一种同时检测不同基质中药中伏马毒素B₁、B₂的方法

专利名称：一种同时检测不同基质中药中伏马毒素B₁、B₂的方法
技术领域：
本发明涉及ー种同时检测不同基质中药中伏马毒素B” B2的方法，特別是采用了在线衍生高效液相荧光检测的方法，能更为简便的检测伏马毒素B1. B2。
背景技术：
伏马毒素是ー组主要由串珠镰刀菌产生的水溶性代谢物，是ー类具有严重細胞毒性的真菌毒素，在众多的真菌毒素中被认为是对人类及牲畜威胁较为严重的毒素之一。我国拥有丰富的中药材资源，中药材在生长、采收、加工、贮存等过程中都可能感染伏马毒素。 因此，很有必要对中药中伏马毒素进行研究，建立毒素的检测方法，制订其合理的限量标准，以保证中药的安全有效。至1988年南非和美国研究人员从发霉的玉米中分离出伏马毒素B1,到目前为止发现的伏马毒素有FApFApFBpFBrFBpFBpFCpFCrFCpFCVFP等共11种。其中FB1毒性最強，也是其主要组分，占总量的70% 80%，其次是FB2。伏马毒素主要污染玉米及其制品，还可污染小麦、稻米等粮食作物及其制品。另外，在动物饲料和某些香辛料如八角、桂皮及药食两用植物如芦笋中也有检出伏马毒素的报道。这些香辛料及药食两用植物在人们生活中被广泛的应用。因此，这些香辛料及药食两用植物中可能存在的伏马毒素必然会给人们的健康带来危害。研究证实伏马毒素具有神经毒性、肺毒性、免疫系统毒性、致癌性等。伏马毒素可导致马白脑软化症(ELEM)、猪肺水肿综合症(PPE)，并被怀疑可诱发人类的食道癌、肝癌及胎儿神经管畸形等疾病。1993年，在法国里昂，国际癌症研究中心(IARC)将伏马毒素列为2B类致癌物质(即人类可能致癌物)。

发明内容
到目前为止，国内外报道的方法大多限于对食品、农产品以及饲料中伏马毒素B1. B2的分析，也偶见对中药材的检测，但是对于伏马毒素も、B2的检测，基本上采用的是柱前衍生的方式居多。运用在线衍生方法对中药中伏马毒素B1.も的分析，目前还是空白。现有的測定食品、农产品以及饲料中的伏马毒素B1. B2的方法，由于样品基质相对简单，干扰较小，一般都比较容易測定。衍生化后的伏马毒素B1^2稳定性不好，在两分钟内进样才能得到较好的重现性，而且部分衍生化试剂的毒性较大。本发明克服现有技术的不足，选择了适用于中药中伏马毒素も、も的提取、浄化方法，采用了在线衍生化的方法，优化了液相色谱条件，保证样品处理快捷简便，含量测定结果准确性高，重现性好。故采用该方法能更加准确的对不同基质中药中的伏马毒素B1^2进行測定。具体的不同基质中药中伏马毒素B1J2測定的方法，可以通过以下步骤实现仪器、药品及材料仪器岛津LC-20AT高效液相色谱仪，日本岛津公司；荧光检测器RF_10AXl，日本岛津公司；
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柱后衍生反应箱CRB-6A，日本岛津公司；API4000三重四级杆质谱仪；Qilinbeier 旋涡混合器；Heraeus Multifuge X3R 低温高速离心机；WH-861型旋涡混合器，金坛市盛蓝仪器制造有限公司；PGG-OlD型干式氮吹仪，天津艾维欧科技发展有限公司；ZD-9556水平摇床，太仓市科教器材厂；Fumonisin Test免疫亲和柱，美国VICAM公司；微纤维滤纸，美国VICAM公司。对照品伏马毒素B1, B2标准品购于锐鑫农公司，纯度彡99 % ；邻苯ニ甲醛(OPA)，美国 AflaAesar公司；色谱纯甲醇(B&J)；色谱纯乙腈(B&J)冰(娃哈哈)；磷酸ニ氢钠；磷酸氢 ニ钠；磷酸ニ氢钾；氯化钠；氯化钾；氢氧化钠；盐酸；磷酸；四硼酸钠；2-巯基乙醇。