个推测的信号肽酶裂解位点(45，图2中垂直箭头)。切掉信号肽可得到MW为131，094的成熟肽，此与根据SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳估测的MRP的MW(136KDa)很接近(实施例4)。在蛋白质的C末端(图11)鉴定了第二个20氨基酸的疏水区。如果这个区域与其他革兰氏阳性菌的包膜相关蛋白质(10、11、12、13、16、20、38、39、46)相类似，它便很可能是细胞膜固着结构。假定的细胞膜固着结构侧翼的两个区域，即一个短的高带电荷区域和一个含Leu-Pro-X-Thr-Gly-Glu氨基酸序列的区域，在革兰氏阳性菌的表面蛋白质中也是高度保守的(图12)。推测氨基酸序列Leu-Pro-X-Thr-Gly-Glu与细胞壁结合有关。在MRP序列中鉴定另外几个区域。MRP的成熟形式是以824氨基酸的独特N末端序列开始的。这个区域的后面是一段富脯氨酸残基的氨基酸序列86个氨基酸中有26个是脯氨酸残基。该区域的后面是三个54氨基酸的重复单位(图13)。第一个单位和第二个单位间被77个氨基酸分开，但第二和第三个单位相邻接的。第一和第二个单位的序列高度保守，而第三个是可变的。第三个重复单位后面是包膜固着序列。MRP序列和EMBL数据库之蛋白质序列间几乎没有同源性。但MRP的一个亚序列，即氨基酸残基619-985与金黄色葡萄球菌的粘连蛋白结合蛋白质的序列(39)具有某些相似性(在377个氨基酸的序列中有17.2%完全相同)。实施例4对与2型猪链球菌之毒性有关的两种蛋白质的鉴定材料和方法链球菌分离物。从三个不同的来源得到180个2型猪链球菌菌株。其中110个菌株得自荷兰的AnimalHealthServices。这些菌株是在常规诊断程序中从患病猪的器官中分离的。另外42个菌株是在健康猪被宰杀时从其扁桃体中分离的。还有27个从受到猪链球菌感染的病人身上分离的。另外42个菌株是在健康猪被宰杀时从其扁桃体中分离的。还27个从受到猪链球菌感染的病人身上分离的。扁桃体和人菌株由J.P.Arends，StreeklaboratoriumvoordeVolksgezondheidvoorGronigenenDrente，Groningen，theNetherlands提供。所有菌株都按以前描述的生物化学和血清学方法(44)作为2型猪链球菌分型。菌株1(即D282)以前已确定是对新生无菌猪有毒性的并且产生了MRP，而菌株2则无毒性并且不产生MRP(43)。因此，使用菌株1(MRP+)和(MRP-)作为参考菌株。培养条件。使1天龄菌落的的各细菌菌株生长在含有6%马血清的Columbia血清琼脂基质(代号CM331;Oxoid，Ltd.)上，并在Todd-Hewitt培养液(代号CM189;Oxoid)中于37℃保温过夜。从过夜培养物中得到早期静止生长期培养物，在Todd-Hewitt培养液中稀释10倍，并于37℃保温4小时。细胞分级分离。分别由180个菌株制备两个细胞分离部分(原生质体上清液和培养物上清液)。由180个菌株中随机选择23个菌株，从其中制备另外两个细胞分离部分(原生质体和膜囊泡)。分别从患病猪和健康猪体内、以及病人体内分离23个菌株。从在Toodd-Heiwitt培养液内生长的早期静止生长期培养物分离四个细胞部分。按VanderVossen等人所述方洒(47)分离原生质体。在Eppendorf离心机中离心后，收集原生质体和余留的上清液。按Driessen等人所述方法(9)分离膜囊泡。以4，000×9将液体培养物离心15分钟，收集培养物上清部分。抗原和抗血清的制备。将菌株D282的静止生长期培养物离心后收获上清液。过滤(PM30型滤膜;AmiconCorp.，Danvers，Mass.)浓缩到浓度为3mg/ml，并对Tris缓冲盐水(50mM，pH7.5)透析一次。用该产物作为抗原，以在兔体内产生多克隆体(PAb)，在小鼠体内产生单克隆抗体(MAb)。经肌肉内或皮下接种2mg在等体积费氏不完全佐剂中乳化的蛋白质以免疫兔。第2天重复接种没有佐剂的抗原。5周后经静脉内注射同样剂量抗体，但不加佐剂以进行加强接种。6周后，给兔放血。用一只兔(兔K191)的血清作为探针进行Western印迹分析。在BALB/C小鼠体内产生抗EF蛋白质的MAb。经腹腔内注射0.5ml含有25μg在等体积费氏不完全佐剂中乳化的蛋白质抗原，以免疫小鼠;3周重复上述程序。5周后，用同样剂量的抗原，但不加佐剂给小鼠进行静脉内加强接种。按VanZijderveld等人所述方法(52)制备杂交瘤细胞系。10-14天后，用酶联免疫吸附法检验杂交瘤细胞是否产生抗EF抗体。然后在菌株D-282之培养物上清液的Western印迹上检验杂交瘤培养物上清液(1∶2稀释)中的抗EFMAb。用结合了碱性磷酸酶的抗小鼠免疫球蛋白显现在硝化纤维素滤膜上MAb与110KDa蛋白质的结合。在微量滴定板中经有限稀释将阳性细胞克隆两次。按以前所述方法(52)，使用所得单克隆细胞系在姥鲛烷预处理的雌性BALB/C小鼠体内产生腹水液。筛选杂交瘤培养物上清液的间接酶联免疫吸附试验。于37℃下，用含有浓缩、透析并在磷酸盐缓冲盐水(pH7.2;每毫升0.075毫克蛋白质)中稀释的菌株D-282之培养物上清液(见上文)的溶液将聚苯乙烯微量溶定板(Greiner，Niirtingen，Germany)包被16小时，并将这些制备物于37℃下保温16小时。加入20倍稀释的杂交瘤培养物上清液并按述方法(52)检验之。将结合的抗体与已连接了棘根过氧化物酶(HRPO，Nordic，Tilburg，TheNetherlands)的抗小鼠免疫球蛋白(1∶500稀释的)一起保温。电泳和Western吸印试验。在6%或12%聚丙烯酰胺凝胶上用Laemmli所述的SDS-PAGE方法(26)分析各个细胞分离部分。电泳后，用银着染蛋白质(32)。为了进行Western印迹分析，使用MultiphorⅡNovaBlot系统(PharmaciaLKB，Vppsala，Sweden)将蛋白质电转印到硝酸纤维素膜上。用1∶500稀释的兔K191PAb或1∶300稀释的小鼠MAb探查这些印迹。用已连接了碱性磷酸酶的抗兔免疫球蛋白显现已结合的PAb。用1∶1，000稀释的连接了碱性磷酸酶(Zymed)的抗小鼠免疫球蛋白显现结合的MAb。结果得自23个选择之菌株的四个细胞部分的蛋白质分布图。从23个被检菌株制备属于各被研究组(患病猪、健康猪和病人)之两份猪链球菌分离物中的原生质体上清液和膜囊泡部分，分析其蛋白质分布图形发现两者几乎完全相同。相反，培养物和原生质体上清液的蛋白质分布图则明显不同。患病猪分离物的蛋白质分布图包含两条不存于大部分健康猪分离物之蛋白质分布图中的蛋白质带。其中一条带代表了被鉴定为MRP的136KDa蛋白质(43)。在SDS-PAGE分析中，含有6%聚丙烯酰胺的分离胶揭示了培养物和原生质体上清液(菌株1、5、24和26)中都有MRP。第二条带代表了110KDa蛋白质;因为这种蛋白质只在培养上清中检测到，故将其指定为EF。MRP和EF两者均存在于毒性参考菌株1(＝D-282)的培养物上清中，但不存于非毒性参考菌株2(＝T-15)的所有细胞组分中。