一种桂枝茯苓胶囊中三萜类成分指纹图谱的建立方法
【专利摘要】本发明属于中药检测领域，尤其涉及一种桂枝茯苓胶囊中三萜类成分指纹图谱的建立方法，该方法包括以下步骤：a)、桂枝茯苓胶囊内容物依次经过提取剂提取和除提取剂后，与溶剂混合，得到供试品溶液；将茯苓酸与溶剂混合，得到对照品溶液；b)、分别将照品溶液与供试品溶液注入超高效液相色谱仪中进行检测，得到桂枝茯苓胶囊中三萜类成分指纹图谱。通过此方法可建立桂枝茯苓胶囊中三萜类成分指纹图谱，用于对桂枝茯苓胶囊的质量进行控制和评价。对本发明提供的方法进行精密度、稳定性和重复性测试，测试结果表明，本发明提供方法的精密度、稳定性和重复性良好。
【专利说明】
一种桂枝茯苓胶囊中三萜类成分指纹图谱的建立方法
技术领域
[0001] 本发明属于中药检测领域，尤其涉及一种桂枝茯苓胶囊中三萜类成分指纹图谱的 建立方法。
【背景技术】
[0002] 中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成 分的色谱或光谱的图谱。在现阶段，中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹 图谱对于有效控制和评价中药材或中成药的质量具有重要的意义。
[0003 ]桂枝茯苓胶囊由桂枝、茯苓、牡丹皮、赤芍和桃仁共5味中药组成，具有活血、化瘀、 消癥之功效，主治妇人瘀血阻络所致癥块、经闭、痛经、产后恶露不尽;子宫肌瘤，慢性盆腔 炎包块，痛经，子宫内膜异位症，卵巢囊肿见上述证候者；也可用于女性乳腺香囊性增生病 属瘀血阻络症，症见乳房疼痛、乳房肿块、胸肋胀闷；或用于前列腺增生属瘀阻膀胱证，症见 小便不爽、小腹胀痛。
[0004] 茯苓三萜是桂枝茯苓胶囊的有效成分之一，具有抗肿瘤、抗炎、免疫调节等作用， 如果能够对桂枝茯苓胶囊中茯苓三萜类成分的种类及其含量进行检测，那么对控制和评价 桂枝茯苓胶囊的质量具有十分重要的意义。因此，为了更好地反映桂枝茯苓胶囊的内在质 量，建立桂枝茯苓胶囊中三萜类成分的指纹图谱是非常必要的。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种桂枝茯苓胶囊中三萜类成分指纹图谱的建 立方法，通过此方法能够建立桂枝茯苓胶囊中三萜类成分指纹图谱，用于对桂枝茯苓胶囊 的质量进行控制和评价。
[0006] 本发明提供了一种桂枝茯苓胶囊中三萜类成分指纹图谱的建立方法，包括以下步 骤：
[0007] a)、桂枝茯苓胶囊内容物依次经过提取剂提取和除提取剂后，与溶剂混合，得到供 试品溶液;将茯苓酸与溶剂混合，得到对照品溶液；
[0008] b)、分别将照品溶液与供试品溶液注入超高效液相色谱仪中进行检测，得到桂枝 茯苓胶囊中三萜类成分指纹图谱。
[0009] 优选的，检测的过程中，以乙腈为流动相的A相，以0.00~0.5vol %酸的水溶液为 流动相的B相，所述酸包括磷酸、甲酸和冰醋酸中的一种或多种。
[0010]优选的，检测的过程中，洗脱方式为梯度洗脱，洗脱程序设置为：
[0011] 起始时，A相与B相的体积比为50:50; 12min时，A相与B相的体积比为55:45; 16min 时，A相与B相的体积比为60:40; 20min时，A相与B相的体积比为65:35; 24min时，A相与B相的 体积比为70:30 ; 28min时，A相与B相的体积比为75: 25; 32min时，A相与B相的体积比为85: 15; 34~60min时，A相与B相的体积比为90:10。
[0012]优选的，检测的过程中，检测的波长200~220nm〇
[0013] 优选的，检测的过程中，流动相的流速为0.18~0.22mL/min。
[0014] 优选的，检测的过程中，超高效液相色谱仪中色谱柱的柱温为20~30°C。
[0015]优选的，检测的过程中，理论塔板数按茯苓酸峰计算不低于40000。