样品所测样品分别购自江西樟树、海南、北京以及贵州遵义等地，所有样品均为市场上随机购买而来，低温干燥后备用。1、用在线衍生高效液相色谱-荧光检测法测定中药中伏马毒素B1. B2 ；a.色谱条件用Synergi C18柱m，250_X4. 6mm)分离，柱温为40°C，柱后反应箱进行衍生化(反应温度100°c )，荧光检测器检測。流动相为PH为3. 15，0. lmol/L的磷酸ニ氢钠溶液和甲醇，流速为0. 8ml/min进行梯度洗脱。一开始由60 %的甲醇在22分钟内升至85 % ； 再由85%的甲醇跑5分钟，然后在2分钟内由85%的甲醇瞬间降为60%，最后由60%的甲醇平衡13分钟。衍生化试剂流速为0. 6ml/min,反应体积为0. 6ml。荧光检测器的激发波长为335nm，发射波长为440nm。b.溶液配制伏马毒素B1J2标准品的配制分别将ImgFB1JB2固体粉末，用乙腈-水(1 1， V/V)溶解，定容于10mL，配成ΙΟΟμ g/mL的储备液，4°C避光保存。衍生化试剂的配制称取IOOmg的邻苯ニ甲醛，溶于20mL甲醇，加入到0. 05mol/L 的四硼酸钠溶液中，定容至IOOOmL,再加入2-巯基乙醇500 μ 1，混勻，过0. 45 μ m滤膜，室
温保存。PBS缓冲液的配制称取磷酸氢ニ钠1. 2g，磷酸ニ氢钾0. 2g，氯化钠8g，氯化钾 0. 2g，溶解于990mL水中，用盐酸调节pH为7. 0，用水定溶到1000mL。磷酸ニ氢钠溶液的配制称取15. 6g磷酸ニ氢钠，用水溶解，定容至IOOOmL,配成 0. lmol/L溶液，用磷酸调节pH为3. 15。c.样品溶液的制备样品提取精密称取样品10g，2g氯化钠，加入40ml甲醇/水G 1)中，水平摇床振摇40分钟，槽纹滤纸过滤，收集滤液。取上述滤液5ml于50ml锥形瓶中，加入20ml的 PBS,振荡混勻，微纤滤纸过滤，收集滤液备用。样品净化将IOmL玻璃注射器筒与亲和柱相连，移取上步5mL样品提取液于玻璃注射器针筒中，拔掉亲和柱底帽。控制压力使样液以1滴/秒的流速全部通过亲和柱，直至空气进入。取下亲和柱，用PBS将亲和柱上部注满，再把亲和柱跟玻璃注射器连接上，用 IOmLPBS溶液以2滴/秒的流速淋洗亲和柱，直至空气进入，弃去全部流出液。再用IOmLPBS 重复淋洗柱子一次，弃去全部流出液。准确加入IOmL甲醇以lmL/min的流速洗脱，收集洗脱液，60°C氮气吹干。残留物用ImL甲醇水(1 1)溶解，过0.45 μ m针孔滤膜，等待进样。d.測定法分別精密吸取对照品和样品溶液20 μ L，注入高效液相色谱仪，測定伏马毒素B1,
も含量。2、用高效液相色谱-质谱联用检测法对阳性结果进行确证a.液相条件色谱柱为 Phenomenex Gemini 3u C18 IlOA column (20mm*2. 00mm, 3micron),流动相A为水(含0. 甲酸)，流动相B为乙腈(含0.1%甲酸)。流速为0.4mL/min，洗脱梯度为 0. Olmin 10% B,0. 6min 10% B, 1. 5min 95% B, 3. Omin 95% B, 3. Olmin 10% B, 4. 50min 10B%，结束。b.质谱条件采用ESI电离源，正离子扫描，MRM检测模式，三个离子对监測。伏马毒素 B1 :m/z722. 4 — 352. 5 碰撞电压为 51eV ；m/z 722. 4 — 334. 6 碰撞电压为 ；m/z 722. 4 — 704. 5碰撞电压为39eV。伏马毒素もm/z 706. 5 — 336. 7碰撞电压为53eV ；m/z 706. 5 — 354. 