特异性结合的多肽序列及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及与伏马毒素仏特异性结合的多肽序列。本发 明提供的能与FBd#合的噬菌体展示肽与FBi具有较高的亲和性和特异性，与传统的单克隆 抗体相比，从噬菌体展示随机多肽库中淘选与靶标结合的噬菌体展示肽具有操作简单、容 易大量制备和纯化的特点。
【背景技术】
[0002] 伏马毒素 （Fumonision FB)是由串珠镜刀菌Fusarium moniliforme Sheld和 F.proliferatum在一定温度和湿度条件下繁殖所产生的水溶性次生代谢产物，他是一类由 不同的多氢醇和丙三羧酸组成的结构类似的双酯化合物。目前，已发现的伏马毒素有FAi、 FA2、FBi、FB2、FB3、FB4、FCi、FC2、FC3、FC4 和FP^ 11 种，其中 FBi 是其主要组分。FBi对食品污染 的情况在世界范围内普遍存在，主要污染粮食作物及其相关的食品和动物饲料，包括玉米、 大麦等谷物，以及茶叶、药用植物、啤酒、动物内脏等。伏马毒素对人、畜不仅是一种促癌物， 而且完全是一种致癌物。动物实验和流行病学实验表明，伏马毒素主要损害肝肾功能，能引 起马脑白质软化症和猪肺水肿等，并与我国和南非部分地区高发的食道癌有关，现已引起 世界范围的广泛注意。
[0003] 目前伏马毒素出的检测方法主要涉及仪器分析法和免疫分析法。仪器分析检测方 法包括质谱(MS)、气相色谱(GC)、液相色谱(LC)、气相色谱与质谱联用(GC/MS)技术和液相 色谱与质谱联用(LC/MS)技术，仪器分析检测方法虽然具有灵敏度和特异性好，但是样品处 理步骤繁琐、费时、仪器昂贵、而且需要专业人员和在快速检测中难以普及使用。酶联免疫 吸附检测技术（enzyme-1 inked ImmunosorBent assay;ELISA)免疫是一种基于抗原、抗体 特异性结合而建立的检测方法，具有高通量、速度快、操作简便、检测成本低和可定量等特 点，特别适用于大量样本的快速筛选。但是目前用于ELISA检测试剂盒的各类毒素的单克隆 抗体主要来源于小鼠杂交瘤细胞，因此在筛选单克隆抗体长期复杂的过程，即耗费时间，又 耗费财力物力。
[0004] 菌体展示技术(phage display technology)是20世纪80年代逐步建立并发展 起来的一项分子生物学新技术。它以噬菌体或噬粒为载体，使外源肽或蛋白质的基因与噬 菌体表面特定蛋白质基因在其表面进行融合表达，进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽 或蛋白质的噬菌体。噬菌体展示技术的出现，改变了真菌毒素抗原和抗体制备的传统途径， 利用噬菌体展示技术可制备抗体、模拟抗原表位，代替真菌毒素的标准品，建立无毒ELISA 检测方法。ELLSA检测方法快速、灵敏、操作简便，且对样品的纯度要求不高，适合样品的初 步筛查检测，但该方法由于目前用于ELISA检测试剂盒的各类毒素的单克隆抗体主要来源 于小鼠杂交瘤细胞，因此在筛选单克隆抗体长期复杂的过程，即耗费时间，又耗费财力物 力。所以有待进一步完善或寻求相关替代单克隆抗体的元件及分析技术。
[0005] 目前利用噬菌体展示技术已经制备玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉 毒素出等毒素的单链抗体和得到赭曲霉毒素、黄曲霉毒素出、玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素、桔 青霉素、等毒素模拟抗原表位。另外，利用病原菌、真菌毒素或小分子物质(毒素、除草剂、植 物生长激素、咖啡因等)与其抗体形成的复合物对噬菌体展示随机多肽库进行亲和筛选，已 经筛选出能够与其结合的噬菌体展示多肽，并且已经建立基于噬菌体展示肽竞争性酶联免 疫吸附检测法和胶体金试纸条检测方法。与传统的单克隆抗体相比，从噬菌体展示随机多 肽库中淘选与靶标结合的噬菌体展示肽具有操作简单、容易大量制备和纯化的特点。但目 前为止，尚未见具有与伏马毒素也特异性结合的多肽及其应用。
【发明内容】
[0006] 本发明提供一种与伏马毒素也特异结合的多肽序列，所述多肽序列为噬菌体展示 肽，由12个氨基酸组成。
[0007] 所述的与伏马毒素也特异结合的多肽序列共有五种，其氨基酸序列如SEQ ID N0: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4及SEQ ID N0:5所示。
[0008] 所述五种多肽序列对应的核苷酸序列按次序如SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10所示。
[0009] 为实现上述目的本发明采用以下技术方案：
[0010] -种与伏马毒素出特异结合的多肽序列，制备所述多肽的方法如下：
[0011] (1)将FBi-BSA包被在酶标板上，用5 %BSA封闭酶标板，将噬菌体展示随机12肽库 加入包被和封闭后的酶标板中进行亲和淘选，淘选过程按照"吸附-洗涤-洗脱-扩增"的循 环进行，经过4轮的淘选；
[0012] (2)轮淘选后，挑取30个克隆进行扩增、质粒提取、测序，得到5种序列；
[0013] (3)采用ELISA方法检验上述的5种噬菌体展示肽与FBi结合的亲和性和特异性。
[0014]所述多肽序列与伏马毒素 FBA#异结合，用于检测或鉴定伏马毒素 Bu