从患病猪分离的8个菌株均含有MRP和EF。从健康猪体内分离的8个菌株中，有6个缺乏这些蛋白质。从病人体内分离的7个菌株中，有6个含有MRP，但这6个中只有3个也同时含有EF。当使用抗培养物上清液的兔K191PAb作为探针进行免疫印迹分析时，在2型猪链球菌菌株的细胞组分中清楚地检测到了MRP和EF。菌株1、5、24和26的原生质体上清液、培养物上清液和膜囊泡中都含有136KDaMRP(图9)。因为MRP是原生质体上清液的主要成分，所以这种蛋白质必然定位在细菌的细胞包膜中。菌株1和5的培养物上清液也含有110KDaEF。菌株24和26含有MRP但不含EF;菌株2和13既不含MRP，也不含EF。基于培养物上清中MRP和EF的存在，区分了2型猪链球菌的下列三个表型MRP+EF+、MRP+EF-和MRP-EF-(图10)。在高于150KDa之不同分子量处的蛋白质带都与兔K191血清反应，并显现于菌株17、24、25、26和28之培养物上清液的Western印迹中。因为除菌株25之培养物上清液中的以外，这些蛋白质也可被抗EFMAb识别，所以110KDaEF可能与这些蛋白质有关。用小鼠抗EFMAb探查Western印迹，显示所有带有MRP+EF-表型的菌株都在其培养物上清液中含有较高分子量蛋白质。另外，所有呈MRP+EF+表型的菌株都不含这些蛋白质。用兔K191血清探查表明，在包括菌株25的12个MRP-EF-菌株培养物清中存在有高分子量蛋白质。用抗EFMAb所作免疫印迹分析显示这些蛋白质与EF无关。当在12%板凝胶上用SDS-PAGE分析四个细胞部分时，末检出与毒性有关联的低分子量蛋白质。180个菌株之培养物和原生质体上清液的蛋白质分布图。使用6%板凝胶分析所有180个2型猪链球菌菌株是否在培养物和原生质体上清中出现这三个表型。从病猪器官中分离的菌株80%有MRP+EF+表型(表1)。表1从病猪、宰杀的健康猪和病人体内分离的180个链球菌菌株中普遍呈现MRP和EF表型2型猪链从下列来源分离之菌株的数目(%)球菌表型病猪的器官健康猪的扁桃体病人MRP+EF+86(77)1(2)4(15)MRP+EF-13(12)5(12)20(74)MRP-EF-12(11)36(86)3(11)相反，从健康猪的扁桃体中分离的菌株只有2%具有这种表型;这些菌株中86%是MRP-EF-。从病人中分离的菌株只有15%有MRP+EF+表型。在被检的2型猪链球菌菌株中，有远比猪菌株(12%)多的人菌株(74%)呈MRP+EF-表型;89%的人菌株是MRP+。未检测到MRP-EF+表型。实施例52型猪链球菌在新生无菌猪中的毒性材料和方法猪。经剖腹产手术从四只母猪得到52只属于GreatYorkshire和DatchLandrace杂交的无菌新生猪。两实验中所用的母猪都是姐妹关系。将猪分成12组，每组包括4或5只。各组分别关在无菌不锈钢恒温箱(43)内。接种物。从三个来源得到分属于MRP+EF+、MRP+EF-和MRP-EF-表型的10份2型猪链球菌菌株患脑膜炎的猪、屠宰场的健康猪和病人(表2)。按前述方法(44)对菌株进行生物化学和血清学分型。将菌株放在含15%甘油的营养素培养液中在玻璃珠上作为贮备悬浮液于-70℃下保存。生长在含6%马血之Columbia血液琼脂基质(代号CM331，Oxoid)上的1天令各菌株菌落于37℃下在Todd-Hewitt培养液(代号M189，Oxoid)中保温过夜。在Todd-Hewitt培养液中稀释过夜培养物(1∶10)得到早期静止生长期培养物并于37℃保温4小时。约4小时后，当600mm处光密度为0.5时停止保温。然后将大约含有1-3×109CFV/ml的培养物以4000×9离心15分钟。分析上清液中的MRP和EF。洗涤离心沉淀物并悬浮在磷酸缓冲盐水(PBS)、136.89mMNaCl、2.68mMKCl、8.1mMNa2HPO4、2.79mMKH2PO4溶液(pH7.2)中(A600＝1)，然后用作接种物。使用从患萎缩性鼻炎猪的鼻腔中分离的支气管炎博德特氏菌(BordetellaBronchiseptica)菌株92932诱发猪产生猪链球菌感染(23，43)。菌株保存在Dorset鸡卵培养基上。将得自羊血琼脂基质的48小时菌落培养在心脑浸液中以制备接种物。37℃保温18小时后，该培养基中含有大约109CFU/ml。在PBS中稀释此心脑浸液即制得所需接种物。电泳和Western吸印。用MRP/EF表型的猪链球菌菌株作接种物，并于检测实验结束时回收之分离物的MRP/EF表型。用Caemmli所述的SDS-PAGE(26)(6%聚丙烯酰胺)和Western吸印法分析从所有猪的鼻咽部、被感染病的发炎组织如脑膜和关节中所得分离物的细胞培养物上清液。电泳后用银着染蛋白质(32)。为进行Western印迹分析，使用MultiphorⅡNovaBlot系统并按照制造厂(PharmaciaLKB)推荐的方法将蛋白质电吸印到硝酸纤维素膜上。将滤膜与分别作1∶200稀释的小鼠抗MRP单克隆抗体(MAb)(11.3mg/ml)和抗EFMAb(8.4mg/ml)的1∶1混合物，或与1∶500稀释的多克隆抗MRP/EF兔血清(K191)(8.2mg/ml)(实施例4和6)一起保温。然后使滤膜与1∶1000稀释的结合了碱性磷酸酶(AP)的抗小鼠免疫球蛋白质或1∶3000稀释的与AP结合的抗兔免疫球蛋白G(r+K)(Zymed)一起保温。加入溶于磷酸缓冲液(100mMNaCl、5mMMgCl2、100mM二乙胺;pH9.5)中的底物溴氯吲基磷酸(Sigma，St.Louis，Mo.)一氮兰四唑(Kerck，Darmstad，Germany)显现已结合的抗体。实验设计研究工作包括两次实验，间隔期为5个月。使用一次性塑料注射器经鼻内注射给5天令无菌猪接种加在脑心浸液中的支气管炎博德特氏菌菌株92932的悬浮液。实验Ⅰ中的接种物含有0.84×107CFU，实验Ⅱ为1.0×107CFU。接种后(pi)两天，用10个2型猪链球菌菌株之一对无菌保温中的猪作相似接种(表2)。这些菌株接种物的平均(±SD)量为1.4(+0.60)×106CFU。所有接种都是在呼吸的吸气期向每个鼻孔内注入0.5ml细菌悬浮液。两次实验中都用菌株3(MRP+EF+)作阳性对照、并用菌株12(MRP-EF-)作阴性对照(参见结果部分)。当病情发展到致死程度或实验结束时(接种后3至4周)杀死猪并进行尸检。1、菌株3是在对猪常规诊断过程中从患脑膜炎猪体内分离的。菌株10、12、16和18是在屠宰时从健康猪扁桃体中分离的。菌株22(No.830544)、24(No.740113)25(No.821021)和28(No.760366)是从2型猪链球菌性脑膜病人中分离的。(括弧内的编号是指J.P.Arends和H.C.Zanen(2)等人给出编号)。2、×106CFU病情监测。每天检查猪的临床病征，如发热、中枢神经系统(CNS)和肢体功能失调。经颅静脉腔穿刺收集各头猪的血液样品，每周三次。用电导计数器(ContravesA.G.，Zurich，Switzerland)计数白血细胞(18)。对吉姆染色(Giemsa-Stained)的血涂片作分类计数后计算嗜中性白细胞数。