[0016]优选的，步骤a)中，所述提取的方式为加热回流提取。
[0017]优选的，以茯苓酸作为内参物，其相对保留时间为1.00,所述指纹图谱中其它共有 峰的相对保留时间分别为：0·375±20%、0·461±20%、0·519±20%、0·645±20%、0·662 ±20%、0.707±20%、0.903±20%、0.923±20%、0.937±20%、0.952±20%、0.969 土 20%、1.085±20%、1.109±20%、1.151±20%、1.210±20%、1.439±20%、1.478±20%、 1.656±20% 和 1.735±20%。
[0018] 优选的，所述指纹图谱中，相对保留时间分别为0.375 ± 20 %、0.461 ± 20 %、0.519 ±20%、0.645±20%、0.707±20%、0.903±20%、0.937±20%、0.952±20%、0.969 土 20%、1.085±20%、1.151±20%、1.210±20%、1.439±20%、1.478±20%和1.735± 20%，对应的化合物依次为:常春藤皂苷、去氢土莫酸、土莫酸、猪苓酸C、3-表去氢土莫酸、 茯苓酸D、a_亚麻酸、去氢茯苓酸、齐墩果酸、亚油酸、棕榈油酸甲酯、棕榈酸、棕榈酸乙酯、 胡萝卜苷和阿福豆苷。
[0019] 与现有技术相比，本发明提供了一种桂枝茯苓胶囊中三萜类成分指纹图谱的建立 方法，该方法包括以下步骤:a)、桂枝茯苓胶囊内容物依次经过提取剂提取和除提取剂后， 与溶剂混合，得到供试品溶液;将茯苓酸与溶剂混合，得到对照品溶液;b)、分别将照品溶液 与供试品溶液注入超高效液相色谱仪中进行检测，得到桂枝茯苓胶囊中三萜类成分指纹图 谱。通过此方法可建立桂枝茯苓胶囊中三萜类成分指纹图谱，用于对桂枝茯苓胶囊的质量 进行控制和评价。对本发明提供的方法进行精密度、稳定性和重复性测试，测试结果表明， 本发明提供方法的精密度、稳定性和重复性良好。
【附图说明】
[0020] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据 提供的附图获得其他的附图。
[0021] 图1是本发明实施例1提供的桂枝茯苓胶囊中三萜类成分的指纹图谱；
[0022] 图2是本发明实施例2提供的桂枝茯苓胶囊中三萜类成分的对照指纹图谱；
[0023] 图3是本发明实施例2提供的10个批次的桂枝茯苓胶囊供试品色谱图与对照指纹 图谱的对比图；
[0024] 图4是本发明实施例3提供的桂枝茯苓胶囊中三萜类成分的色谱图；
[0025] 图5是本发明实施例7提供的桂枝茯苓胶囊中三萜类成分指纹图谱中各共有峰归 属色谱图；
[0026] 图6是本发明实施例8提供的桂枝茯苓胶囊中三萜类成分的色谱图；
[0027] 图7是本发明实施例9提供的桂枝茯苓胶囊中三萜类成分的色谱图；
[0028] 图8是本发明实施例10提供的桂枝茯苓胶囊中三萜类成分的色谱图；
[0029] 图9是本发明实施例11提供的桂枝茯苓胶囊中三萜类成分的色谱图；
[0030] 图10是本发明实施例12提供的桂枝茯苓胶囊中三萜类成分的色谱图；
[0031] 图11是本发明实施例13提供的桂枝茯苓胶囊中三萜类成分的色谱图。
【具体实施方式】
[0032] 下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例 仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技 术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范 围。
[0033]本发明提供了一种桂枝茯苓胶囊中三萜类成分指纹图谱的建立方法，包括以下步 骤：
[0034] a)、桂枝茯苓胶囊内容物依次经过提取剂提取和除提取剂后，与溶剂混合，得到供 试品溶液;将茯苓酸与溶剂混合，得到对照品溶液；
