一种治疗内毒素血症的中药有效部位的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种治疗内毒素血症的中药有效部位的制备方法,属于中药制药【技术领域】。将荆三棱干燥块茎粉碎,加入3倍量85％的乙醇水溶液浸泡24h,然后回流提取2次,每次2h,滤过,合并提取液,浓缩。浓缩后的提取液加入其体积1.5倍量的水,分别用极性由小到大的萃取溶剂进行萃取,得到萃取液,然后经浓缩后上正相柱层析,用洗脱溶剂洗脱。收集到的洗脱液经干燥,得到荆三棱有效部位。以上收集到的萃取液中的萃取溶剂为乙酸乙酯；所述的洗脱溶剂至少包括由体积比为100：1、100：10、100：12的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂。经药理实验表明,本发明方法制备的荆三棱有效部位具有很好的抗内毒血症的作用。
【专利说明】一种治疗内毒素血症的中药有效部位的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及从中药中提取有效部位的制备和应用领域，具体的说是涉及从荆三棱植物中得到的一种能治疗内毒素血症的有效部位及其制备方法。
【背景技术】
[0002]内毒素存在于革兰氏阴性菌(gram-negative bacteria, G_细菌)菌体的细胞壁内，由细菌死后的细胞壁崩解时释出，活菌亦可以发疱形式将内毒素释出，其化学成分为脂多糖(lipopolysaccharide’LPS)，脂多糖的类脂A是LPS的“毒力中心”。少量的内毒素对促使肝脏网状内皮系统处于激活状态有一定意义，但是当大量的内毒素进入血循环时，会激发机体免疫细胞大量释放多种细胞因子，破坏机体炎症反应平衡，产生内毒素血症，从而造成广泛的病理反应，如全身炎症反应综合征(SIRS)、多器官功能不全综合征(MODS)、多器官功能衰竭(MOF)等。近年来，许多研究表明感染性休克和继发性多功能不全综合征是脓毒症患者的主要死亡原因。以往在防治与治疗内毒素血症时，往往从抑制产生内毒素的革兰氏阴性菌的菌群增殖和减少肠道内毒素的吸收为出发点，如通过补充肠道正常菌群、保持肠粘膜的稳定性来减少肠道内毒素的产生和吸收。以上治疗方法往往用到抗生素，但是大量的抗生素的应用会出现耐药性菌，同时被杀死的革兰氏阴性菌会突然释放大量内毒素引起内毒素血症的亢进或内毒素休克。因此在随后的大量研究中，开发了一些其他药物，如直接拮抗 内毒素的类脂A结构类似物；具有杀菌、中和内毒素、抑制免疫细胞活性作用的抗内毒素蛋白及多肽类。然而临床研究表明，迄今为止，还没有一种这些类型的药物能够显著降低内毒素血症患者的死亡率。针对内毒素血症引起全身炎症的反应，近些年学者提出了多靶点药物可能是防治与治疗内毒素血症的一个方向。中药具有多靶点作用，对以中医理论表述病机为“热毒内蕴、瘀血内阻”的内毒素血症的防治与治疗具有重要价值。
[0003]荆三棱(Scirpus yagara Ohwi)为莎草科薦草属植物，其干燥块莖在唐代就作为中药三棱使用，是三棱最早使用的品种。其在我国的东北、浙江、江苏、安徽等地区均有分布。荆三棱，性平、味苦，入肝、脾经，具有破血行气、消积止痛功能，多用于月经不调，积聚结块等病症，是临床常用的活血化瘀中药。目前已从荆三棱块茎中分离得到有黄酮类、苯丙素类、二苯乙烯类、4'-苯基异香豆素类、酚酸类等化合物(Kangkun, et al.Nat Prod Res Dev, 2008，20:639-640, 649 ;张铁军，等.现代药物与临床，2009,24(1):36-38;崔晓东，等.中国药学学报，2012，47 (24):1987-1989 ；QiaoliLiang, et al.Fitoterapia, 2013, 84(1):170-173)。近些年国内外学者发现部分二苯乙烯类、4'-苯基异香豆素类和酚酸类化合物具有抗炎、抗HIV等方面的药理作用(Li Ou, etal.Biol.Pharm.Bull, 2003, 26 (11):1511-1516 ；Gu-xunYang, et al.Planta Med, 2005, 71:569-571)。迄今，尚未见到有关荆三棱有效部位具有治疗内毒素血症的报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种抗内毒素血症的中药有效部位的制备方法。本发明的制备方法工艺操作简单，能够提供性能稳定、药理活性好的荆三棱植物有效部位。
