专利名称：一种中药有效成分的筛选测定方法
技术领域：
本发明涉及中药有效成分的筛选、检测和中空纤维微孔渗透技术。
背景技术：
中药的药效物质基础的筛选及评价是中药现代化研究的重要组成部分。中药化学成分极为复杂，单味药材本身即是复杂的混合物，且以几味甚至几十味药材配伍而成的中药复方为中医用药的基本形式。因而，探索中药效应-物质基础不仅是一项十分艰巨的任务而且是现代医疗的需要。其中，构建多种现代技术、高通量、符合中药特点的中药体外活性筛选研究方法显得尤为必要和重要。中药“多成分、多靶点、多渠道”发挥药效作用的组效关系已成共识。基于此，近十年发展起来多种体外筛选中药活性成分的技术。生物色谱法是将生物大分子(酶、受体、DNA、膜蛋白、膜磷脂、血浆中的运输蛋白等)、活性细胞膜/仿生物膜、甚至活细胞固定于硅胶等载体上作为色谱固定相，当中药提取液流经生物色谱柱时，由于固定相上的生物材料能够特异性地与中药活性成分结合，使色谱柱选择性地保留活性成分，从而可以利用色谱中的各种技术参数定量表征药物与生物大分子、细胞间相互作用，根据色谱参数的差别对活性成分进行生物参数测定、活性筛选和分离分析。以人血清白蛋白和Ci1-酸性糖蛋白作为固定相的生物色谱法对常用药材一当归、川芎、茵陈、黄芪、赤芍、银杏叶、丹参等中的活性成分进行了筛选，测定了活性成分血浆蛋白结合率(毛希琴，邹汉法，罗权舟，孔亮，厉欣，孙乃昌，卵磷脂涂敷生物膜色谱固定相的制备及其稳定性的考察，色谱，2001，19 (5):433 435;孔亮，邹汉法，汪海林，倪坚毅，张玉奎，以人血清白蛋白为固定相的分子生物色谱分析几种中药活性成分的研究，高等学校化学学报，2000，21(1):36、0)。应用不同组织细胞膜色谱模型筛选了丹参、川芎、当归、白芷、蛇床子、苦参、淫羊藿、红毛七、羌活、北沙参等中药材的活性成分，并结合药理实验确定有效成分和有效部位(赵小娟，党高潮，杨广德，淫羊藿根与叶活性成分的分析和比较，分析化学，2002，30( 2): 195 - 197 ；高琨，贺浪冲，杨广德，用细胞膜色谱法筛选研究红毛七中的有效成分，中国药学杂志，2003,38(1) 14-16 ；Xiaofang Hou, Mingzhe Zhou, Qiao Jiang, Sicen Wang, Langchong He，采用血管平滑肌/细胞膜色谱-离线气相色谱/质谱方法识别、分离、鉴定中药材中的活性成分，JournaL of Chromatography A, 2009, 1216: 7081 - 7087 ；Sicen Wang, Meng Sun, Yanmin Zhang, Hui Du, Langchong He,米用一禾中新的A431/细胞膜色谱-在线高效液相色谱/质谱方法从苦参中筛选表皮生长因子受体拮抗剂，JournaL of Chromatography A, 2010, 1217: 5246 - 5252)。但是，生物色谱技术存在以下不足(1)将生物材质与硅胶等载体结合，不仅生物学特征会受到一定的影响，而且不能排除硅胶活性中心对药物非特异性结合；(2)生物材质固定相制备和装柱困难，需要特殊的技术和设备，过程复杂，条件严格，成本较高，使用寿命短；(3)生物材质和中药有效成分作用与色谱过程同步进行，难以同时满足生物体内自然作用条件和色谱分离的最佳条件。