[0035] b)、分别将照品溶液与供试品溶液注入超高效液相色谱仪中进行检测，记录色谱 图，用指纹图谱软件对图谱进行处理，得到桂枝茯苓胶囊中三萜类成分指纹图谱。
[0036] 在本发明中，首先配制供试品溶液和对照品溶液。其中，供试品溶液按照以下方法 配制：
[0037] 桂枝茯苓胶囊内容物依次经过提取剂提取和除提取剂后，与溶剂混合，得到供试 品溶液。
[0038] 在本发明提供的上述配制供试品溶液的方法中，所述提取的方式优选为加热回流 提取;所述提取剂优选为乙醚;所述桂枝茯苓胶囊内容物与提取剂的用量比优选为（1~10) g: (10~100)mL，更优选为5g: (30~80)mL，最优选为5g: 50mL;所述除提取剂的方式优选为 蒸发;所述溶剂优选为甲醇。
[0039] 在本发明提供的一个实施例中，具体按照以下方式配制供试品溶液：
[0040] 1)、将桂枝茯苓胶囊内容物在提取剂中浸润后加热回流，然后过滤加热回流产物， 得到提取液和滤渣；
[0041 ] 2)、所述提取液除提取剂后与溶剂混合，得到供试品溶液。
[0042] 在本发明上述实施例提供的配置方法中，所述浸润的时间优选为10~60min，更优 选为30~40min;所述加热回流的时间优选为10~60min，更优选为30~40min。在本发明中， 优选对所述滤渣进行二次提取，所述二次提取的方式优选为:使用提取剂润洗所述滤渣， 得到洗液。得到洗液后，所述洗液与所述提取液合并后进行后续工艺处理。
[0043] 在本发明中，为保护后续检测过程中使用的超高效液相色谱仪，得到所述供试品 溶液后，优选对所述供试品溶液进行过滤，以滤除供试品溶液中可能含有的杂质。所述过滤 的滤膜孔径优选为〇. 1~〇. 4μL?，更优选为0.2~0.3μL?，最优选为0.22μηι。
[0044] 在本发明中，对照品溶液按照以下方法配制:将茯苓酸与溶剂混合，得到对照品溶 液。在本发明中，以茯苓酸作为参照物，将其配制成对照品溶液。其中，所述溶剂优选为甲 醇;所述对照品溶液中茯苓酸的含量优选为50~200yg/mL，更优选为100~150yg/mL。
[0045] 配制好供试品溶液和对照品溶液后，分别将照品溶液与供试品溶液注入超高效液 相色谱仪中进行检测。检测过程中，使用的色谱柱优选为C 18柱，更优选为Agilent Z0RBAX Eclipse HD C18柱;检测的波长优选为200~220nm，更优选为210min;色谱柱的柱温优选为 20~30°C，更优选为25°C ;流动相的流速优选为0.18~0.22mL/min，更优选为0.2mL/min;理 论塔板数按茯苓酸峰计算优选不低于40000。
[0046] 检测过程中，优选以乙腈为流动相的A相，以0.00~0.5vol %酸的水溶液为流动相 的B相，所述酸包括磷酸、甲酸和冰醋酸中的一种或多种，更优选以0.05~0.2vol %磷酸水 溶液为流动相的B相。检测过程中，洗脱方式优选为梯度洗脱，洗脱程序设置为:起始时，A相 与B相的体积比为50:50; 12min时，A相与B相的体积比为55:45; 16min时，A相与B相的体积比 为60:40; 20min时，A相与B相的体积比为65:35; 24min时，A相与B相的体积比为70:30; 28min 时，A相与B相的体积比为75:25;3211^11时4相与財目的体积比为85:15 ;34~6〇1^11时4相与8 相的体积比为90:10。
[0047] 检测结束后，得到色谱图，所述色谱图即可作为桂枝茯苓胶囊中三萜类成分指纹 图谱。在本发明提供的一个实施例中，也可采用指纹图谱软件对所述色谱图进行处理，得到 软件处理的桂枝茯苓胶囊中三萜类成分指纹图谱。所述指纹图谱软件优选为国家药典颁布 的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》。