每天收集鼻咽拭子标本和粪便，并直接涂敷在含有6%马血的Columbia琼脂上。将单种培养物的悬浮液与适当的高价免疫兔血清(DLO-CentralVeterinaryInstitute，Lelystad，NL)混合，以其进行玻片凝集试验，进一步证实2型猪链球菌和支气管炎博德特氏菌的存在。杀死猪后检查病理学改变。按以前所述方法(43)对CNS、浆膜、肝、脾和扁桃体的组织标本进行细菌学和组织学检查。结果电泳和Western印迹试验。在接种前用免疫印迹法分析猪链球菌菌株的培养物上清液时，鉴别了三种表型。菌株3、10和22属于MRP+EF+表型;菌株17、24和28为MRP+EF-表型，且菌株12、16、18和25属于MRP-EF-表型。兔多克隆抗体(PAb)识别MRP+EF-菌株之培养物上清中大于150KDa的蛋白质。另外也可用抗EFMAb检测到这些高分子量蛋白质，这表明110KDaEF和分子量远大于150KDa的蛋白质有共同的抗原决定基。在SDS-PAGE和Western印迹分析中，用作接种物之猪链球菌菌株的表型与在实验结束时从被感染猪之扁桃体和发炎组织中收集的分离物表型完全相同。表3在接种2型猪链球菌(分属三种表型的10个菌株)的猪中观察到的三个疾病参数的出现频率猪链球发热T＞40℃血液中PML特异性非特异性菌表型的出现率1三个参数的病征2病征3百分率(＞10%/L)MRP+EF+40785721MRP+EF-51605MRP-EF-03001、记录的阳性数/记录的总数2、跛行和神经功能紊乱如共济失调、环行运动、角弓反张及足横置。3、抑郁、食欲不振及躺卧。疾病的临床征象。两次实验中，所有接种MRP+EF+表型菌株的猪，从接种后第2天直肠体温不断上升，在4至8天时高达41.8℃。接种MRP+EF-表型菌株的十头猪，在接种后2至22天之间直肠体温于24至96小时的短时间升高至40℃以上。MRP+EF+组中发烧的发生率最高(40%)(表3)。MRP+EF+组中多形白细胞(PML)增多的出现率最高(表3)。根据接种三种表型菌株之猪血液样品中FML计数的对数值来进行毒性分析。结果发现接种前3天三组间的PML几何均数没有明显差异。从接种后第1天开始，接种MRP+EF+表型菌株的猪血液样品中的PML平均数明显高于MRP+EF+组或MRP-EF-组(P＜0.01)。接种后第20天，MRP+EF+和MRP+EF-组中的平均数彼此间无明显差异，但这些平均数与MRP-EF-组中的平均数则差异显著(P＜0.01)。接种MRP+EF+表型菌株的猪发病率为100%。从第2天开始，可观察到抑郁、躺卧、食欲不振及发烧等全身性疾病的非特异性征象。在继后的若干天里，接种猪即出现更为特异的病症，如共济失调、环行运动、角弓反张、躺卧并行走摇晃以及跛足。MRP+EF+组中特异性病征的出现率为57%(表3)。实验过程中有九头猪死亡，并在疾病末晚期有三头猪被杀死。因此这些组中的死亡率为12/18(67%)。九头接种了MRP+EF-表型菌株的猪出现发烧或粒细胞增多，或显示出其他非特异性病征，但没有显示特异性临床征象，如神经功能紊乱或跛行。MRP-EF-组中的猪则没有显现临床病征(表3)。病理学发现概括在表3中。在接种MRP+EF+表型菌株的猪中检查了CNS、浆膜及关节的严重性和多发性炎症。观察了呈现各种形式的肺炎和支气管炎。与接种MRP-EF-表型菌株的猪(22%)式接种MRP+EF+表型菌株的猪(11%)相比，作为主动免疫反应的征象--脾脏白髓中B细胞区域的滤泡形成及T细胞区域中的母细胞生成更常见于接种MRP+EF-表型菌株的猪中(50%)(表4)。有些接种MRP+EF+表型菌株的猪在生发中心出现淋巴细胞溶解，而在白髓周围的边缘区出现炎症，这些都是小动物之急性败血症的征象(42)。扁桃体中的活性滤泡也更常见于接种MRP+EF-或MRP-EF-表型菌株的猪中。1、累及大脑、小脑、脑桥、中脑和延髓，包括其中一个或多个不同的部位。2、累及腕骨、掌骨、跗骨、跗间骨、膝、肘、肩和髋部关节，包括其中一个或多个不同的关节。细菌学发现。从接种后第1天开始到实验结束止，每天从所有猪的鼻咽部及粪便拭子标本中分离链球菌菌株和支气管炎博德特氏菌。另外还在接种后6天从接种菌株16的猪(实验Ⅰ)并在接种后19天从接种菌株24的猪(实验Ⅱ)分离芽孢杆菌。保持其它的猪没有污染菌。尸检时，2型猪链球菌大多数是从示有病理改变的器官和组织(CNS、浆膜及关节)中分离的(表5)。支气管炎博德特氏菌只有从肺和扁桃体中分离到。从所有的猪扁桃体中也可同时分离出猪链球菌及支气管炎博德特氏菌这两种细菌。实施例6用酶联免疫吸附法分辨毒性和非毒性2型猪链球菌材料和方法细菌。检验了从下列三个来源得到的179个2型猪链球菌菌株得自常规诊断过程中发现的患病毒猪的器官、得自宰杀之健康猪的扁桃体，以及得自患有2型猪链球菌感染的病人。在初期研究中使用Western吸印技术检测培养物上清中的MRP和EF，并基于这些结果将菌株分成三种表型MRP+EF+、MRP+EF-和MRP-EF-(实施例4)。另外试验的是猪链球菌血清型1至22的22个菌株(15)，22个其他的链球菌菌株、15个不同菌种的22个细菌菌株，以及1种酵母菌(DLO-CentralVeterinaryInstitute，Lelystad)(表6)。培养条件和抗原制备。将在含6%马血的Colurnbia血液琼脂基质(代号CM331，OxoidLtd.)上生长过夜之细菌的1天令菌落接种到Todd-Hewitt培养液(代号CM189，Oxoid)上。37℃生长过夜后，将培养物以4，000×9离心15分钟。各菌株之20小时培养物在600nm处的光密度为0.60至1.04不等。有的菌种密度较低，它们是支气管炎博德特氏菌(0.23)、小球菌属(0.08至0.15)、马肠链球菌(Streptococcusequinus)(0.36)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)(0.05)。在两次DAS-ELISA试验中，使用未处理之培养物上清的两倍系列稀释液作为试验样品。用超滤法(PM30型滤膜，AmiconCorporation)对2型猪链球菌菌株D-282(MRP+EF+)的培养物进行浓缩并部分纯化之。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(136.89mMNaCl、2.68mMKCl、8.1mMNa2HPO4、2.79mMKH2PO4，pH7.2)稀释到蛋白质终浓度为75μg/ml。用该产物作为在直接竞争性ELSA中选择不同单克隆抗体并在间接ELISA中筛选杂交瘤培养物上清液的包被抗原。多克隆和单克隆抗体的制备。按实施例4中所述方法制备兔(Ra)抗MRP和EF(RaK191)的多克隆抗体(PAb)以及抗EF的三中不同的单克隆抗体(MAb)。基本上按制备识别EF之MAb的方法制备识别MRP的MAb。在雌性BALB/C小鼠中产生抗体及免疫程序已在上面实施例4中述及。按前述方法(52)制备杂交瘤细胞系。10至14天后，用间接ELISA检测杂交瘤培养物上清液中的抗MRP抗体(详见下文)。