透析法和分离法是将仿生物膜(脂质体)、靶细胞或靶蛋白与中药提取物共孵育，经/不经透析后，与空白中药对照比较色谱图，峰面积显著变化的峰，即为与生物材料有作用的成分，应用在线LC-MS等技术鉴定这些成分，就可从复杂的中药体系中筛选出活性成分。采用该技术对当归止血汤、石蒜、石杉等中药进行了活性成分筛选与研究(李萍，盛亮洪，李睿岩，李松林，王伟，一种中药有效成分的检测方法，中国发明专利， ZL200410041024. 8 ；李萍，周建良，刘朋，刘颖，一种基于整体观评价中药活性和作用机理的方法，中国发明专利，CN101793883A)。其中，透析法存在不足由于透析过程达平衡时间较长，导致细胞死亡率较高、及在生理条件下细胞容易堵塞透析膜小孔，从而使得空白对照失去意义。分离法存在不足活性细胞与中药提取液一起培养，很难避免中药提取液中杂质对筛选结果的污染和影响。无论生物色谱法还是透析法和分离法普遍存在检测灵敏度低，细胞用量大，分析时间长等问题。公开号为CN101852787A的中国发明专利中公开了一种中药活性筛选方法，是将生物大分子、仿生物膜或生物膜注入中空纤维管，将中空纤维管置于处理后的中药或中药复方提取液中进行筛选，筛选结束后收集接收相，将与生物大分子、仿生物膜或生物膜特异性结合的活性成分游离出来，进行色谱或色谱/质谱分析。该方法不足是(1)未采用与药效作用直接相关的生物活细胞，而仅使用脂质体仿生物膜或生物大分子；(2)未将仿生物膜固定于中空纤维管内壁，仅将生物大分子或仿生物膜注入纤维内腔，因此，不能更好地模拟实际生物体内环境。
发明内容
本发明为了避免在中药有效成分筛选中，由于生物学特征受到影响而引起有效成分筛选和测定的差异，提供一种高效、准确的中药有效成分的筛选测定方法。为解决上述问题，本发明采用的技术方案是
一种中药有效成分的筛选测定方法。包括如下步骤(1)制备中药提取液；(2)将中空纤维洗净、自然晾干，再进行灭菌处理，将活性细胞植入或注入中空纤维；(3)将植入或注入活性细胞的中空纤维置于中药提取液中进行活性成分筛选；(4)筛选结束后，对活性细胞结合的有效成分进行解离，检测解离液中的有效成分。由于绝大多数药物只有进入人体、透过细胞才能表现出活性、发挥作用，药物在体内的生理过程、药物的活性和毒性等均取决于药物与细胞的作用状况。因而，本发明将中空纤维作为活细胞载体、基于药效物质与各类活细胞的作用，建立一种筛选和检测中药有效成分及有效部位的方法。本发明以中空纤维为活性细胞载体进行药物活性筛选，操作简便、 易于掌握，成本低廉，检测灵敏度高，更接近实际生物体内环境，筛选结果准确度高，能较好地反映中药多成分、多靶点、协同作用的特性，对揭示体内真正起效的中药效应物质基础具有重要意义。步骤(1)中制备中药提取液的方法是取待测中药用水或/和有机溶剂提取，即可以用水提取、有机溶剂提取或用水和有机溶剂的混合溶液提取，对有机溶剂提取的中药提取液需进行浓缩除去有机溶剂。提取待测中药中的有效成分后，用pH7. 0-7. 4的磷酸盐缓冲溶液或质量浓度为1%_3%的增溶剂溶解。
所述有机溶剂是甲醇、乙醇，丁醇、乙醚、乙酸乙酯和氯仿中的任意一种或几种的混合溶液；增溶剂为吐温、二甲基亚砜、聚乙二醇或曲拉通中的任意一种或几种的混合溶液。步骤(2)中，选用聚丙烯中空纤维，长度为6cm，聚丙烯中空纤维依次用丙酮、甲醇、酸、碱、蒸馏水分别超声清洗5 10min，并用蒸馏水反复清洗后，在室温下自然晾干，用高压蒸汽灭菌锅对其进行灭菌处理。步骤(2)中，注入活性细胞的方法是将消化得到的细胞用营养液或磷酸盐缓冲液溶解后得到细胞悬浮液，用一次性的无菌注射器抽取细胞悬浮液并将其缓慢、均勻注入中空纤维管腔内，封口，待用。