[0048] 在本发明提供的一个实施例中，采用以下方法建立指纹图谱，该过程具体为：
[0049] A)、将多批次桂枝茯苓胶囊内容物依次经过提取剂提取和除提取剂后，与溶剂混 合，得到多个供试品溶液;将茯苓酸与溶剂混合，得到对照品溶液；
[0050] B)、分别将照品溶液与多个所述供试品溶液注入超高效液相色谱仪中进行检测， 得到多张桂枝茯苓胶囊内容物的色谱图；
[0051] C)、标定多张所述色谱图的共有峰，用指纹图谱软件对色谱图进行处理，得到桂枝 茯苓胶囊中三萜类成分指纹图谱。
[0052]在本发明上述实施例提供的方法中，所述共有峰的个数优选为16~25个，更优选 为20个;所述指纹图谱软件优选为国家药典颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》； 所述处理方法优选为中位数法。
[0053] 在本发明提供的一个实施例中，以茯苓酸作为内参物，其相对保留时间为1.00,所 述指纹图谱中其它共有峰的相对保留时间分别为：0.375 ±20 %、0.461 ±20 %、0.519 土 20%、0.645±20%、0.662±20%、0.707±20%、0.903±20%、0.923±20%、0.937±20%、 0.952±20%、0.969±20%、1.085±20%、1.109±20%、1.151±20%、1.210±20%、1.439 ±20%、1.478±20%、1.656±20%和1.735±20%。
[0054] 在本发明提供的一个指纹图谱共有峰的相对保留时间为上述数值的实施例中，所 述指纹图谱中，相对保留时间为0.461 ± 20%时对应的相对峰面积为0.323 ± 20% ;相对保 留时间为〇. 519 ± 20%时对应的相对峰面积为0.485± 20% ;相对保留时间为0.662± 20% 时对应的相对峰面积为1.233±20% ;相对保留时间为0.937± 20%时对应的相对峰面积为 0.359 ± 20 % ;相对保留时间为1时对应的相对峰面积为1;相对保留时间为1.085 ± 20 %时 对应的相对峰面积为1.584± 20 % ;相对保留时间为1.210 ± 20 %时对应的相对峰面积为 0.207 ± 25% ;相对保留时间为1.735 ± 20%时对应的相对峰面积为0.498 ± 20%。
[0055] 在本发明提供的一个指纹图谱共有峰的相对保留时间为上述数值的实施例中，所 述指纹图谱中，相对保留时间为0.375± 20%时对应的化合物为常春藤皂苷;相对保留时间 为0.461 ± 20 %时对应的化合物为去氢土莫酸;相对保留时间为0.519 ± 20 %时对应的化合 物为土莫酸；相对保留时间为0.645±20%时对应的化合物为猪苓酸C;相对保留时间为 0.707 ± 20 %时对应的化合物为3-表去氢土莫酸;相对保留时间为0.903 ± 20%时对应的 化合物为茯苓酸D;相对保留时间为0.937 ± 20 %时对应的化合物为α-亚麻酸;相对保留时 间为0.952 ± 20 %时对应的化合物为去氢茯苓酸;相对保留时间为0.969 ± 20 %时对应的化 合物为齐墩果酸；相对保留时间为1时对应的化合物为茯苓酸；相对保留时间为1.085 ± 20 %时对应的化合物为亚油酸；相对保留时间为1.151 ± 20 %时对应的化合物为棕榈油酸 甲酯；相对保留时间为1.210±20%时对应的化合物为棕榈酸；相对保留时间为1.439土 20 %时对应的化合物为棕榈酸乙酯；相对保留时间为1.478 ± 20 %时对应的化合物为胡萝卜 苷;相对保留时间为1.735 ± 20 %时对应的化合物为阿福豆苷。
[0056]采用本发明提供的方法可建立桂枝茯苓胶囊中三萜类成分指纹图谱，用于对桂枝 茯苓胶囊的质量进行控制和评价。对本发明提供的方法进行精密度、稳定性和重复性测试， 试验结果表明，本发明提供的方法精密度和重复性良好，供试品12小时内成分稳定。
