猪链球菌噬菌体裂解酶的冻干保护剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开了猪链球菌噬菌体裂解酶的冻干保护剂，涉及的是生物制品的冻干保存领域。包括如下成分：蔗糖、葡萄糖、山梨酸钾及浓度为50mM，pH为8.0的磷酸钠缓冲液，所述的蔗糖、葡萄糖和山梨酸钾的质量浓度分别为18%、6%、0.3%。本发明所选用的冻干保护剂组合物能够减少elysin在冷冻干燥过程中活性降低，可使elysin在冷冻干燥4℃保存7天后维持84.7%的活性；本发明的冻干保护剂组合物使elysin在4℃条件下保存7天，浊度递减实验中elysin的活性维持在84.7%。有效解决elysin不能4℃下不能长期保存，酶活性很快下降的问题。
【专利说明】
猪链球菌噬菌体裂解酶的冻干保护剂
技术领域
[0001] 本发明涉及的是生物制品的冻干保存领域，具体的说是猪链球菌噬菌体裂解酶 e 1 y s i η冻干保护剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 猪链球菌噬菌体裂解酶是一种可以裂解猪链球菌细胞壁的水解酶。Elysin(猪链 球菌噬菌体裂解酶，专利申请号:201610021643.3)是通过易错PCR对裂解酶LySMP进行定向 突变而获得的对猪链球菌菌株SS2-4裂解活性增强的酶_。但该酶在冷藏或冷冻保存时极容 易活力下降，在4°C可保存1周，在-20°C条件下保存期不超过1个月，期间裂解细菌活性也显 著下降，这就要求elysin在保存和使用过程中尽可能在低温条件下进行，否则易因保存温 度不当或保存时间不长而影响该酶的使用效果。
[0003] 冷冻干燥是目前保持微生物、动物组织、细胞及蛋白质等活性物质生物活性的一 个有效的、普遍的方法。制品经完全冻结，并在一定的真空条件下使冰晶升华，从而达到低 温脱水的目的。但干燥过程中容易导致蛋白质失水，使原来与水形成的分子间氢键断开，多 肽链展开，造成蛋白质变性而失去生物活性。为防止在冻干过程中蛋白质或细胞的损伤，在 冻干过程中常添加糖、蛋白质、氨基酸等物质来起保护作用。保护剂可以改变生物样品冷冻 干燥时的物理、化学环境，减轻或防止冷冻干燥或复水对细胞的损害，尽可能保持原有的各 种生理生化特性和生物活性，从而保证蛋白质或细胞在保藏期间的稳定性。常用的冻干保 护剂包括多羟基化合物、糖类、氨基酸、聚合物、蛋白质等。多羟基化合物主要包括、甘油、甘 露醇、山梨醇、肌醇等;糖类常用的有蔗糖、葡萄糖、海藻糖、麦芽糖等;氨基酸类主要有脯氨 酸、甘氨酸、丙氨酸等;聚合物类有聚乙二醇、明胶等;蛋白质类主要有牛血清白蛋白，此外 还有吐温80、普朗尼克、维生素 C、山梨酸钾等也可用作冻干保护剂或防腐剂(孙东坡，胡一 桥.蛋白质冷冻干燥制品中的保护剂及其保护机制.药学进展，2003,27(4):201-205)。本发 明选用了蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、海藻糖、山梨酸钾、牛血清白蛋白、甘氨酸、明胶、维生素 C作 为冻干保护剂的候选试剂，通过浊度递减实验和正交设计实验选取了 18%蔗糖、6%葡萄 糖、0.3%山梨酸钾作为elysin的冻干保护剂，可使elysin在4°C条件下保存7天后，elysin 的活性维持在84.7%。有效解决elysin不能4°C下不能长期保存，酶活性很快下降的问题。
[0004] 对猪链球菌噬菌体裂解酶e lys in的冻干保护剂的筛选和应用在国内外均未报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种用于冷冻干燥的保护剂组合物。
[0006] -种用于冷冻干燥的保护剂组合物，包括如下成分:蔗糖、葡萄糖、山梨酸钾及浓 度为50mM，pH为8.0的磷酸钠缓冲液，所述的蔗糖、葡萄糖和山梨酸钾的质量浓度分别为 18%、6%、0.3%〇
[0007] 所述的浓度为50mM，pH为8.0的磷酸钠缓冲液的配方为：NaH2P〇4_12H2〇6.78g， Na2HP〇4_2H2〇 0.17g，用双蒸馏水定容至lL〇