步骤(2)中，植入活性细胞的方法是将消化得到的细胞用营养液或磷酸盐缓冲液溶解后得到细胞悬浮液，用一次性的无菌注射器抽取细胞悬浮液并将其缓慢、均勻注入中空纤维管腔内，将注满细胞悬浮液的纤维放入装有细胞培养液的细胞培养瓶中，4 后将种植细胞的纤维取出，封口，待用。中空纤维在细胞培养瓶中种植细胞时，每瓶放纤维6-10 根，摆放平整，互不接触、不能叠放，将细胞培养瓶瓶口、瓶帽过火消毒后，盖盖，放入培养箱内进行培养，隔天更换培养液，4 后将种植细胞的纤维取出，封口。用一次性的无菌注射器抽取细胞悬浮液时应拔掉针头，以防活性细胞受到损伤， 向中空纤维注入细胞悬浮液时再将针头安上。步骤(3)中，植入细胞或注入细胞悬浮液的中空纤维用普通细线扎口，将扎口的细胞中空纤维管置于中药提取液中进行筛选，筛选结束后，取出纤维，剪掉两端封扣细线，将纤维内液体吹入一小EP管中。步骤(4)中，对细胞结合的活性成分解离时使用20μ 的甲醇用微量注射器从筛选后的中空纤维一端吹入另一端吹出，与筛选后的中空纤维内吹出液合并，在IOOOOrpm离心 20min，取离心后上清液20μ 进行高效液相色谱、多波长高效液相色谱、气相色谱、液相/质谱、气相/质谱分析，筛选和测定与活性细胞特异性结合的活性有效成分。在活性细胞筛选的同时进行空白纤维对照，筛选结束后，收集中空纤维管内接受相，并对结合于细胞上的药物进行解离，用色谱检测解离液中游离的活性成分。与空白纤维检测结果比较，细胞纤维筛选结果色谱图的峰面积增加、出峰数增多所对应的化合物即为与活性细胞有相互作用的活性成分，与色谱/质谱或(和)核磁共振结合可获得与活性细胞结合化合物的结构信息
本发明方法中，细胞植入或注入中空纤维管内，细胞不直接与含有增溶剂的中药提取液接触，筛选过程中细胞的成活率高、成活期长，筛选平衡时间缩短(3-6h)。中药指纹图谱是适用于中药质量控制的关键技术，但现行的指纹图谱存在一个突出问题就是不能提供(效应-物质基础对映信息)中药的药理信息。药物与活性细胞作用是产生药效的前提，与活性细胞相互作用的成分才可能是中药材或中药复方的活性物质基础，在质量评价和控制中该类成分应该是重点研究的对象。因此，建立中药与活性细胞作用的活性成分指纹图谱，对中药中有效成分群同时进行质量控制和综合评价，对全面控制药材质量、阐明中药复杂体系效应-物质基础及作用本质具有重要的意义。活性细胞比模拟生物膜的特异性更强。细胞膜是从细胞中分离出来的，细胞膜的生物学特征可能受到影响。本发明直接使用植入或注入中空纤维的活细胞，在模拟人体生理环境和一定转速的搅拌下，进行细胞与药物相互作用，与人体内作为药物靶标的细胞更为接近，因此，本发明筛选出的活性成分更加可靠，准确度更高。本发明的检测方法中细胞接受相体积(
V11 =10-20 μυ很小，样品相体积(巧=5-10 mL)较大，因此，筛选体系的相比= % = )
较小。前期研究(田杰，陈璇，白小红.中药材成分有机溶剂与离子液体分散液相微萃取方法比较及机理探讨，分析化学，2010，38 (11) :1593 1598)表明相比越小，浓缩倍数越大
(即IP=〗=_ = |^)，方法的灵敏度越高。由此可见，筛选后活性成分有一定程度的浓
缩，测定灵敏度提高。以下是本发明一中药有效成分筛选和检测方法的进一步描述