[0057]为更清楚起见，下面通过以下实施例进行详细说明。
[0058]本发明实施例中涉及的仪器与试药如下：
[0059] 仪器:Agilent 1290超高压液相色谱仪，DAD紫外检测器;Mettler ΑΕ240电子分析 天平;BSA224S-CW型电子分析天平;Centrifuge 541 f5D高速离心机;Milli_Q Academic纯水 机。
[0060] 试剂：桂枝茯苓胶囊（江苏康缘药业股份有限公司生产，批号：130501、140301、 140401、140701、140801、140901、141001、141002、141101、150701;对照品：去氢茯苓酸、茯 苓酸、去氢土莫酸;乙腈(色谱纯，美国天地公司），水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
[0061 ] 实施例1
[0062]指纹图谱的建立
[0063] 1)供试品溶液和对照品溶液的制备：
[0064]供试品溶液:取桂枝茯苓胶囊内容物适量，混匀，取约5g，精密称定，置150mL圆底 烧瓶内，加乙醚50mL，浸润30min后加热回流40min，过滤，滤渣用少量乙醚润洗，合并洗液于 蒸发皿内，蒸干，加甲醇溶解，转移至5mL量瓶内，加甲醇稀释定容至刻度摇匀，过0.22μπι滤 膜，即得供试品溶液；
[0065] 对照品溶液:5mg茯苓酸加入至50mL量瓶内，加甲醇稀释定容至刻度摇匀，过0.22 μπι滤膜，即得对照品溶液。
[0066] 2)超高效液相色谱检测：
[0067] 分别精密吸取照品溶液与供试品溶液各lyL注入超高效液相色谱仪，测定，记录 60min图谱，色谱条件为：
[0068] 色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse HD Ci8(2· 1 X 100mm，1 ·8μηι);以乙臆为流动相 Α，以0.1 vol %磷酸水溶液为流动相Β，按表1中的规定进行梯度洗脱;流速每分钟为0.2mL; 检测波长为210nm;柱温25°C;理论板数按茯苓酸峰计算不低于40000。
[0069] 表1梯度洗脱程序表
[0070]
[0071] 3)建立对照指纹图谱：
[0072]按照步骤2)，对批号130501的桂枝茯苓胶囊进行检测，得到色图谱，即为桂枝茯苓 胶囊中三萜类成分的指纹图谱。如图1所示。图1是本发明实施例1提供的桂枝茯苓胶囊中三 萜类成分的指纹图谱。
[0073] 实施例2
[0074] 1、指纹图谱的建立
[0075] 分别取10个批次的桂枝茯苓胶囊供试品（批号130501、140301、140401、140701、 140801、140901、141001、141002、141101、150701)内容物适量，取约5g，精密称定，按照实施 例1的步骤1)中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按照实施例1的步骤2)的色谱条件 进行超高效液相色谱测试，去掉前5min色谱峰，得到10条色谱图（即10个批次桂枝茯苓胶囊 中三萜类成分的指纹图谱），标定10条色谱图的20个共有峰，采用国家药典颁布的《中药色 谱指纹图谱相似度评价系统》2012年版进行分析，以中位数法对照指纹图谱生成法，建立对 照指纹图谱，如图2所示。图2是本发明实施例2提供的桂枝茯苓胶囊中三萜类成分的对照 指纹图谱，图2中每个封号对应的相对保留时间和相对峰面积如表2所示：
[0076] 表2对照指纹图谱中共有峰的相对保留时间和相对峰面积范围
[0077]
[0078] 2、共有峰指认
[0079] 1)、色谱条件:除0. lvol %磷酸水溶液改为0. lvol %甲酸水溶液外，其余条件与实 施例1相同；
