核酸扩增体系及其冻干保护剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种应用于核酸扩增体系的冻干保 护剂。
【背景技术】
[0002] 聚合酶链反应(PCR)技术基于其快速、简便、灵敏、特异等优点，自1989年开始就被 应用于医学检测和临床检验，随后很快地成为医学和诊断学的主要检测手段之一。
[0003] DNA核酸扩增，是一种分子生物学技术，用于放大扩增特定的DNA片段。利用DNA在 体外高温时变性会变成单链，低温时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至 DNA聚合酶最适反应温度，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3'）的方向合成互补链。PCR的 特点是:特异性强、灵敏度高、简便快速、纯度要求低，广泛用于各种疾病和肿瘤等的检测。
[0004] RNA核酸扩增，是将RNA的逆转录体系和DNA扩增体系相结合的技术。能够实现一步 对RNA进行检测，不但操作方便，灵敏度也得到了很大的提升，使一些极为微量RNA样品分析 成为可能。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，已广泛用于涉及到核酸的科学研究以及临床疾 病的诊断和治疗监测。
[0005]核酸分子诊断成为了诊断试剂行业的发展方向，荧光定量核酸诊断试剂是目前市 场上最先进的诊断试剂。常规检测的乙肝、丙肝、艾滋、也可用于医院、疾控等临床样本中对 各种各样的细菌、病毒感染等疾病的检测。而且相对于传统的培养、镜检、免疫学方法等来 说，核酸诊断具有其他方法无法替代的灵敏和及时等优点。
[0006]核酸诊断被广泛应用于各种病原体的检测上，但是核酸扩增反应试剂在常温下保 存不稳定，几周就失效了；在2~8°C条件下保存，保存期也只有三个月左右;_20°C条件下的 保存期虽然可以达到一年之久，但是每次使用必须要反复冻融，这对试剂的活性也有很大 的影响，并且各组分不能混合一起，用时需混合，操作麻烦等缺点，试剂盒的长期保存和长 途运输将会受到很大的限制，容易因诊断试剂保存温度不当而使其敏感性下降甚至完全失 效，最终导致疫病的检测不及时而造成疫病流行。
[0007]目前，市场上核酸扩增反应试剂缺少能在4°C或室温长期保存的方法，这也限制了 核酸诊断试剂产品的市场。。
[0008]核酸技术作为一种新生的高新技术，代表临床实验诊断学发展的又一里程碑，十 多年的临床实践表明，荧光定量核酸诊断技术已在医学基础检测和临床诊断中占据主导地 位，因此开发适用于荧光定量核酸试剂常温保存的相关技术已迫在眉睫。
【发明内容】
[0009]本发明所要解决的技术问题在于：提供了一种应用于核酸扩增体系的冻干保护 剂。本发明冻干保护剂为应用于荧光定量核酸诊断试剂的冻干技术提供了一种有效的、可 以实现的冻干体系。诊断试剂通过冷冻干燥的技术，液体试剂变成冻干粉，以冻干粉的形式 能更稳定的保存，达到现阶段核酸诊断试剂无法达到的常温运输和常温保存的目的，也减 少了试剂反复冻融。检测时只需一步水化再加入样本即可以实现检测目的，操作简单。 [0010]为解决上述技术问题，本发明提供了一种核酸扩增体系，包括:缓冲液、酶混合液、 核酸扩增反应液，和，低温冻干保护剂。
[0011] 所述缓冲液进一步包括以下组份中的一种或多种:dNTP、Mgcl2、Thris-Hcl、KC1。
[0012] 所述酶混合液进一步包括以下组份中的一种或多种：RNA逆转录酶、RAN抑制剂、 DNA聚合酶。
[0013] 所述核酸扩增反应液进一步包括以下组份中的一种或多种:上游引物、下游引物、 探针。
[0014] 所述冻干保护剂，包括:海藻糖。
[0015] 所述冻干保护剂中海藻糖使用的终浓度为1~10mm〇l/L。
[0016] 所述冻干保护剂中海藻糖使用的终浓度为1.2~5mmol/L。
[0017 ]所述冻干保护剂中海藻糖使用的终浓度为1.5~2.5mmo1 /L。
[0018]所述冻干保护剂进一步包括以下糖类/多元醇中的一种或多种：蔗糖、甘油醛、阿 拉伯糖、来苏糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、甘露糖、塔罗糖、庚糖、葡萄糖、果 糖、葡糖酸、山梨醇、乳糖、甲基α吡喃糖苷、麦芽糖、异抗坏血酸、抗坏血酸、内酯、山梨糖、葡 糖二酸、赤藓糖、苏糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、蔗糖、古罗糖、艾杜糖、塔罗糖、赤藓酮糖、 核酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、右旋糖酐40。
[0019]所述冻干保护剂进一步包括以下聚合物中的一种或多种:HES(羟乙基磺酸）、PVP(聚乙烯吡咯烷酮）、PEG(聚乙二醇）、葡聚糖、白蛋白、聚维酮K24。
[0020] 所述冻干保护剂进一步包括以下溶剂中的一种或多种：乙烯乙二醇、甘油、DMS0 (二甲基亚砜）、DMF(二甲基甲酰胺）。
[0021 ]所述冻干保护剂进一步包括表面活性剂。
[0022] 所述表面活性剂为Tween80 〇
[0023] 所述冻干保护剂进一步包括氨基酸类化合物。