中药的提取所述的中药包括单一化合物、一类或几类化合物、单味药材或多味中药组成的复方。根据中药所含有效成分的理化性质，选择合适的溶媒进行提取。但进行筛选时提取液溶媒不应破坏细胞活性，一般为水、缓冲溶液或含低于3%的增溶剂(吐温、二甲基亚砜)水溶液。即如果提取中药有效成分使用了对细胞活性有破坏作用的有机溶剂，应将其除去。使用对细胞无破坏作用的低浓度增溶剂的缓冲溶液作为筛选活性成分的介质。中空纤维的选择中空纤维管不仅可以作为种植、容纳和保护活性细胞的载体，而且为本发明提供了细胞与活性成分作用的平台。中空纤维壁上的无数小孔不仅可以使药物小分子自由通行，增加了活性细胞与化学成分接触的表面积，而且对中药提取物起到微过滤和纯化的作用，免去了其他中药活性筛选方法中耗时和繁琐的样品净化过程。本发明选择结构中无活性中心(无电负性强的杂原子取代基)的中空纤维，且空白中空纤维解离液无色谱峰或色谱峰弱的中空纤维。本发明采用聚丙烯中空纤维。活性细胞的选择所有来自人体和动物的细胞均可作为筛选和测定中药活性成分的靶标。如内皮细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、肿瘤细胞等，商品化的细胞株，如内皮细胞、肿瘤细胞等或自己进行分离培养或在中空纤维管内壁进行种植。筛选中药活性成分可根据文献、资料和预试验结果选择合适的细胞。例如据文献报导香豆素类化学成分具有抗癌作用，因此，本发明在实施例中选用胃癌细胞植入或注入中空纤维管中对蛇床子和补骨脂药材中香豆素类化学成分进行了活性筛选和测定。在用神经母瘤细胞对五味子药材中的活性成分进行筛选时，发现在木脂素类化合物色谱出峰位置有几个与细胞相互作用的活性成分。因此，木脂素类化合物不仅具有对神经系统的活性作用可能还有抗癌作用。为了验证木脂素类化合物的抗癌作用，我们又用胃癌细胞和单核巨噬细胞白血病细胞对五味子药材中的木脂素类化合物抗癌活性进行了筛选，结果发现五味子醇甲，五味子酯甲，五味子甲素，五味子乙素均能与的癌细胞产生相互作用。活性细胞与中药提取物中活性成分的结合将植入或注入活性细胞的中空纤维置于中药提取溶液中，在模拟人体生理环境和一定转速的搅拌下细胞与药物相互作用进行筛选，一般3-6h，同时进行空白聚丙烯中空纤维筛选。筛选结束后，中空纤维内溶液吹入一小 EP管中，用20μ 的甲醇清洗纤维内腔，吹出与筛选后的纤维内吹出液合并。细胞结合有效成分的解离针对不同活性成分的性质，选用不同溶剂或不同ρΗ、 极性、离子强度等的溶液对细胞上特异性结合的有效成分进行解离。活性成分进行筛选、色谱检测及结构确定通过比较细胞纤维和空白纤维筛选后解离溶液的色谱峰的峰面积、保留时间及峰数，确定初步筛选出的中药活性成分的种类和数量。同时，也可以对同一中药提取物的解离液进行HPLC、GC测定，筛选不同极性的活性成分；HPLC不同波长下测定，筛选不同类别紫外吸收活性化合物，初步实现中药多成分、多靶点、协同作用的物质基础研究。对于色谱图中有标准品的活性成分，采用与标准品保留时间及光谱图对照的方法，确定细胞上保留的活性成分。对于没有标准品的有效成分，利用色谱 /质谱联用分析和文献对照对未知活性成分做出结构的判定。本发明的基本原理是中空纤维是由多孔的高分子材料制成的管状结构，中空纤维壁上微孔允许药物小分子通过，而对生物大分子或杂质具有阻挡作用。药物与中空纤维内植入或注入的活性细胞靶点发生相互作用，药物便可通过中空纤维壁上的孔进入纤维管内与活性细胞结合，在特定的溶剂或溶液中使与细胞结合的药物解离，游离的药物进行色谱分析，与空白纤维筛选后的色谱图比较，筛选后有与细胞结合的药物会出现色谱峰或峰面积增加。同时，本发明的细胞接受相体积与样品相体积之比较小，因此，筛选后活性成分有一定的浓缩，测定灵敏度提高。如果测试样品是单味药材或复方提取液，得到的就是整个中药中与活性细胞相互作用的活性成分，如果测试样品是单一或一类、几类化合物，得到的就是单一或一类、几类化合物与活性细胞相互作用的活性成分，至于是单一或一类、几类化合物与活性细胞相互作用还是单味药材或复方提取液中活性成分与活性细胞相互作用，它们之间是否存在作用的差异或竞争、抑制可进一步研究。