然后在菌株D-282之培养物上清液的Western印迹上检测杂交瘤培养物上清液(1∶2稀释)中的抗MRP抗体。使用与磷性磷酸酶结合的抗小鼠免疫球蛋白及下述底物显现与136KDa蛋白质结合的MAb。发现5份上清液为阳性。然后在微量滴定板中以有限稀释法这些小孔的细胞克隆两次。使用与抗MRP抗体呈阳性反应的5个细胞系和与抗EF抗体呈阳性反应的3个细胞系，在姥鲛烷预处理的雌性BALB/C小鼠中产生腹水液。使用硫酸铵沉淀法(50%饱和)从腹水液中纯化抗MRP和EF的MAb，并对PBS透析。5份抗MRPMAb分别标示为MRP至MRP5，三份抗EFMAbs分别标示为EF1至EF3。所有MAb的免疫球蛋白同型都是IgG1，在加于PBS内的1%琼脂糖凝胶中，与小鼠同型特异性抗血清(Nordic)进行双向免疫扩散以检测之。所有PAb和MAb均在-20℃下贮存。间接ELISA筛选杂交瘤培养物上清液。用浓缩并透析过的菌株D-282的培养物上清液(见上文所述)于37℃将聚苯乙烯微量滴定板(GreinerNurtingen，Germany)包被16小时。然后将其用PBS，PH7.2稀释(7Sμg/ml蛋白质)。按VanZijderveld等人所述方法(52)向各小孔内加入两倍稀释的杂交瘤培养物上清液。洗平板后，加入已与辣根过氧化物酶(HRPO，Nordic)结合的抗小鼠免疫球蛋白(1∶500稀释的)。37℃保温1小时并洗5次后，加入底物以检测已结合的HRPO-抗体结合物，其中底物是溶解于含有0.01MEDTA钠盐之0.01M磷酸盐缓冲液(pH5.95)中的重结晶5-氨基水杨酸(5-AS)(Merck)的0.1%溶液(wt/vol)，且在使用前直接向其中加入了终浓度为0.005%(wt/vol)的过氧化氢。室温下保温2小时后，用TitertekMultiskan光度计(FlowLabs)测定450nm处吸光率。直接竞争性ELISA。用直接竞争性ELISA选择MAb并用以发展MRP和EF双抗体夹心(DAS)ELISA。用Wilson和Nakane所述的高碘酸方法(49)将纯化的抗MRP和抗EFMAb及兔PAb连接到HRPO(BoehringerMannheim，Germany)上。结合了HRPO的免疫球蛋白在50%甘油中于-20℃下保存。在含有5%胎中血清和0.5%氯化钠的PBS-Tw中制成结合物溶液。将一系列两倍稀释(范围为1∶20到1∶10，240)的50μl未结合的抗MRPMAb加入已用在PBS(75μg/ml蛋白)中部分纯化了的菌株D-282之培养物上清液包被的聚苯乙烯微量滴定ELISA板(Greiner)之各小孔内。然后将该板在37℃。下保温30分钟。为了使未结合的MAb与MAb结合物竞争，分别加入最适稀释度的5份与HRPO结合的抗MRPMAb各50μl。于37℃保温1小时后洗板，然后加入上述底物5-ASH2O2以检测结合的HRPO-抗体。室温下保温2小时后读出吸光率值。以只加入结合物之小孔显示平均吸光率为A450＝50%时的最高稀释度表示竞争效价。按照与检测抗MRPMAb相似的竞争性ELISA方法检测三种抗EFMAb的抗原决定基特异性。SDS-PAGE和Western吸印技术。在以6%聚丙烯酰胺凝胶用SDS-PAGE法分离22个不同血清型猪链球菌及其他微生物的培养物上清液(表6)。按照仪器制造前(PharmaciaLKB)推荐的方法使用MultiphorⅡNovaBlot系统将蛋白质电吸印到硝酸纤维素滤膜上。用1∶300倍稀释的小鼠MAb探查印迹。用已与磷性磷酸酶(Zymed)结合的抗小鼠免疫球蛋白的1∶1000倍稀释液显现已结合的MAb。结果直接竞争性ELISA。对5个抗MRP克隆和3个抗EF克隆进行竞争试验。某些抗MRP克隆则彼此相互竞争。有5个抗MRPMAb是针对至少3个不同的抗原决定基的第一个由MRP1和MRP2识别，第二个由MRP3识别，第三个由MRP4和MRP5识别。因为所有这三个抗EF克隆都参予竞争，所以它们可能是针对同一个抗原决定基。MRP双抗体夹心ELISA。在使用MRP3作为俘获抗体并以HRPO-MRP1作为结合物的MRPDAS-ELISA中，用加在0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)中的100μl每孔含2.3μgMRP3的包被液包被聚苯乙烯微量溶定ELISA板的各小孔。于37℃吸收16小时后，直接使用包被好的平板或将其保存于-20℃下备用。向小孔内加入在含有0.05%(W/V)Tween80中以1∶1至1∶280两倍系统稀释的各菌株的100μl培养物上清液。37℃保温1小时后，用溶于自来水中的0.05%Tween80洗5次，再向小孔内加入100μl含有溶于PBS(pH7.2)之2.2μgHRPO结合的MRP1的溶液。使用棋盘滴定法检测俘获抗体及结合物的最适稀释度。37℃保温1小时后按上述方法加入底物5-ASH2O2。将A450≥0.2的小孔定为阳性。向各小孔内加入由100μl未稀释之2型猪链球毒性菌株4005(MRP+EF+)培养物上清液组成的阳性对照物。另外还加入由100μl未稀释的非毒性菌株T15(MRP-EF-)培养物上清液组成的阴性对照物。使用MRPDAS-ELISA方法试验179个如以前用SDS-PAGE和Western印迹法检测的分别属于三种表型MRP+EF+、MRP+EF-和MRP-EF-的2型猪链球菌菌株。大多数菌株在ELIS中均记录了如它们在Western印迹分析中的相同结果(表7)。在ELISA中，所有MRP+EF+菌株均为MRP阳性。有一个MRP+EF-菌株为假阴性。3个MRP-EF-菌株(6%)记录为假阳性。MRPDAS-ELISA的敏感性(TP/TP+FN)(TP＝真实阳性，FN＝假阴性)为99%(131个菌株中有130个)，特异性(TN/TN+FP)(TN＝真实阴性，FP＝假阳性)为94%(48个菌株中有45个)，且预测值(TP/TP+FP)为98%(131个菌株中有130个)。MRPDAS-ELISA可很好地区分MRP阳性和MRP阴性2型猪链球菌菌株。表7在MRP和EFDAS-ELISAs中检验179个2型猪链球菌(3种表型)的结果MRPDASELISAEFDASELISA菌株数菌株数表型+-+-MRP+EF+92(100%)092(100%)0MRP+EF-38(97%)1(3%)039(100%)MRP-EF-3(6%)45(94%)048(100%)在完成MRPDAP-ELISA试验后，记录属于2型猪链球菌三种表型之菌株培养物上清液的滴定曲线。从未稀释的92个MRP+EF+分离物之培养物上清液测得的吸光率平均值(土标准差)为1.2259(±0.1165)，39个MRP+EF-分离物的平均吸光率为1.2129(±0.2076)，48个MRP-EF-分离物的平均吸光率为0.1180(±0.2546)。因此可凭视觉读出溶定板的吸光率值而不必进行光度检测即可区分出MPR阳性菌株(表型MRP+EF+或MRP+EF-)和MRP阳性菌株(表型MRP-EF-)。21个其它血清型猪链球菌参考菌株中，有18个菌株之培养物上清液的吸光率低于0.2。