[0080] 2)、质谱条件：采用ESI源，正、负离子模式分别扫描，毛细管电压（正离子模式：4 000V;负离子模式:3500V)，雾化气压力45psi，干燥气流速10L ·π?η-S加热毛细管温度350 °C，源内裂解电压175V，锥孔电压65V，质量数扫描范围m/z 100~2 000。
[0081 ] 3)、化学成分数据库建立:通过Agilent提供的"formula-database-generator"软 件建立GFC中化学成分的分子式与理论相对分子质量数据库。
[0082] 4)、指纹图谱中共有峰鉴别:应用UPLC/Q TOF MS在上述色谱和质谱条件下对供试 品溶液进行定性分析，结合紫外光谱信息、MS数据和文献进行分析，初步鉴定出16个化合 物。对应图2,分别为1-常春藤皂苷、2-去氢土莫酸、3-土莫酸、4-猪苓酸C、6-3-表去氢土莫 酸、7-茯苓酸D、9-a-亚麻酸、10-去氢茯苓酸、11-齐墩果酸、12-茯苓酸、13-亚油酸、15-棕榈 油酸甲酯、16-棕榈酸、17-棕榈酸乙酯、18-胡萝卜苷、20-阿福豆苷。UPLC-Q-T0F/MS鉴定结果 见表3:
[0083]表3对照指纹图谱中共有峰的指认信息
[0084]
[0085] 3、相似度计算
[0086] 上述10个批次的桂枝茯苓胶囊供试品的色谱图与对照指纹图谱的对比图如图3所 示，图3是本发明实施例2提供的10个批次的桂枝茯苓胶囊供试品色谱图与对照指纹图谱的 对比图，图3中，最上面的图谱曲线为对照指纹图谱，往下依次为10个批次的桂枝茯苓胶囊 供试品色谱曲线，对应的批号标注在色谱曲线的右侧。
[0087]采用相似度软件（中药色谱指纹图谱相似度评价系统），以对照指纹图谱作为参照 图谱，计算10个批次的桂枝茯苓胶囊供试品指纹图谱的相似度，结果见表4:
[0088]表4相似度计算结果
[0089]
[0090] 根据表4可以看出，10批样品的指纹图谱与对照指纹图谱相似度在0.9以上，说明 该10批样品中的三萜类成分含量稳定。
[0091] 实施例3 [0092] 滞后峰测试
[0093] 本实施例中，滞后峰测试的过程与实施例1建立指纹图谱的过程与基本相同，其区 别仅在于本实施例中记录120min图谱。得到的色谱图如图4所示。图4是本发明实施例3提供 的桂枝茯苓胶囊中三萜类成分的色谱图。通过图4可以看出，结果50min后无色谱峰，因此在 桂枝茯苓胶囊指纹图谱测定时，实施例1选择的色谱条件适宜，无滞后成分影响样品测定。
[0094] 实施例4 [0095] 精密度试验
[0096]取同一供试品（批号130501)内容物适量，取约5g，精密称定，按照实施例1的步骤 1)中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按照实施例1的步骤2)的色谱条件连续进样6 次进行测定。采用相似度软件（中药色谱指纹图谱相似度评价系统），去掉前5min色谱峰，以 第1次进样所得指纹图谱作为参照图谱，计算后5次进样所得指纹图谱的相似度。通过全谱 峰匹配(峰面积按总峰的0.1%以上的峰面积参与匹配），相似度结果均不小于0.99,符合指 纹图谱的技术要求，表明该方法精密度良好。
[0097] 实施例5 [0098] 稳定性试验
[0099]取同一供试品（批号130501)内容物适量，取约5g，精密称定，按照实施例1的步骤 1)中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按照实施例1的步骤2)的色谱条件于0、2、4、 6、8、12小时分别测定一次指纹图谱，采用相似度软件（中药色谱指纹图谱相似度评价系 统），去掉前5min色谱峰，以第1次进样所得指纹图谱作为参照图谱，计算后5次进样所得指 纹图谱的相似度。通过全谱峰匹配(峰面积按总峰的0.1%以上的峰面积参与匹配），相似度 结果均不小于0.99,符合指纹图谱的技术要求，表明供试品溶液12小时内成分是稳定的。 [0100] 实施例6 [0101] 重复性试验