与现有技术相比本发明具有如下有益效果(1)以中空纤维为活性细胞载体对药物活性进行筛选，不仅避免了细胞的生物学特征改变而影响活性成分筛选的准确性，而且提高了检测的灵敏度，减少了细胞的使用量，缩短了分析时间；(2)不必制备生物膜固定相并进行装柱，不仅排除了硅胶中Si-OH对药物的非特异性结合，而且操作简单，易于掌握， 成本低廉；(3)活性筛选和样品净化同时完成，免去了其他中药活性筛选法所必需的样品前处理过程，提高了对中药活性成分筛选和结构确定的效率；(4)活性筛选和色谱过程分别进行，可满足生物学和色谱学要求的最适合或最佳条件；(5)中药提取物不经分离直接与活性细胞作用，能较好地反映中药多成分、多靶点、协同作用的特性，对揭示体内真正起效的中药效应物质基础具有重要的意义。(6)本次发明采用活性细胞、并将其植入或注入中空纤维管内。因此，能更好地模拟实际生物体内环境，筛选出的活性成分更加可靠，准确度更高。
图1中药活性成分筛选装置。图1中，1-恒温搅拌器，2-搅拌子，3-玻璃小瓶，4-中空纤维，5-中药提取物的缓冲溶液，6-植入或注入细胞。
图2蛇床子提取液中香豆素类活性成分与胃癌细胞相互作用色谱图。图2中，a标准品，空白纤维筛选样品，c胃癌细胞相纤维筛选样品。其中，3-补骨脂素(6. 0min)，5-异补骨脂素(7. Omin), 7-佛手柑内酯(9. Omin), 10-欧前胡素(15. Omin), 11-蛇床子素(16. 2min)
图3补骨脂提取液中香豆素类活性成分与胃癌细胞相互作用色谱图。图3中，a标准品，b空白纤维筛选样品，c注入胃癌细胞纤维筛选样品，d植入胃癌细胞纤维筛选样品。其中，4-补骨脂素(6. Omin), 5_异补骨脂素(7. Omin), 9-异欧前胡素(17. Omin)
图4五味子提取液中木脂素类活性成分与神经母瘤细胞相互作用色谱图。图4中，a标准品，b空白纤维筛选样品，c神经母瘤细胞纤维筛选样品。其中，2-五味子酯甲，3-五味子甲素，6-五味子乙素。图5五味子提取液中木脂素类活性成分与胃癌细胞相互作用色谱图。图5中，a标准品，b空白纤维筛选样品，c注入胃癌细胞纤维筛选样品， d植入胃癌细胞纤维筛选样品。其中，1-五味子醇甲，4-五味子酯甲，5-五味子甲素，7-五味子乙素。图6五味子提取液中木脂素类活性成分与单核巨噬细胞白血病细胞相互作用色谱图。图6中，a标准品，b空白纤维筛选样品，c单核巨噬细胞白血病细胞纤维筛选样品。其中，1-五味子甲素。图7五味子提取液中木脂素类活性成分与外周血单个核细胞相互作用色谱图。图7中，a标准品，b空白纤维筛选样品，c外周血单个核细胞纤维筛选样品。其中，4-五味子甲素。
具体实施例方式材料和试剂中空纤维(天津膜天膜工程技术有限公司)，中药标准对照品(中国药品生物制品检定所)，外周血单个核细胞(正常人体细胞)，细胞株(人胃癌细胞BGC7901， 单核巨噬细胞白血细胞7，神经母瘤细胞SHSY5Y)。实验用水为二次蒸馏水，其它试剂均为分析纯。仪器AgiLent TechnoLogies 1200 Series 高效液相色谱仪。实验步骤