3种血清型为阳性并有下列吸光率值血清型3的未稀释培养物上清液A450＝0.731;血清型5的培养物上清液A450＝0.587，血清型15(以前的Lancefield菌群T)的培养物上清液A450＝0.516。这些血清型在Western印迹分析中也呈阳性;在这些血清型的培养物上清液中MRP3显然识别了分子量高于150KDa的蛋白质。列于表6中的所有其他微生物的吸光率均小于0.2。EF双抗体夹心ELISA。在鉴别试验样品中特异性抗原的DASELISA试验中，使用了两种不同的MAbs，一种是作为俘获抗体，另一种则作为结合物，而且如在MRPDAS-ELISA试验中那样，它们各自识别抗原上的不同抗原决定基。在Western印迹中，EF识别属于MRP+EF-表型之所有菌株培养物上清液中的高分子量(＞150KDa)EF(实施例4)。因此用EF2作为俘获抗体的ELISA不太可能区分开MRP+EF+和MRP+EF-菌株。此外，因为三种EFMAb彼此时封闭的，所以我们必须使用EF2作俘获抗体，且使用多克隆兔血清(K191)作为结合物。有些ELISA试验是使用EF1作为俘获抗体并以EF2或EF3作为结合物，而且这些MAb确实是彼此完全封闭的。EFDAS-ELISA的试验程序基本上同于前述的MRPDAS-ELISA。同100μl含有3.3μgEF2[溶于0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)中]的溶液包被ELISA微量溶定板的各小孔。吸收后，包被的溶定板可直接使用或在-20℃下保存备用。使用从1∶1到1∶1∶128两倍系列稀释的100μl培养物上清液。保温并冲洗后，向各小孔内加入100μl溶于PBS(pH7.2)中的含2.7μg多克隆RaK191HRPO结合物的溶液。37℃保温1小时后，用上述底物5-ASH2O2使平板各孔显色。将A450≥0.4的孔定为阳性。各溶定板均使用上述的同样对照。以EFDAS-ELISA方法检验179个有预定蛋白质分布图形的猪链球菌2型菌株令人惊奇的是，在该ELISA中39个MRP+EF-菌株都没有记录为阳性，而所有92个MRP+EF+菌株则全是阳性(表7)。所有48个MRP-EF-菌株在该EFDAS-ELISA中都是阴性。因为没有检测出其他的假阳性或假阴性结果，所以EFDAS-ELISA显然能可靠地分辨出高和低分子形式的EF，进而也能分辨开属于MRP+EF-和MRP+EF-表型的2型猪链球菌菌株。完成EFDAS-ELISA试验后，记录属于三种表型之2型猪链球菌菌株培养物上清液的溶定曲线。从未稀释的93个MRP+EF-菌株培养物上清液测得的吸光率平均值(士标准差)为0.8204(±0.149)，39个MRP+EF-菌株的平均吸光率为0.1551(±0.046)，48个MRP-EF-菌株的平均吸光率为0.1061(±0.0371)。因此，同MRPDAS-ELISA一样，可直接阅读溶定板来区分EF阳性菌株(表型MRP+EF+)和EF阴性菌株(表型MRP+EF-或MRP-EF-)。在ELISA试验中，21个除2型外之其他血清型的猪链球菌参考菌株都不是EF阴性。某些其他菌种具有阳性吸光率值链球菌Lancefield菌群G(A450＝0.445)、菌群L(A450＝0.348)、马链球菌(A450＝0.671)以及金黄色葡萄球菌(A450＝0.718)。实施例7使用用聚合酶链反应(PCR)区分2型猪链球菌的致病性和非致病性菌株材料和方法细菌及生条件。选择13个2型猪链球菌菌株来检验是否可用聚合酶链反应(PCR)方法(36)区分2型猪链球菌的三种类型。实施例4和5中已确定了三种菌株之MRP和EF蛋白质的致病性及表达。使菌株在含有6%马血的Columbia血液琼脂基质(代号CM331，Oxoid)上37℃生长过夜。将型猪链球菌菌落接种到10mlTodd-Hewitt培养液(代号CM189，Oxoid)中，并于37℃下生长过夜。DNA分离。按Maniatis等人(28)所述方法分离过夜培养物的DNA。将DNA用蒸馏水稀释到10ng/μl，然后用于PCR。临床标本。从宰杀后的母猪得到鼻拭子和扁桃体组织。将鼻拭子分离物接种到血液平皿上。按以前所述方法(27)从扁桃体中分离2型猪链球菌菌株。样品分离。用稍加改动的Boom等人所述的方法(4)制备用于PCR的临床标本将标本加到装有900μlL6溶解缓冲液和40μl硅藻土溶液的Eppendorf管中[L6缓冲液100ml0.1MTSIS-HCl(pH6.4)+120g(异)硫氰酸胍(GusCN，Flukacatnr.50990)+22ml0.2MEDTA(pH8.0)+2.6gTritonx-100。硅藻土溶液是在50ml蒸馏水+500μl32%(W/V)HCl中加入10g硅藻土(JanssenChimicaCat.nr.17，346，80)]。使临床标本在L6缓冲液中于暗处室温下保温过夜。在带有Durapore膜(MultiscreenMAHVN45，Millipore)的微量溶定板各小孔中用移液管溶加150μl溶液。将微量溶定板放在真空歧管(MAVM09600，Millipore)上，样品用200μlL2洗液[L2缓冲液是100ml0.1MTris-HCl(pH6.4)+120gGuSCN]洗5次，用200μl70%乙醇洗5次，并用200μl丙酮洗1次。在各次洗涤之间不得使滤膜变干。用棉纸将微量溶定板底面吸干，关在56℃下放置15分钟使样品完全干燥。向各小孔内加入75μlPCR缓冲液(见下文)。将溶定板置于56℃下保温15分钟。再次将微量溶定板放在真空歧管上。其中Durapore板下面为一标准微量溶定板(Micronic)。施加真空抽吸，并在下面的微量溶定板中收集含有DNA的PCR缓冲液，而硅藻土仍留在Durapore滤膜上。PCR检测法。PCR包括10ng纯化的PNA或25μl临床标本，总体积50μl。反应混合物含有10mMTris-HCl(pH9.0)、2mMMgCl2、50mMKCl、0.01%明胶、四种三磷酸脱氧核苷酸各0.2mM、四种引物各1μM、0.5单位Amplitaq聚合酶(PerkinElmerCetus，Norwalk，Conn.)，并用2滴石蜡油复盖。大PerkinElmer热循环器中进行25或40次DNA扩增循环94℃1分钟、55℃1分钟、72℃2分钟。在含有溴乙锭的1.5%琼脂糖凝胶上分析10至20μl扩增的DNA。PCR引物。用于PCR的寡核苷酸序列是P15:1403-1425;5'-GGTATACCTTGCTGGTACCGTTC-3';16:1914-1934:5'-AGTCTCTACAGCTGTAGCTGG-3';P14:2890-2908:5'-GTTGAAAACAAAGCGTTCG-3';以及P-35:3229-3249:5'-CTTCGACAAAATGTCAGATTC-3'。寡核苷酸P-15和P-16相当于2型猪链球菌之mrp基因中所指出的位置(实施例3，图2)。寡核苷酸P-34和P-35相当于在2型猪链球菌ef＊基因中指出的位置(实施例2，图1A)。按照仪器生产厂商提供的操作方法在AppliedBiosystem381A型合成仪上合成引物。结果PCR的特异性。