[0005]一种治疗内毒素血症的中药有效部位的制备方法，包括以下步骤:
[0006](I)提取:取荆三棱的干燥块茎，粉碎，用提取溶剂浸泡过夜，再用提取溶剂加热回流提取，合并提取液，减压浓缩至无醇味。
[0007](2)柱层析:将步骤(I)的浓缩液加1.5倍水稀释成悬浮液，再分别用极性由小到大的萃取溶剂进行萃取，得到萃取液，萃取液经浓缩后，上正相柱层析用洗脱溶剂进行洗脱；收集洗脱液，干燥，得到荆三棱有效部位。
[0008]上述步骤(I)所述的提取溶剂为乙醇水溶液，该提取溶剂使用安全廉价；其浓度为70%-95%，该浓度范围内的乙醇水溶液对植物组织的渗透性较好，非常适合荆三棱等块茎类药材的提取，从而能充分的获取荆三棱有效部位的活性成分。
[0009]上述步骤(I)每次加入相当于药材的3-4倍重量的提取溶剂，在90°C-100°C加热回流提取，每次提取时间为2-3h，提取2-3次。
[0010]上述步骤⑵所述的萃取溶剂至少包括乙酸乙酯。
[0011]上述步骤(2)所述的正相柱层析为硅胶柱层析，硅胶目数为100-200目，洗脱溶剂至少包括由体积比为100 =UlOO =IOUOO:12的石油醚与乙酸乙酯组成的洗脱溶剂。
`[0012]洗脱溶剂有比较严格的要求，并对体积比也有所限制，该洗脱溶剂洗脱能力中等，从而能够集中得到性能稳定、药理活性好的荆三棱有效部位。当选择的洗脱溶剂极性太大，能够得到过多与所要药理活性无关的物质`，从而整体的降低有效部位物质浓度，反之洗脱溶剂极性太小，就不能充分得到所要的有效部位。
[0013]每次加入相当于药材的3-4倍重量的提取溶剂，在90°C-100°C加热提取，每次提取的时间为2-3小时，提取2-3次。在这样的提取条件下，不但节省了药材和提取溶剂的使用量，而且能充分将药材中有效部位提取，提高了提取率。
[0014]所用的洗脱溶剂包括由体积比为100 =OUOO =UlOO:2,100:4、100:6、100:8、100 =IOUOO:12的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂，并按极性由小到大依次进行梯度洗脱。通过薄层色谱(TLC)检视荆三棱有效部位位于由体积比为100:1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂及由体积比为100 =IOUOO:12的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂洗脱后的洗脱液中，合并以上三部分洗脱液。
[0015]所述的制备方法制备的荆三棱有效部位，含有4,-苯基异香豆素类、二苯乙烯类，酚酸类的化合物。
[0016]本发明中的荆三棱有效部位可制成药剂学上任何可接受的制剂，例如制成口服给药制剂:片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂、口服液等；制备成直肠给药制剂:栓剂等；制备成皮肤给药制剂:膏剂、乳剂、贴剂等；制备成注射给药制剂:肌肉注射剂、静脉注射剂
坐寸ο
[0017]本发明中的荆三棱有效部位在药剂学上可以接受的载体包括但不限于:赋形剂，如淀粉及其衍生物、糊精等；崩解剂，如羧甲基纤维素钠等；润滑剂，如硬脂酸镁等；包糖衣材料，如蔗糖、滑石粉、明胶、色素等；其他如缓冲液、盐水等。