取6mL的玻璃小瓶，加入500 μ L—定浓度的中药活性成分标准品或中药提取物的 ΡΗ7. 4磷酸盐缓冲溶液，放入搅拌子并固定于磁力搅拌器上，在37°C下恒温。将6cm长的聚丙烯中空纤维管依次用丙酮、甲醇、酸、碱、蒸馏水分别超声清洗5 10min，并用蒸馏水反复清洗后，在室温中风干，用高压蒸汽灭菌锅对中空纤维进行灭菌处理。用酒精灯高温处理过的镊子夹取灭菌后的中空纤维，用一次性的无菌注射器抽取细胞悬浮液并将其缓慢、均勻注入中空纤维管腔内。将注满细胞悬浮液的纤维小心放入装有4mL细胞培养液的细胞培养瓶中，放入培养箱内进行培养。4 后长满细胞的纤维取出，封口。将植入或注入活性细胞的中空纤维置于中药提取溶液中进行筛选。同时进行空白中空纤维筛选。筛选结束后，取出纤维，剪掉两端封口处，将纤维内液体吹入一小EP管中，用20μ 的甲醇清洗纤维内腔，吹出与筛选后的纤维内吹出液合并，在IOOOOrpm离心20min。分别取细胞/空白中空纤维上清液20μ 进行色谱分析，比较二者的色谱图的峰面积、出峰个数，确定与细胞作用的活性成分和其指纹图谱；与LC/MS或(和)NMR结合可获得与活性细胞结合化合物的结构信息。以下实施例为发明组以木脂素类和香豆素类活性成分为筛选对象，神经母瘤细胞、胃癌细胞、单核巨噬细胞白血病细胞、外周血单个核细胞为靶细胞，建立的中药五味子提取液中木脂素类活性成分和补骨脂、蛇床子提取液中香豆素类活性成分的筛选和检测方法。实施例1
1.蛇床子药材中香豆素类化学成分的提取
将中药材蛇床子捣碎过三号筛，精密称定1. Og加甲醇约45mL，水浴加热回流池，放冷， 过滤，续滤液置于50mL容量瓶中甲醇定容，4°C保存，待用。2.胃癌细胞中空纤维筛选研究蛇床子中香豆素类活性成分
精密吸取蛇床子提取液5mL于IOmL的玻璃小瓶，去除提取液中甲醇溶剂，用5mL的 PH7. 4的磷酸盐缓冲溶液溶解，放入搅拌子(8 mm X4 mm)并固定于磁力搅拌器上。将活性胃癌细胞中空纤维置于蛇床子提取液的缓冲溶液中进行筛选，开启磁力搅拌器，在恒温 37°C，1500 rpm搅拌下，筛选3 h，筛选结束后，取出纤维，剪掉两端封口处，取出纤维内溶液，用20μ 的甲醇清洗纤维内腔，合并两次溶液。在IOOOOrpm离心20min。取上清液20μ 进行HPLC分析。利用本发明对蛇床子药材中香豆素类活性成分进行了筛选见图2。由图2发现能与植入胃癌细胞结合且有明显保留的有11个(峰1-11)活性成分，通过保留时间对照进行了结构初步鉴定的有5个成分，分别是3-补骨脂素(6. 0min)，5-异补骨脂素(7. Omin), 7-佛手柑内酯(9. lmin), 10-欧前胡素(15. Omin), 11-蛇床子素(16. 2min)；能与注入胃癌细胞结合且有明显保留的有8个(峰1，3，6，7，8，9，10，11)活性成分，通过保留时间对照进行了结构初步鉴定的有4个成分，分别是3-补骨脂素(6. 0min)，7-佛手柑内酯(9. Imin), 10-欧前胡素(15. 0min)，ll-蛇床子素(16. aiiin)。对于色谱图中出现的没有标准品的活性成分可以进行色谱/质谱联用分析和文献对照，确定其可能结构。实施例2
1.补骨脂药材中香豆素类化学成分的提取
将中药材补骨脂捣碎过三号筛，精密称定2. Og加甲醇约45mL，水浴加热回流2小时，放冷，过滤，续滤液置于50mL容量瓶中甲醇定容，4 °C保存，待用。2.胃癌细胞中空纤维筛选研究补骨脂药材中香豆素类活性成分