确定了mrp和ef＊基因(参见实施例3和2)内可用于鉴别2型猪链球菌之三种表型的两个区域(分别称为m-Ⅵ和e-Ⅴ)。(参见实施例8)。将基于m-Ⅵ区域(p-15和p-16)和e-V区域(p-34和p-35)的引物用于PCR中。引物p-15和p-16扩增了m-Ⅵ区域中的532bp片段。引物P-34和P-35扩增3e-Ⅴ区域中的360bp片段在用这些引物进行的PCR中使用了4个MRP+EF+、4个MRP+EF＊和5个MRP-EF-菌株的染色体DNA。经过25次循环后在琼脂糖凝胶上分析已扩增的片段。从MRP+EF+菌株的DNA扩增了532bp片段。从MRP+EF＊菌株的DNA扩增了532bp片段及360bp片段。相反，从MRP-EF-菌株的DNA则既未扩增532bp片段，也未扩增360bp片段。这些资料显示，该PCR技术可用于鉴别2型链球菌的三种表型。用Western吸印(实施例4)、ELISA(实施例6)、与DNA探针m-Ⅵ和e-Ⅴ的杂交实验(实施例8)以及PCR技术检测宰杀时从37头母猪扁桃体中分离的82个2型猪链球菌菌株的表型。用这四种方法检测，从其中36头母猪分离的79个菌株分型完全相同。从1头母猪分离的3个菌株用PCR和DNA杂交实验被分为MRP+EF＊表型，用Western吸印和ELISA方法则被分为MRP-EF-表型。这些结果表明，PCR可代替其他方法用于确定2型猪链球菌菌株的表型。PCR的敏感性。用蒸馏水稀释纯化的MRP+EF＊猪链球菌2型菌株的染色体DNA，并直接用于PCR中。经42次PCR循环后，检测到25毫微微克(fg)DNA。这一结果表明在经过PCR扩增后，可基于链球菌细胞含有1.75fgDNA这一数据(35)在琼脂糖凝胶上检测14个细胞的DNA。决定全部细胞检验PCR的敏感性。为此，在磷酸盐缓冲盐水(PBS(pH7.2)137mMNaCl、2.7mMKCl、8.1mMNa2HPO4、2.8mMKH2PO4)中稀释并制备用于上述PCR的MRP+EF＊细胞。进行PCR(40次循环)之前，在含有大约50个细胞的样品中仍可检测到已扩增的片段。PCR可直接用于临床材料。将系列稀释的2型猪链球菌细胞加到鼻拭子上。发现在进行PCR之前在含有大约50个细胞的样品中仍可检测到已扩增的片段。实施例8使用DNA探针鉴别致病性和非致病性2型猪链球菌菌株材料和方法细菌。分离13个2型猪链球菌菌株(4个MRP+EF+菌株，4个MRP+EF＊菌株和5个MRP-EF-菌株)，以检验是否可用mrp、ef和ef＊基因的区域来鉴别2型猪链球菌的三种表型。除菌株16外，这些被检菌株在小猪的感染实验中(实施例5)均显示有致病性。从下列三个来源得到170个2型猪链球菌菌株自患病猪的器官(103个菌株)、宰杀的健康猪的扁桃体(40个菌株)以及从病人体内(27个菌株)。使用猪链球菌血清型1至22的参考菌株(15)、21个其他链球菌菌种和45个其他细菌的菌株(38个不同的的菌种，DLOCentralVeterinaryInstitute，表8)试验mrp和ef探针的特异性。培养基。大肠杆菌JM101菌株生长在LB培养基30中。需要时加入青霉素至终浓度为50μg/ml。所有其他细菌菌株均在含有6%马血Columbia血液琼脂基质(代号CM331，Oxoid)上37℃生长过夜。将过夜生长的菌落加在10mlTodd-Heuitt培养液(代号CM189，Oxoid)中保温并于37℃下生长过夜。DNA分离及操作。按Maniatis等人所述方法(28)进行染色体DNA分离和常规DNA操作。按下述步骤制取粗溶胞产物将过夜生长的培养物11S4000×9离心10分钟，并将沉淀组分重新悬浮于500至1000μlTEG-溶菌酶缓冲液[25mMTris-HCl(pH8.0)、10mMEDTA、50mM葡萄糖和1mg/ml溶菌酶)中。25℃保温30分钟后，将此样品用于点印迹分析。探针。使用质粒pMR11、pEF2-19和pEF17-7(参见实施例1、2、3)产生克隆到pKUN19(24)中的亚克隆。使用Gene-Clean药盒(Bio101Inc.，LaJolla，USA)从制备性琼脂糖凝胶中分离适当亚克隆的片段。然后使用随机引发的标记药盒(BoehringerGmbH)，按照生产商推荐的操作程序用2-32PdCTP(3000Ci/mMol，Amersham)标记纯化的片段并将其用作探针。Southern杂交。将13个选择的2型猪链球菌菌株的染色体DNA(1μgDNA)点在Gene-Screen尼龙膜(New-EnglandNuclearCorp.，Boston，USA)上。按照制造厂方推荐的方法将膜与32P标记的mrp和ef探针一起保温。过夜杂交后，室温下用2×SSC将滤膜洗两次各5分钟，再用0.1SSC加0.5%SDS于65℃下洗两次每次30分钟(1×SSC＝0.15MNaCl+0.015M柠檬酸钠)。使用点印迹装置(BethesdaResearchLaboratories)170个2型猪链球菌菌株、22个1-22型猪链球菌参考菌株组，以及其他链球菌菌种和其他细菌菌株组，各取20μlDNA或粗制溶胞产物样品点在Zeta探针尼龙膜(Biorad)上。按制造商推荐的方法使膜与32P标记的mrp和ef探针一起保温。过夜杂交后，于65℃下40mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)+5%SDS+1mMEDTA将膜洗两次各30分钟，并于65℃下用40mM磷酸钠缓冲液(pH7，.2)+1%SDS+1mMEDTA洗两次每次30分钟。所有(预)杂交均在杂交烘箱(Hybaid)内进行。结果mrp探针。使2型猪链球菌之三种表型菌株的染色体DNA杂交到mrp基因的不同区域。使用六个不同的mrp探针(如图14a中图解所示)。EcoRI-SnaBI片段，即m-Ⅰ，含有整个mrp编码区。m-Ⅱ、m-Ⅲ、m-Ⅳ和m-Ⅴ探针含有mrp基因的不同区域。MRP+EP+和MRP+EF＊菌株与所有的mrp探针强杂交。另外，m-Ⅰ、m-Ⅱ、m-Ⅳ和m-Ⅴ探针与5个MRP-EF-菌株中的4个强杂交。1个MRP-EF-菌株则不与任何一个mrp探针杂交。这些数据表明4个MRP-EF-菌株含有与菌株D-282之mrp基因同源的大区域，而菌株25缺乏完整的mrp基因。但这4个MRP-EF-菌株只与探针m-Ⅲ产生微弱杂交，这表明只有探针Ⅲ-Ⅲ的一个小部分与它们的DNA同源。探针m-Ⅵ是在除去探针m-Ⅲ的5′端385bp和3′端325bp后构建成的。5个MRP-EF-菌株完全不与探针m-Ⅵ杂交，表明这些菌株缺少与m-Ⅵ探针杂交的区域。因此，可以用探针m-Ⅵ来区分mRP+和MRP-菌株。ef和ef＊探针。三种表型之2型猪链球菌的染色体DNA与ef基因的不同区域杂交。使用了四个不同的ef探针(如图14b中图解所示)。所有MRP+EF+和MRP+EF＊菌株以及1个MRP-EF-菌株可与所有的ef探针杂交。相反地，4个MRP-EF-菌株都不与任何一个ef探针杂交。这些结果表明，上述这些MRP-EF-菌株中大多数缺少与ef基因同源的完整区域，而只有1个MRP-EF-菌株似乎包含与ef基因同源的完整区域。因此探针e-Ⅰ至e-Ⅳ都不能被用来区分三种类型。