[0015] 本发明的有益效果在于:本发明提供的能与FBd#合的噬菌体展示肽与FBi具有较 高的亲和性和特异性，与传统的单克隆抗体相比，从噬菌体展示随机多肽库中淘选与靶标 结合的噬菌体展示肽具有操作简单、容易大量制备和纯化的优点。
【附图说明】
[0016] 图1为噬菌体展示肽1号与FB^BSA亲和性测定；
[0017]图2为噬菌体展示肽2号与FB^BSA亲和性测定；
[0018]图3为噬菌体展示肽3号与FB^BSA亲和性测定；
[0019] 图4为噬菌体展示肽4号与FBrBSA亲和性测定；
[0020] 图5为噬菌体展示肽5号与FB^BSA亲和性测定；
[0021 ]图6为噬菌体展示肽1号与FBrBSA特异性测定；
[0022]图7为噬菌体展示肽2号与FBi-BSA特异性测定；
[0023]图8为噬菌体展示肽3号与FBrBSA特异性测定；
[0024]图9为噬菌体展示肽4号与FBrBSA特异性测定；
[0025]图10为噬菌体展示肽5号与FBrBSA特异性测定。
【具体实施方式】
[0026] 本发明提供一种与伏马毒素也特异结合的多肽序列，所述多肽序列为噬菌体展示 肽，由12个氨基酸组成，所述与伏马毒素出特异结合的多肽序列共有五种。所述的与伏马毒 素仏特异结合的多肽序列共有五种，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQIDN0:lSSEQIDN0:5m*。
[0027] 所述五种多肽序列对应的核苷酸序列按次序如SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ IDN0:8、SEQIDN0:9&SEQIDN0:l(^；f*。
[0028] 为实现上述目的本发明采用以下技术方案：
[0029] -种与伏马毒素出特异结合的多肽序列，制备所述多肽的方法如下：
[0030] (1)将FBi-BSA包被在酶标板上，用5%BSA封闭酶标板，将噬菌体展示随机12肽库 加入包被和封闭后的酶标板中进行亲和淘选，淘选过程按照"吸附-洗涤-洗脱-扩增"的循 环进行，经过4轮的淘选；
[0031] (2)轮淘选后，挑取30个克隆进行扩增、质粒提取、测序，得到5种序列；
[0032] (3)采用ELISA方法检验上述的5种噬菌体展示肽与FB!结合的亲和性和特异性。
[0033]所述多肽序列与伏马毒素 FBA#异结合，用于检测或鉴定伏马毒素 Bu
[0034]以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明，具体步骤如下：
[0035] 一、实验准备
[0036] 主要试剂：
[0037] 蛋白胨（0X0ID公司）、酵母提取物（0X0ID公司）、琼脂粉（Amresco公司）、IPTG (Amresco公司）、Xgal(Amresco公司）、PEG8000(Sigma有限公司）、辣根过氧化物酶标记的抗 M13单克隆抗体(GE公司），噬菌体展示随机十二肽库购自NEB公司(NEB#E8110S)。
[0038] 主要试剂配方：
[0039] l.PEG/NaCl:20%(w/v)PEG-8000,2.5M NaCl,高压灭菌，室温储藏；
[0040] 2.IPTG/Xgal配方：将1.25g IPTG和lg Xgal溶于25mL二甲基甲酰胺（DMF)中，-20 °C避光保存；
[0041 ] 3.四环素贮液:20g/mL，溶于50%乙醇中，-20°C避光贮存，使用前摇匀；
[0042] 4. LB培养基：10g/L细菌胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，高压灭菌，室温储 藏；
[0043] 5. LB/IPTG/Xgal平板：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，15g/L琼脂粉， 高压灭菌，冷却至70°C以下，加入lmL IPTG/Xgal，混匀倒平板，平板4°C避光保存；
[0044] 6 · LB-Tet平板:LB液体培养基加15g//L琼脂粉，高压灭菌，冷却至70°C以下，加入 lmL四环素贮液，混匀倒平板，平板4 °C避光保存；
[0045] 7.封闭液:含有5%83厶，0.151，？!17.4?83，过滤除菌，4°(：保存；
[0046] 8.显色液：25mL 0.1M pH 5.5柠檬酸盐缓冲液中加入0.411^，611^/11^四甲基联苯 胺，O.lmL l%H2〇2。
[0047]二、伏马毒素出特异性结合多肽的淘选和制备 [0048] 1.伏马毒素出特异性结合多肽的淘选
[0049] 按照"吸附一洗涤一洗脱一扩增"的循环进行，经过4轮的淘选，具体操作如下：
[0050] (1)将FBi-BSA偶合物稀释到2yg/mL，加入到微孔板，1 ΟΟμL孔，4 °C包被过夜；同时 将2yg/mL BSA加入到微孔板，100μL7孔，4 °C包被过夜;FBi-BSA偶合物和BSA各加48个孔；
[0051 ] (2)取少量大肠杆菌ER2738涂在LB-Tet平板上，37°C培养过夜；
[0052] (3)将BSA包被的酶标板用含0. l%Tween-20的PBST洗涤6次，备用；
[0053] (4)将BSA包被的酶标板没孔加入100yL(l X 10npfu/mL)的噬菌体，室温轻微震荡1 小时；
[0054] (5)将?81-834偶合物包被的酶标板用含0.1%了￥6611-20的1^31'洗涤6次，31^11/次， 甩空微孔板，加入300yL的封闭缓冲液，37°C孵育1小时，用含0.1%TWeen-20的TOST洗涤6 次，3min/次；
[0055] (6)将步骤(4)中酶