精密吸取补骨脂提取液5mL于IOmL的玻璃小瓶，去除提取液中甲醇溶剂，用5mL的 PH7. 4的磷酸盐缓冲溶液溶解，放入搅拌子(8 mm X4 mm)并固定于磁力搅拌器上。将活性胃癌细胞中空纤维置于补骨脂提取液的缓冲溶液中进行筛选，开启磁力搅拌器，在恒温 37°C，1500 rpm搅拌下，筛选3 h，筛选结束后，取出纤维，剪掉两端封口处，取出纤维内溶液，用20μ 的甲醇清洗纤维内腔，合并两次溶液。在IOOOOrpm离心20min。取上清液20μ 进行HPLC分析。利用本发明对补骨脂药材中香豆素类活性成分进行了筛选见图3。由图3发现能与植入胃癌细胞结合且有明显保留的有11个(1-11)活性成分，通过保留时间对照进行了结构初步鉴定的有3个成分，分别是4-补骨脂素(6. Omin), 5-异补骨脂素(7. Omin), 9-异欧前胡素(17. Omin)；能与注入胃癌细胞结合且有明显保留的有6个(1，4，5，7，8，11)活性成分，通过保留时间对照进行了结构初步鉴定的有2个成分，分别是4-补骨脂素(6. Omin), 5-异补骨脂素(7. Omin)。对于色谱图中出现的没有标准品的活性成分可以进行色谱/质谱联用分析和文献对照，确定其可能结构。
实施例3
1.五味子药材中木脂素类活性成分的提取
取五味子干燥药材，研细，过30目筛，精密称取10 g于100 mL具塞容量瓶中，加甲醇 80 mL，超声(功率100 W)提取30 min，放至室温，用甲醇定容至100 mL。4 °C冰箱保存，待用。2.细胞中空纤维筛选研究五味子药材中木脂素类活性成分
精密吸取五味子中药提取液500 μ L于6mL的玻璃小瓶中，去除提取液中甲醇溶剂，用 4mL的pH7. 4的磷酸盐缓冲溶液溶解，放入搅拌子(8 mm X4 mm)并固定于磁力搅拌器上。 将活性细胞中空纤维置于五味子提取液的缓冲溶液中进行筛选，开启磁力搅拌器，在恒温 37°C，900 rpm搅拌下，筛选3 h，筛选结束后，取出纤维，剪掉两端封口处，取出纤维内溶液， 用20μ 的甲醇清洗纤维内腔，合并两次溶液。在IOOOOrpm离心20min。取上清液20μ 进行HPLC分析。利用本发明对五味子药材中木脂素类活性成分进行了筛选见图4-7。发现能与注入神经母瘤细胞结合且有明显保留(图4)的有6个活性成分，通过保留时间对照进行了结构初步鉴定的有3个成分，分别是2-五味子酯甲(7. ^min)，3-五味子甲素(8. 72min)和 6-五味子乙素(11. 59min)；与植入胃癌细胞(图5)结合且有明显保留的有7个活性成分， 通过保留时间对照进行了结构初步鉴定的有4个成分，分别是1-五味子醇甲(4. 22min), 4-五味子酯甲(7. 28min)，5-五味子甲素(8. 72min)，7-五味子乙素(11. 59min)，与注入胃癌细胞(图5)结合且有明显保留的有3个活性成分，通过保留时间对照进行了结构初步鉴定的有1个成分，5-五味子甲素(8. 72min)；能与注入单核巨噬细胞白血病细胞(图6)结合且有明显保留的有1个活性成分，通过保留时间对照进行了结构初步鉴定的只有1-五味子甲素(8. 72min)；与注入外周血单个核细胞(图7)结合且有明显保留的有6个成分，通过保留时间对照进行了结构初步鉴定的只有4-五味子甲素(8. 72min)0对于色谱图中出现的没有标准品的活性成分可以进行色谱/质谱联用分析和文献对照，确定其可能结构。
权利要求
1.一种中药有效成分的筛选测定方法，其特征在于包括如下步骤(1)制备中药提取液；(2)将中空纤维洗净、自然晾干，再进行灭菌处理，将活性细胞植入或注入中空纤维； (3)将植入或注入活性细胞的中空纤维置于中药提取液中进行活性成分筛选；(4)筛选结束后，对活性细胞结合的有效成分进行解离，检测解离液中的有效成分。
2.根据权利要求1所述的中药有效成分的筛选测定方法，其特征在于步骤(1)中制备中药提取液的方法是取待测中药用水或/和有机溶剂提取，提取待测中药中的有效成分后，用pH7. 0-7. 4的磷酸盐缓冲溶液或质量浓度为1%_3%的增溶剂溶解，制成用于中药活性成分筛选测定的的中药提取液。