因为编码EF＊蛋白质的基因含有不存在于编码EF蛋白质的基因中的DNA片段，所以可选用这个额外DNA的一部分作为探针(图14C，探针e-Ⅴ)。探针e-v可与所有的MRP+EF＊杂交。相反，MRP+EF+和MRP-EF-菌株都不与e-Ⅴ探针杂交。这些数据显示，MRP+EF+和MRP-EF-菌株缺少与e-Ⅴ同源的区域。因此探针对MRP+EF＊菌株是特异的。因此，如果在互补杂交研究中所用m-Ⅵ和e-Ⅴ，便有可能鉴别2型猪链球菌的三种表型。如果2型猪链球菌菌株与探针m-Ⅵ和e-Ⅴ杂交，这些菌株应属于MRP+EF＊表型;如果2型猪链球菌菌株与m-Ⅵ杂交但不与e-Ⅴ杂交，这些菌株即属于MRP+EF+表型;最后如果菌株与m-Ⅵ和e-Ⅴ不杂交，则它们便属于MRP-EF-表型。就170个其他2型猪链球菌菌株试验mrp、ef和ef＊探针。88个菌株具有MRP+EF+表型，37个菌株具有MRP+EF＊表型，45个菌株具有MRP-EF-表型。与前述数据相一致，所有MRP+EF+菌株都与探针M-Ⅰ至M-Ⅵ及e-Ⅰ至e-Ⅳ杂交，但都不与探针e-Ⅴ杂交。再者，所有37个MRP+EF＊菌株都与所有的探针杂交。然而，45个MRP-EF-菌株中，只有两个与探针m-Ⅵ和e-Ⅴ杂交，据此而错误地将其归为MRP+EF＊菌株。因此，可以使用探针m-Ⅵ和e-Ⅴ以很高的可能性预测2型猪链球菌的表型(168/170;98.8%)。m-Ⅵ和e-Ⅴ探针的特异性。试验猪链球菌血清型1至22的参考菌株与探针m-Ⅵ和e-Ⅴ的杂交情况。结果发现，猪链球菌2(菌株735)、4、5和14血清型菌株与m-Ⅵ探针杂交，而1/2、2、4、5、6、14和15血清型菌株与e-Ⅴ探针杂交。这些数据提示，mrp和ef基因对于猪链球菌血清2型不是特异的，但在几种血清型菌株中却存在同源序列。根据这些实验数据，可将血清型2、4、5和15归为MRP+EF＊表型菌株，而血清型1/2、6和15则应属于MRP-EF-表型菌株。用探针m-Ⅰ、m-Ⅵ、e-Ⅲ和e-Ⅴ检验猪病原体及几种常见细菌的染色体DNA。被检的各菌种列于表8中。有些菌种(大肠杆菌、氧化克伯氏菌、肺炎克伯氏菌及鼠伤寒沙门氏菌)虽然可与探针m-1杂交，但都不与探针m-Ⅵ、e-Ⅲ和e-Ⅴ杂交。这些数据说明虽然在某些菌种中发现了部分mrp基因，但探针m-Ⅵ和e-Ⅴ是对猪链球菌特异的。因此，探针m-Ⅵ和e-Ⅴ具有潜在的诊断价值。表2实验设计猪链球菌猪链球菌猪链球菌猪链球菌被接种猪菌株数表型分离的来源1接种剂量2的数目3MRP+EF+猪脑膜1.8453MRP+EF+猪脑膜1.96410MRP+EF+猪扁桃体1.52522MRP+EF+人2.93417MRP+EF-猪扁桃体1.26424MRP+EF-人1.22428MRP+EF-人1.23412MRP-EF-猪扁桃体1.05512MRP-EF-猪扁桃体0.98416MRP-EF-猪扁桃体0.70418MRP-EF-猪扁桃体1.10425MRP-EF-人0.974表4.接种2型链球菌(三种表型的10个菌株)的猪的各种组织中检查出的病理损伤有病理损伤的猪的数目组织和病理损伤表型MRP+EF+表型MRP+EF-表型MRP-EF-(被检数＝18)(被检数＝12)(被检数＝22)CNS脑膜炎11200脑炎11010脉络膜炎700脑软化500浆膜/关节心包/心外膜炎1111胸膜炎510腹膜炎1460多关节炎21500肺低位支气管肺炎111间质性肺炎755纤维蛋白性肺炎300支气管炎/223细支气管周炎肝门静脉周和/或1183小叶内病灶脾活性白髓265活性红髓402扁桃体活性滤泡3912腺管渗出156表5.从接种2型猪链球菌(三种表型的10个菌株)的猪的各种组织中分离链球菌尸检时从中分离猪链球菌的猪的数目组织表型MRP+EF+表型MRP+EF-表型MRP-EF-(被检数＝18)(被检数＝12)(被检数＝22)CNS1400浆膜920关节1320肺6(9)10(2)12(8)11括弧内的数字表示同时也分离出支气管炎博德特氏菌的猪数。表6.微生物一览表菌群微生物微生物A人化脓链球菌其他菌种(Streptococcuspyogeneshumanis)B无乳链球菌金黄色葡萄球菌(Streptococcusagalactiae)(Staphylococcusaureus)C马链球菌表皮葡萄球菌(Streptococcusequi)(Staphylococcusepidermidis)猪类马链球菌猪葡萄球菌(Streptococcusequisimilisporcine)(Staphylococcushyicus)停乳链球菌绿色气球菌(Streptococcusdysgalactiae)(Aerococcusviridans)兽瘟链球菌化脓放线菌(Streptococcuszooepidemicus)(Actinomycespyogenes)粪肠球菌大肠杆菌(3X)(Enterococcusfaecalis)(Escherichiacoli)尿肠球菌氧化克来伯氏杆菌(Enterococcusfaecium)(Klebsiellaoxytoca)液化肠球菌肺炎克来伯氏杆菌(Enterococcusliquefaciens)(Klebsiellapneumoniae)牛链球菌(2X)小球菌菌株3551(Streptococcusbovis)(Micrococcusluteus)产酶链球菌藤黄小球菌(Streptococcuszymogenes)(Micrococcus)E链球菌E菌群出血败血性巴斯德氏菌(StreptococcusgroupE)(Pasteurellamultocida)G链球菌G菌群(2X)普通变形杆菌(StreptococcusgroupG)(Proteusvulgaris)L链球菌L菌群(2X)鼠伤寒沙门氏菌(StreptococcusgroupL)(Salmonellatyphimurium)P链球菌P菌群液化沙雷氏菌(Streptococcusgroupp)(Serratialiquefaciens)Q链球菌Q菌群(StreptococcusgroupQ)乳脂链球菌Ⅲ(StrepococcusmilleriⅢ)酵母血链球菌劳伦隐球菌(Streptococcussanguis)(Cryptococcuslaurentii)乳房链球菌(Streptococcusuberis)表8.