[0024] 所述冻干保护剂进一步包括以下盐类中的一种或多种：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸 盐。
[0025] 所述核酸扩增体系的冻干保护剂不包括甘露醇。
[0026] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种应用于核酸扩增体系的冻干保护剂， 其特征在于，包括:海藻糖。
[0027] 所述冻干保护剂中海藻糖使用的终浓度为1~10mm〇l/L。
[0028] 所述冻干保护剂中海藻糖使用的终浓度为1.2~5mmol/L。
[0029] 所述冻干保护剂中海藻糖使用的终浓度为1.5~2.5mmol/L。
[0030] 所述冻干保护剂，进一步包括以下糖类/多元醇中的一种或多种:蔗糖、甘油醛、阿 拉伯糖、来苏糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、甘露糖、塔罗糖、庚糖、葡萄糖、果 糖、葡糖酸、山梨醇、乳糖、甲基α吡喃糖苷、麦芽糖、异抗坏血酸、抗坏血酸、内酯、山梨糖、葡 糖二酸、赤藓糖、苏糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、蔗糖、古罗糖、艾杜糖、塔罗糖、赤藓酮糖、 核酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、右旋糖酐40。
[0031] 所述冻干保护剂，进一步包括以下聚合物中的一种或多种:HES(羟乙基磺酸）、PVP (聚乙烯吡咯烷酮）、PEG(聚乙二醇）、葡聚糖、白蛋白、聚维酮Κ24。
[0032] 所述冻干保护剂，进一步包括以下溶剂中的一种或多种：乙烯乙二醇、甘油、DMSO (二甲基亚砜）、DMF(二甲基甲酰胺）。
[0033]进一步包括表面活性剂。
[0034] 所述表面活性剂为Tween80 〇
[0035] 进一步包括氨基酸类化合物。
[0036] 进一步包括以下盐类中的一种或多种:磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐。
[0037] 所述核酸扩增体系的冻干保护剂不包括甘露醇。
[0038] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种如前述任一项所述应用于核酸扩增体 系的冻干保护剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:将所述组份按照使用的浓度比混 匀，即得到冻干保护剂。
[0039] 为解决上述技术问题，本发明又提供了一种如前述任一项所述应用于核酸扩增体 系的冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤：
[0040] 步骤1:将所述组份按照使用的浓度比混匀；
[0041] 步骤2:冷冻干燥，即得到冻干保护剂。
[0042]所述冷冻干燥的步骤，进一步包括以下子步骤：
[0043]子步骤1:干燥的步骤；
[0044] 子步骤2:冻干的步骤；
[0045] 所述子步骤1中，冻干剂和核酸扩增反应试剂的体积比为3.6-6.8:13.2-16.3，所 述核酸扩增反应试剂为RNA或DNA实时荧光定量PCR反应试剂；
[0046] 所述子步骤1中，所述干燥的步骤采用冷冻真空干燥；
[0047] 所述步骤2中，所述冻干的方法包括以下阶段：
[0048] 预冻阶段:隔板温度下降到_45°C- _55°C，保持时间3-5h;
[0049] 一次升华阶段:保持2_4h;
[0050] 二次升华阶段:保持2_4h;
[00511终干燥阶段:保持2_3h。
[0052] 为解决上述技术问题，本发明再提供了一种如前述任一项所述应用于核酸扩增体 系的冻干保护剂的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0053] 步骤1:将用于核酸扩增体系的酶混合液、核酸扩增反应液、低温冻干保护液将按 照对应的浓度比混匀，即得到用于核酸扩增体系的组合物；
[0054]步骤2:冷冻干燥，即得到冻干状态的用于核酸扩增体系的组合物。
[0055] 所述冷冻干燥的步骤，进一步包括以下子步骤：
[0056] 子步骤1:干燥的步骤；
[0057]子步骤2:冻干的步骤；
[0058]所述子步骤1中，冻干剂和核酸扩增反应试剂的体积比为3.7-6.7:13.5-16.1，所 述核酸扩增反应试剂为RNA或DNA实时荧光定量PCR反应试剂；
[0059] 所述子步骤1中，所述干燥的步骤采用冷冻真空干燥；
[0060] 所述步骤2中，所述冻干的方法包括以下阶段：
[0061] 预冻阶段:隔板温度下降到-45°C- _55°C，保持时间3_5h;
[0062] 一次升华阶段:保持2_4h;
[0063] 二次升华阶段:保持2_4h;
[0064] 终干燥阶段:保持2_3h。
[0065] 为解决上述技术问题，本发明另提供了一种包括如前述任一项所述应用于核酸扩 增体系的冻干保护剂的检测试剂盒，所述检测试剂盒能够在常温下运输和/或保存。
[0066] 为解决上述技术问题，本发明又提供了一种如前述任一项所述应用于核酸扩增体 系的冻干保护剂在核酸扩增