5 碰撞电压为 ；m/z 706. 5 — 318. 3 碰撞电压为 5kV。c.測定法分別精密吸取对照品和阳性样品溶液10 μ L，注入高效液相色谱-质谱联用系统， 測定。经过多次重复试验，确认方法简便，结果准确，可作为不同基质中药中伏马毒素 B1^B2的测定方法。本发明提供了中药中伏马毒素B1. B2的在线衍生高效液相色谱-荧光检测法；中药中伏马毒素B1.も的高效液相色谱-质谱联用法对阳性结果确证。结果准确，重现性好， 可作为不同基质中药中伏马毒素B”も的測定方法。1、在线衍生高效液相色谱-荧光检测法测定中药中的伏马毒素B1, B2 ；(1)衍生化试剂的选择对于伏马毒素B” B2由于本身没有荧光吸收，所以要进行衍生化反应以后才能反应。伏马毒素も、も的衍生化试剂有荧光胺、邻苯ニ甲醛(ΟΡΑ)、萘-2，3-ニ羧酸(NDA)、9-芴基甲基-氯甲酸酷(FMOC)等等。本发明是运用的最常用的衍生化试剂邻苯ニ甲醛(ΟΡΑ)。 原因是此衍生化试剂灵敏性高，所用的试剂毒性相对较小，比较容易购买到。(2)衍生化反应过程的考察采用了正交实验考察了三因素(衍生试剂流速、反应箱温度和反应体积)三水平的影响。以伏马毒素B1^2的峰面积综合评定为指标进行正交实验，考察衍生化反应的最佳条件。正交实验结果见表1-1、表1-2。表1-1伏马毒素B1,も正交实验结果
权利要求
1.ー种同时检测不同基质中药中伏马毒素も、B2的方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)用在线衍生高效液相色谱-荧光检测法测定中药中伏马毒素B1.B2 ；(2)用高效液相色谱-质谱联用检测法对阳性结果进行确证；
2.根据权利要求1的同时检测不同基质中药中伏马毒素B1.B2的方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)用在线衍生高效液相色谱-荧光检测法测定中药中伏马毒素B1.B2a.色谱条件用Synergi C18柱G μ m，250_X4. 6mm)分离，柱温为40°C，柱后反应箱进行衍生化 (反应温度100°C )，荧光检测器检測。流动相为pH为3. 15，0. lmol/L的磷酸ニ氢钠溶液和甲醇，流速为0. 8ml/min进行梯度洗脱。一开始由60%的甲醇在22分钟内升至85%;再由85%的甲醇跑5分钟，然后在0.01秒内由85%的甲醇瞬间降为60%，最后由60%的甲醇平衡13分钟。衍生化试剂流速为0. 6ml/min,反应体积为0. 6ml。荧光检测器的激发波长为335nm，发射波长为440nm。b.溶液配制伏马毒素B1J2标准品的配制分别将ImgFB1Jh固体粉末，用乙腈-水(1 LV/V) 溶解，定容于10mL，配成100μ g/mL的储备液，4°C避光保存。衍生化试剂的配制称取IOOmg的邻苯ニ甲醛，溶于20mL甲醇，加入到0. 05mol/L的四硼酸钠溶液中，定容至IOOOmL,再加入2-巯基乙醇500 μ 1，混勻，过0. 45 μ m滤膜，室温保存。PBS缓冲液的配制称取磷酸氢ニ钠1. 2g，磷酸ニ氢钾0. 2g，氯化钠8g，氯化钾0. 2g， 溶解于990mL水中，用盐酸调节pH为7. 0，用水定溶到1000mL。磷酸ニ氢钠溶液的配制称取15. 6g磷酸ニ氢钠，用水溶解，定容至IOOOmL,配成 0. lmol/L溶液，用磷酸调节pH为3. 15。c.样品溶液的制备样品提取精密称取样品10g，2g氯化钠，加入40ml甲醇/水G 1)中，水平摇床振摇40分钟，槽纹滤纸过滤，收集滤液。取上述滤液5ml于50ml锥形瓶中，加入20ml的PBS， 振荡混勻，微纤滤纸过滤，收集滤液备用。