[0018]所述的制备方法制备的荆三棱有效部位在内毒素血症小鼠的实验研究中表明本发明的荆二棱有效部位具有抗内毒素血症功效。在内毒素血症小鼠的实验研究中，40只小鼠随机分成4组，每组10只，分别为对照组、模型组、给药低剂量组、给药高剂量组，以各组小鼠成活率为指标，在造模后观察各组小鼠7天，最后对照组小鼠的成活率为100%，模型组为0%，给药低剂量组为60%，给药高剂量组为70%。
[0019]与现有技术相比，本发明具有以下优点:本发明提供的荆三棱有效部位，生理活性强，具有质量可控、剂量小、使用方便等优点，有别于传统中药的粗、大、黑的落后面貌。
[0020]本发明所用的荆三棱在我国东北、内蒙古、浙江、江苏等地都有分布，其自然资源丰富，价廉易得；薦草属植物是草本植物，再生能力强，即使进行规模化生产也不会造成资源枯竭，对环境影响也较小；本发明提供的荆三棱有效部位的制备方法操作简单，生产成本低，适用于工业化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]见说明书附图:荆三棱有效部位高效液相色谱图【具体实施方式】
[0022]以下通过具体实施例对本发明的内容作进一步详细的说明，但这些实施例绝不应该被理解为对本发明的限制。本领域的技术人员在不脱离本发明上述思想情况下，对本发明实施所做的任何变动，均包含在本发明之内。
[0023]实施例1抗内毒素血症有效部位的制备
[0024](I)提取:取荆三棱干燥块茎20kg，粉碎，用3倍量85%的乙醇水溶液浸泡I天后，在90°C加热回流提取，每次提取时间为2h，总共提取2次，合并2次提取液。
[0025](2)柱层析:将步骤(I)得到的提取液减压浓缩至无醇味，浓缩液加1.5倍水稀释成悬浮液，再分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，乙酸乙酯部位萃取液合并浓缩得浸膏90.5g。将乙酸乙酯部位浸膏进行正相硅胶(100-200目)柱层析，然后分别使用多个不同的洗脱溶剂进行洗脱，各个洗脱溶剂都是由石油醚与乙酸乙酯组成，且各个洗脱溶剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比分别为 100:0，100:1，100:2，100:4，100:6，100:8，100:10，100:12，并按极性从小到大依次进行梯度洗脱。薄层色谱(TLC)检视荆三棱有效部位黄绿色斑点与暗斑分别集中于石油醚和乙酸乙酯体积比为100:1的洗脱溶剂的洗脱液以及石油醚和乙酸乙酯的体积比为100 =IOUOO:12的洗脱溶剂的洗脱液，收集三部分洗脱液，用旋转蒸发仪在60°C减压浓缩30min，即得荆三棱有效部位14.0g。
[0026]减重法精密称取实施例1制备的荆三棱有效部位11.04mg,加色谱甲醇定容至IOml的容量瓶内，取少量定容后的浸膏溶液，用Waters2996HPLC分析，液相色谱条件:流速为0.5ml / min ;紫外吸收波长:300nm ;洗脱体系为甲醇-水；甲醇的质量分数为10%-100% ;洗脱时间:0-65min。其高效液相色谱图见说明书附图。
[0027]实施实例2荆三棱有效部位的体内抗内毒素血症实验
[0028]实验材料
[0029](I)实验用药液的配制:分别减重法精密称取荆三棱有效部位适量两份，分别加适量0.5% CMC-Na溶液，配成低、高两个浓度的药液。
[0030](2)实验用内毒素:大肠杆菌脂多糖(LPS，055:B5,美国Sigma公司)。
[0031](3)实验动物:BALB / c雌性小鼠，购自于南京青龙山实验动物中心，合格证为:SOXK(苏)009-0001,体重范围:18 -22g。
[0032]实验方法