[0008] 所述的蔗糖的化学性质稳定，对阻止蛋白质二级结构改变、冻干处理过程中及贮 藏期内蛋白质的伸展和聚集起显著作用。所述的葡萄糖在冻干过程中可部分保持无定型， 对某些蛋白质具有一定的保护作用。所述的山梨酸钾是一种常用的防腐剂，其毒性低，能够 有效地抑制霉菌、酵母菌和好氧性细菌的活性。在本发明中，三者联用可以显著保持elysin 在冻干以后的活性。
[0009] 本发明的另一个目的是提供一种制备上述组合物的方法。
[0010] 本发明提供一种用于冷冻干燥的保护剂组合物的制备方法，按照下述步骤进行： 将蔗糖、葡萄糖、山梨酸钾按照质量比18:6:0.3混匀，用50mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)溶解， 即得到冻干保护剂的组合物。
[0011] 将上述冻干保护剂组合物与所述的猪链球菌噬菌体裂解酶elysin按体积比1:1混 合后用于冷冻干燥。
[0012] 所述的冷冻真空干燥，其条件是:预冻阶段最低温度-50°C，达到最低温度后维持 3h。主干燥阶段，将隔板温度升至-20°C-15°C，真空度0. lmba，干燥4-6h，终末干燥阶段，将 隔板温度升至15_25°C，真空度0.005mba，保持5-8h。
[0013]所述的猪链球菌菌体裂解酶elysin是通过对大肠杆菌BL21原核表达的elysin 进行纯化后获得(见专利：201610021643.3)，该酶的浓度为0.12-0.35mg/mL。
[0014] 所述的方法中，冻干保护剂组合物与猪链球菌噬菌体裂解酶elysin混匀后的产物 经0.22μπι微孔滤膜过滤除菌。
[0015] 本发明的有益效果
[0016] 本发明的优点在于：
[0017] 所选用的冻干保护剂组合物能够减少elysin在冷冻干燥过程中活性降低，可使 ely sin在冷冻干燥4 °C保存7天后维持84.7%的活性；
[0018] 本发明的冻干保护剂组合物使elysin在4°C条件下保存7天，浊度递减实验中 elysin的活性维持在84.7%。有效解决elysin不能4°C下不能长期保存，酶活性很快下降的 问题；
[0019] 本发明的冻干保护剂在有效保护elysin的情况下，配制方法简单、成本较低，可以 推广使用。
【附图说明】
[0020] 图1为因素与指标关系趋势图，其中ABCD分别为蔗糖、葡萄糖、明胶、山梨酸钾。
【具体实施方式】
[0021 ]实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0022]实施例1冻干保护剂的选择与配制
[0023]用50mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)配制质量浓度为20%蔗糖、20%麦芽糖、6%葡萄 糖、20 %海藻糖、0 · 5 %山梨酸钾、1 %牛血清白蛋白、1 %甘氨酸、0 · 5 %明胶缓冲液，摩儿浓 度2mmol/L的维生素 C缓冲液，以上9种缓冲液用于筛选elysin的冻干保护剂。
[0024]将以上9种缓冲液分别与elySin(100μg/ml)等体积混合，作为9组实验组。将未加 上述9种缓冲液的elysin(50μg/ml)作为对照组1。在经过冷冻干燥以后，通过对SS2-4的浊 度递减试验检测以上9种冻干保护剂对elysin的保护效果，以未经冷冻干燥的elysin(50y g/ml)作为对照组2进行筛选浊度递减度实验。
[0025]实施例2浊度递减试验
[0026] 将猪链球菌SS2-4离心后用roS缓冲液(磷酸盐缓冲液)调节OD600至1.0-1.2,将其 加入96孔板中，每孔100μΜ再将实施例1中的9组实验组与对照组1和2取100yL加入有上述 猪链球菌SS2-4的96孔板中，每种纯化的裂解酶各做3个重复。37°C反应lh，测定0D 6QQ值，筛 选可使细菌浊度〇D_下降高的实验组试剂作为候选的冻干保护剂。实验结果见表1-1。本发 明选取了 20 %蔗糖、6 %葡萄糖、0.5 %山梨酸钾和0.5 %明胶作为候选的冻干保护剂用于下 一步的正交实验设计。
[0027]表1 -1冻干保护剂对e lys in的池度递减试验结果
[0029]实施例3不同冻干保护剂的正交试验设计