3.根据权利要求2所述的所述的中药有效成分的筛选测定方法，其特征在于步骤(1) 中待测中药是单一化合物、几类化合物、单味药材或中药复方；所述有机溶剂是甲醇、乙醇， 丁醇、乙醚、乙酸乙酯和氯仿中的任意一种或几种的混合溶液；增溶剂为吐温、二甲基亚砜、 聚乙二醇或曲拉通中的任意一种或几种的混合溶液。
4.根据权利要求1所述的中药有效成分的筛选测定方法，其特征在于步骤(2)中，选用聚丙烯中空纤维，长度为6cm，聚丙烯中空纤维依次用丙酮、甲醇、酸、碱、蒸馏水分别超声清洗5 10min，并用蒸馏水反复清洗后，在室温下自然晾干，用高压蒸汽灭菌锅对其进行灭菌处理。
5.根据权利要求1所述的中药有效成分的筛选测定方法，其特征在于步骤(2)中，注入活性细胞的方法是将消化得到的细胞用营养液或磷酸盐缓冲液溶解后得到细胞悬浮液， 用一次性的无菌注射器抽取细胞悬浮液并将其缓慢、均勻注入中空纤维管腔内，封口，待用。
6.根据权利要求1所述的中药有效成分的筛选测定方法，其特征在于步骤(2)中， 植入活性细胞的方法是将消化得到的细胞用营养液或磷酸盐缓冲液溶解后得到细胞悬浮液，用一次性的无菌注射器抽取细胞悬浮液并将其缓慢、均勻注入中空纤维管腔内，将注满细胞悬浮液的纤维放入装有细胞培养液的细胞培养瓶中，48h后将种植细胞的纤维取出，封口，待用。
7.根据权利要求5，6所述的中药有效成分的筛选测定方法，其特征在于用一次性的无菌注射器抽取细胞悬浮液时应拔掉针头，以防活性细胞受到损伤，向中空纤维注入细胞悬浮液时再将针头安上。
8.根据权利要求6所述的中药有效成分的筛选测定方法，其特征在于中空纤维在细胞培养瓶中种植细胞时，每瓶放纤维6-10根，摆放平整，互不接触、不能叠放，将细胞培养瓶瓶口、瓶帽过火消毒后，盖盖，放入培养箱内进行培养，隔天更换培养液，4 后将种植细胞的纤维取出，封口。
9.根据权利要求1所述的中药有效成分的筛选测定方法，其特征在于步骤(3)中，植入细胞或注入细胞悬浮液的中空纤维用普通细线扎口，将扎口的细胞中空纤维管置于中药提取液中进行筛选，筛选结束后，取出纤维，剪掉两端封扣细线，将纤维内液体吹入一小EP管中。
10.根据权利要求1所述的中药有效成分的筛选测定方法，其特征在于步骤(4)中，对细胞结合的活性成分解离时使用20μ 的甲醇用微量注射器从筛选后的中空纤维一端吹入另一端吹出，与筛选后的中空纤维内吹出液合并，在IOOOOrpm离心20min，取离心后上清液20μ 进行高效液相色谱、多波长高效液相色谱、气相色谱、液相/质谱、气相/质谱分析，筛选和测定与活性细胞特异性结合的活性有效成分。
全文摘要
本发明公开了一种中药活性筛选方法，利用活性细胞与中药活性成分相互作用，筛选和检测中药活性有效成分的方法。首先制备中药或中药复方提取液。将植入或注入活性细胞的中空纤维置于中药提取液的磷酸盐缓冲溶液中，在模拟人体生理的条件下，进行中药活性药物筛选，同时进行空白对照。筛选结束后，收集中空纤维管内接受相，并对结合于细胞上的药物进行解离，用色谱检测解离液中游离的活性成分。与空白纤维检测结果比较获得与活性细胞结合化合物的结构信息。本发明高效、简便、价廉、准确，体现了中药多成分多靶点协同作用的特点。
文档编号G01N30/02GK102565224SQ20111044370
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者张静, 李利华, 王倩, 白小红, 窦岩, 胡爽, 薛雪 申请人:山西医科大学