[0033]本实验给药方式为灌胃给药，造模方法为腹腔注射内毒素(15mg / kg)造成内毒素血症模型，具体实验方法如下。精密称取内毒素，用PBS缓冲溶液配成1.5mg / ml的溶液。将40只小鼠随机分成4组，每组10只，第一组(对照组)，连续3d给小鼠灌胃0.5%CMC-Na溶液0.2ml/10g，2time / d,第三天第一次灌胃后lh，腹腔注射0.1ml / IOg PBS缓冲溶液，6h后再给小鼠灌胃0.5 % CMC-Na溶液0.2ml / 1Og ;第二组(模型组)，连续3d给小鼠腹腔注射0.1ml / 1Og PBS缓冲溶液，ltime / d,第3d腹腔注射PBS缓冲溶液Ih后，给此组小鼠腹腔注射LPS溶液(15mg / kg, 0.1ml / 10g);第三组(给药低剂量组)，连续3d给小鼠灌胃低剂量药液，2time / d,第三天第一次灌胃后lh，腹腔注射0.lml/10g腔注射LPS溶液(15mg / kg, 0.1ml / 10g),6h后再给小鼠灌胃低剂量药液I次；第四组(给药高剂量组)，连续3d给小鼠灌胃高剂量药液，2time / d,第三天第一次灌胃后lh，腹腔注射0.1ml / IOg腔注射LPS溶液(15mg / kg, 0.1ml / 10g)，6h后再给小鼠灌胃高剂量药液1次。
[0034]观察指标及数据处理方法
[0035]注射LPS溶液后，以各组小鼠的存活率为指标，观察并记录7d，计算每组小鼠的死亡个数和存活率，实验结果见附表一。
[0036]附表一荆三棱有效部位的体内抗内毒素实验结果(成活率)
【权利要求】
1.一种治疗内毒素血症的中药有效部位的制备方法，包括以下步骤: (1)提取:取荆三棱的干燥块茎，粉碎，用乙醇水溶液浸泡，提取，得到提取液。 (2)柱层析:将步骤(I)得到的提取液浓缩，加水溶解，再分别用极性由小到大的萃取溶剂进行萃取，得到萃取液。萃取液经浓缩后上正相柱，用洗脱溶剂进行洗脱。收集洗脱液，干燥，得到荆三棱有效部位。 所述的萃取溶剂有乙酸乙酯。 所述的洗脱溶剂至少包含由体积比为100 =UlOO =IOUOO:12的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂。
2.根据权利要求1所述的荆三棱有效部位的制备方法，其特征在于，步骤(I)中，所用的乙醇水溶液为70 %-95 %。
3.根据权利要求1所述的荆三棱有效部位的制备方法，其特征在于，步骤(I)中，每次加入相当于药材的3-4倍重量的提取溶剂，在90°C-100°C加热回流提取，每次提取时间为2-3h，提取2-3次。
4.根据权利要求1所述的荆三棱有效部位的制备方法，其特征在于，所述的萃取溶剂包括石油醚、乙酸乙酯和正丁醇，萃取时按极性大小依次使用单一溶剂等体积进行萃取。
5.根据权利要求1所述的荆三棱有效部位的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的正相柱所用的填料为100-200目的柱层析硅胶。
6.根据权利要求1所述的荆三棱有效部位的制备方法，其特征在于，所述的洗脱溶剂至少由体积比为100:1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂、由体积比为100:10的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂、`由体积比为100:12的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱溶剂，并按极性由小到大进行梯度洗脱。
7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法制备荆三棱有效部位在制备抗内毒素血症药物中的应用。
【文档编号】A61P31/04GK103446378SQ201310426523
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年9月18日
【发明者】梁侨丽, 崔晓东, 李军, 邹娜姝, 吕高虹, 袁冬平 申请人:南京中医药大学