[0030]按照L9(34)正交表安排试验:选取蔗糖、葡萄糖、明胶、山梨酸钾为四因素（因素 A、 B、C、D)，各因素取三水平(水平1、2、3)，见表1-2。用50mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)与蔗糖、葡 萄糖、明胶、山梨酸钾按正交表(表1-3)的设计，配成冻干保护剂组合物，共配制9组。将以上 9组冻干保护剂组合物分别与100yg/mL elysin按1:1体积比混合。具体实验步骤，见实施例 2,将未加冻干保护剂的50μg/ml elysin作为对照组1。将实验组和对照组1做冷冻干燥处 理，再将未进行冷冻干燥50μg/ml elysin作为对照组2。随后，将实验组以及对照组1和对照 组2按实施例2进行浊度递减实验，记录实验结果，见表1-4。绘制因素与指标关系趋势图，见 图1。通过趋势图获得最优组合为，即18 %蔗糖、6 %葡萄糖、0.3 %山梨酸钾可获得 最佳保护效果。
[0031]表1-2冻干保护剂的正交试验设计
[0033] 表1_3L9(34)正交设计表
[0035] 表1_4L9(34)正交表与浊度递减实验结果
[0036]
[0037]
[0038] K1为水平1的结果之和，K2为水平2的结果之和，K3为水平3的结果之和；
[0039] Τ总和，R为极差。
[0040]实施例4冻干保护剂对elysin的4°C保存实验
[00411将加入冻干保护剂组合物的elysin作为实验组、未加冻干保护剂的50μg/ml elysin作为对照组1在冷冻干燥后，放4°C保存7天后取出，用双蒸水融化。将未冻干新鲜的 elysin用50mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)调节浓度至50μg/ml，作为对照组2,将实验组以及对 照组1和对照组2按实施例2进行浊度递减实验，记录实验结果，见表1-5。
[0042] 表1-5 4°C保存7天后浊度递减试验结果
[0044]上表说明，相比未加冻干保护剂的对照组1，实验组在冷冻干燥4°C保存7天后，可 使细菌浊度0D600的值下降61.0%，可将elysin的裂解效率保存新鲜状态的84.7%，而未加 冻干保护剂的对照组1，可使细菌浊度OD600的值下降35.1%，仅可将elysin的裂解效率保存 新鲜状态的48.8%。因此，加入冻干保护剂组合物的elysin在4°C的保存效果好于未加冻干 保护剂的elysin，冻干保护剂组合物可应用于elysin的冻干保存，有利于在4°C保存和使用 过程中，酶的活力不会显著丧失。
【主权项】
1. 一种用于冷冻干燥的保护剂组合物，其特征在于:包括如下成分:蔗糖、葡萄糖、山梨 酸钾及浓度为50mM，pH为8.0的磷酸钠缓冲液，所述的蔗糖、葡萄糖和山梨酸钾的质量浓度 分别为 18%、6%、0.3%。2. 根据权利要求1所述的一种用于冷冻干燥的保护剂组合物，其特征在于:所述的浓度 为50禮，？!1为8.0的磷酸钠缓冲液的配方为 :似!^0442!120 6.788，似2冊0411120 0.178，用 双蒸馏水定容至1L。3. 根据权利要求1所述的一种用于冷冻干燥的保护剂组合物的制备方法，其特征在于： 按照下述步骤进行:将蔗糖、葡萄糖、山梨酸钾按照质量比18:6:0.3混匀，用50mM磷酸 钠缓冲液(pH 8.0)溶解，即得到冻干保护剂的组合物。4. 根据权利要求3所述的一种用于冷冻干燥的保护剂组合物的制备方法，其特征在于： 将上述冻干保护剂组合物与所述的猪链球菌噬菌体裂解酶elysin按体积比1:1混合后 用于冷冻干燥。5. 根据权利要求3所述的一种用于冷冻干燥的保护剂组合物的制备方法，其特征在于： 所述的冷冻真空干燥，其条件是:预冻阶段最低温度-50°C，达到最低温度后维持3h;主干燥 阶段，将隔板温度升至_20°C- -15°C，真空度0.1 mba，干燥4-6h，终末干燥阶段，将隔板温度 升至 15- 25°C，真空度0.005mba，保持5-8h。
【文档编号】C12N9/88GK105950599SQ201610312034
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月12日
【发明人】王琰, 杜杉杉, 杨世兴, 郑敏, 冷靖, 李禹昕
【申请人】江苏大学