用于试验探针特异性的其他菌种一览表球菌(Streptococcusspecies)无乳链球菌马链球菌(S.agalactiae)(S.equi)猪类马链球菌兽瘟链球菌(S.equisimilisporcine)(S.zooepidemicus)停乳链球菌粪肠球菌(S.dysgalactiae)(Enterococcusfaecalis)液化肠球菌产酶肠球菌(E.Liquefaciens)(E.Zymogenes)尿肠球菌链球菌菌群E(E.faecium)(S.groupE)乳脂链球菌Ⅲ乳房链球菌(SimilleriⅣ)(S.uburis)人化脓链球菌牛链球菌(S.pyogeneshumanis)(S.bovis)动物链球菌G链球菌菌群G(S.animaleG)(S.groupG)链球菌菌群L生物型Ⅰ链球菌菌群L生物型Ⅱ(S.groupLbiotype1)(S.groupLbiotypeⅡ)链球菌菌群P链球菌菌群Q(S.groupP)(S.groupQ)血链球菌(S.sanguis)其他细菌胸膜肺炎放线杆菌绿色放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)(Actinobacillusviridans)猪放线杆菌亲水气单胞菌(Actinobacillussuis)(Aeromonashydrophila)化脓放线菌地衣型芽胞杆菌(Actinomycespyogenes)(Bacillaslicheniformis)蜡样芽胞杆菌支气管炎博德特氏菌(Bacilluscereus)(Boreletellabronchiseptica)枯草芽胞杆菌猪布鲁氏杆菌生物型Ⅱ(Bacillussubtilis)(BrucellasuisbiotypeⅡ)猪布鲁氏杆菌生物型Ⅰ粪弯曲杆菌(BrucellasuisbiotypeⅠ)(campylobacterfaecalis)大肠弯曲杆菌白色念珠菌(Campylobactercoli)(Candidaalbicans)空肠弯曲杆菌红斑丹毒丝菌(Campylobacterjejuni)(Erysipelothrixrhusiopathiae)产气夹膜杆菌A无毒性的(ClostridiumperfringensAnon-toxic)产气夹膜杆菌A有毒性的氧化克伯氏菌(ClostridiumperfringensAtoxic)(Klebsiellaoxytoca)大肠杆菌单核细胞增多性李斯特氏菌(Escherichiacoli)(Listeriamonocytogenes)猪寄生嗜血杆菌藤黄小球菌(Haemophilusparasuis)(Micrococcusluteus)肺炎克伯氏菌猪肺炎支原体(Klebsiellapneumoniae)(Mycoplasmahyopneumoniae)小球菌菌株3551猪关节液支原体(Micrococcusstrain3551)(Mycoplasmahyosynoviae)鸟结核分支杆菌血清变异2出血败血性巴斯德氏菌(Mycobacteriumaviumserovar2)(Pasteurellamulltocida)猪鼻支原体鼠伤寒沙门氏菌(Mycoplasmahyorhinis)(Salmonellatyphimurium)绿脓假单胞菌金黄色葡萄球菌(Pseudomonasaeruginosa)(Staphylococcusaureus)普通巴斯德氏菌猪葡萄球菌(pasteurellavulgaris)(Staphylococcushyicus)液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)小肠结炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)参考资料1.Arends，J.P.，andH.C.Zanen.1984.Proc.9thLancefieldInt.Symp.StreptococciStreptococcalDis.，p.343.2.Arends，J.P.，andH.C.Zanen.1988.MeningitiscausedbyStreptoccussuisinhumans.Rev.Infect.Dis.，10131-137.3.Arends，J.P.，N.Hartwig，M.Rudolphy，andH.C.Zanen.1984.CarrierrateofStreptococcussuiscapsulartype2inpalatinetonsilsofslaughteredpigs.J.Clin.Microbiol.20945-947.4.Boom，R.，C.J.A.Sol，M.M.M.Salimans，C.L.Jansen，P.M.W.WertheimvanDillen，andJ.vanderNoordaa.1990.Rapidandsimplemethodforpurificationofnucleicacids.J.Clin.Microbiol.28495-503.5.Breton，J.，W.R.Mitchell，andS.Rosendal.1986.Streptococcussuisinslaughterpigsandabbatoirworkers.Can.J.Vet.Res.，50338-341.6.Clifton-Hadley，F.A.1983.Streptococcussuistype2infections.Br.Vet.J.1391-5.7.Clifton-Hadley，F.A.，T.J.L.Alexander，M.R.Enright，andJ.Guise.1984.MonitoringherdsforStreptococcussuistype2bysamplingtonsilsofslaughterpigs.Vet.Rec.115562-564.8.Clifton-Hadley，F.A.，T.J.L.Alexander，I.Upton，andW.P.H.Duffus.1984.FurtherstudiesonthesubclinicalcarrierstateofStreptococcussuistype2inpigs.Vet.Rec.，114513-518.9.Driessen，A.M.J.，W.deVrij，andW.N.Konings.1985.Incorporationofbeefheartcytochromecoxidaseasaproton-motive-forcegeneratingmechanisminbacterialmembranevesicles.Prcc.Natl.Acad.Sci.USA827555-7559.10.Fahnestock，S.R.，P.Alexander.J.NagleandD.Filpula.1987.Geneforanimmunoglobulin-bindingproteinfromagroupGStreptococcus.J.Bacteriol.167870-880.11.Ferretti，J.J.，R.R.B.Russell，andM.L.Dao.1989.Sequenceanalysisofthewall-associatedproteinprecursorofStreptococcusmutansantigenA.Mol.Microbiol.3469-478.12.Fischetti，V.A.，V.Pancholi，andO.Schneewind.1990.ConservationofahexapeptidesequenceintheanchorregionofsurfaceproteinsfromGram-positivecocci.Mol.Microbiol.41603-1605.13.Frithz，E.，L-O.HedenandG.L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