样品净化将IOmL玻璃注射器筒与亲和柱相连，移取上步5mL样品提取液于玻璃注射器针筒中，拔掉亲和柱底帽。控制压力使样液以1滴/秒的流速全部通过亲和柱，直至空气进入。取下亲和柱，用PBS将亲和柱上部注满，再把亲和柱跟玻璃注射器连接上，用IOmLPBS 溶液以2滴/秒的流速淋洗亲和柱，直至空气进入，弃去全部流出液。再用IOmLPBS重复淋洗柱子一次，弃去全部流出液。准确加入IOmL甲醇以1滴/秒的流速洗脱，收集洗脱液， 60°C氮气吹干。残留物用ImL甲醇水(1 1)溶解，过0.45 μ m针孔滤膜，等待进样。d.測定法分別精密吸取对照品和样品溶液20 μ L，注入高效液相色谱仪，測定伏马毒素B” B2含里。(2)用高效液相色谱-质谱联用检测法对阳性结果进行确证 a.液相条件色谱柱为 Phenomenex Gemini 3u C18 IlOA column (20mm*2. 00mm, 3micron),流云力相 A 为水(含0. 甲酸)，流动相B为乙腈(含0.1%甲酸)。流速为0.4mL/min，洗脱梯度为 0. Olmin 10% B,0. 6min 10% B, 1. 5min 95% B, 3. Omin 95% B, 3. Olmin 10% B, 4. 50min 10B%，结束。b.质谱条件采用ESI电离源，正离子扫描，MRM检测模式，三个离子对监測。伏马毒素B1 :m/z 722. 4 — 352. 5 碰撞电压为 51eV ；m/z 722. 4 — 334. 6 碰撞电压为 55eV ；m/z 722. 4 — 704. 5 碰撞电压为39eV。伏马毒素も:m/z 706. 5 — 336. 7碰撞电压为53eV ；m/z 706. 5 — 354. 5 碰撞电压为55eV ；m/z 706. 5 — 318. 3碰撞电压为55eV。c.測定法分別精密吸取对照品和阳性样品溶液10 μ L，注入高效液相色谱-质谱联用系统，确证伏马毒素B1J215
3.根据权利要求2所诉的同时检测不同基质中药中伏马毒素B1.も的方法，其特征在干a.提取溶剂采用甲醇/水G 1，V/V)水平摇床振摇提取；b.高效液相-荧光检测时采用流动相为pH为3.15，0. lmol/L的磷酸ニ氢钠溶液和甲c.高效液相-荧光检测采用的是在线衍生的衍生方式；d.该方法采用的衍生化试剂的配置方法是称取IOOmg的邻苯ニ甲醛，溶于20mL甲醇，加入到0. 05mol/L的四硼酸钠溶液中，定容至IOOOmL,再加入2-巯基乙醇500 μ 1，混勻，过0. 45 μ m滤膜，室温保存。e.高效液相色谱-质谱联用法中采用ESI电离源，正离子扫描，MRM检测模式。
全文摘要
一种检测不同基质中药中伏马毒素B1、B2的方法，即在线衍生高效液相荧光检测的方法。包括样品的提取，纯化及检测，所述的样品加氯化钠后采用甲醇-水(4∶1，V/V)水平摇床振摇提取，过滤，取一定量滤液加水稀释，微纤滤膜过滤，免疫亲和柱净化后氮气吹干，用甲醇溶解后进样。其中衍生化试剂的配置为取适量的邻苯二甲醛，用甲醇溶解，然后加入到适量四硼酸钠溶液中，再加入2-巯基乙醇，混匀，过微孔滤膜。所述样品测定方法包括用C18反相色谱柱分离，以甲醇和磷酸二氢钠为流动相，进行梯度洗脱。柱后与衍生化试剂反应，荧光检测器进行检测。高效液相-质谱联用对阳性样品进行确证。
文档编号G01N30/06GK102590364SQ20111000080
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月5日 优先权日2011年1月5日
发明者杨美华, 谢婷婷 申请人:中国医学科学院药用植物研究所