[0102] 取同一供试品（批号130501)内容物适量，取约5g，精密称定，按照实施例1的步骤 1)中供试品溶液的制备方法平行制备6份，按照实施例1的步骤2)的色谱条件测定指纹图 谱，采用相似度软件（中药色谱指纹图谱相似度评价系统），去掉前5min色谱峰，以第1次进 样所得指纹图谱作为参照图谱，计算后5次进样所得指纹图谱的相似度。通过全谱峰匹配 (峰面积按总峰的0.1%以上的峰面积参与匹配），相似度结果均不小于0.99,符合指纹图谱 的技术要求，表明该方法可较好重复。
[0103] 实施例7
[0104] 指纹图谱中共有峰的归属
[0105] 取茯苓药材、桃仁药材、白芍药材、丹皮药材、桂枝药材各约0.5g，精密称定于圆底 烧瓶内，加乙醚25mL浸润30min后加热回流40min，过滤，滤渣用少量乙醚润洗，合并洗液于 蒸发皿内，蒸干，加甲醇溶解，转移至5mL量瓶内，加甲醇稀释定容至刻度摇匀，过0.22μπι滤 膜，即得茯苓药材供试品溶液、桃仁药材供试品溶液、白芍药材供试品溶液、丹皮药材供试 品溶液和桂枝药材供试品溶液。
[0106] 按照实施例1的步骤2)的色谱条件对上述供试品溶液进行超高效液相色谱检测， 去掉前5min色谱峰，检测结果通过保留时间和DAD (Diode array detector，二极管阵列）扫 描分析，并与实施例1建立的对照指纹图谱中标定的20个共有峰进行对应，结果见图5,图5 是本发明实施例7提供的桂枝茯苓胶囊中三萜类成分指纹图谱中各共有峰归属色谱图。图5 中，最上面的图谱曲线为对照指纹图谱，往下依次为不同药材供试品色谱曲线，对应的药材 种类标注在色谱曲线的右侧。通过图5可以看出，对照指纹图谱中1、2、3、4、5、6、7、10、12、 14、15、17号峰共12个色谱峰主要来自于茯苓药材，8、9、11、13、16号峰来自于其他四味药 材，18、19、20号峰未能归属。
[0107] 实施例8
[0108]不同色谱条件下获取的色谱图
[0109]本实施例中，色谱图的获取过程与实施例1建立指纹图谱的过程与基本相同，其区 别仅在于本实施例以乙腈为流动相A，以水为流动相B。得到的色谱图如图6所示，图6是本发 明实施例8提供的桂枝茯苓胶囊中三萜类成分的色谱图。
[0110] 实施例9
[0111] 不同色谱条件下获取的色谱图
[0112] 本实施例中，色谱图的获取过程与实施例1建立指纹图谱的过程与基本相同，其区 别仅在于本实施例以甲醇为流动相A，以O.lvol%磷酸水溶液为流动相B。得到的色谱图如 图7所示。图7是本发明实施例9提供的桂枝茯苓胶囊中三萜类成分的色谱图。
[0113] 实施例1〇
[0114] 不同色谱条件下获取的色谱图
[0115] 本实施例中，色谱图的获取过程与实施例1建立指纹图谱的过程与基本相同，其区 别仅在于本实施例中色谱柱柱温为20°C。得到的色谱图如图8所示。图8是本发明实施例10 提供的桂枝茯苓胶囊中三萜类成分的色谱图。
[0116] 实施例11
[0117] 不同色谱条件下获取的色谱图
[0118] 本实施例中，色谱图的获取过程与实施例1建立指纹图谱的过程与基本相同，其区 别仅在于本实施例中色谱柱柱温为30°C。得到的色谱图，即桂枝茯苓胶囊中三萜类成分的 指纹图谱如图9所示。图9是本发明实施例11提供的桂枝茯苓胶囊中三萜类成分的色谱图。 [0 119] 实施例12
[0120]不同色谱条件下获取的色谱图
[0121]本实施例中，色谱图的获取过程与实施例1建立指纹图谱的过程与基本相同，其区 别仅在于本实施例中流动相流速为〇. 18mL/min。得到的色谱图如图10所示。图10是本发明 实施例12提供的桂枝茯苓胶囊中三萜类成分的色谱图。
[0122] 实施例12
[0123]不同色谱条件下获取的色谱图
[0124] 本实施例中，色谱图的获取过程与实施例1建立指纹图谱的过程与基本相同，其区 别仅在于本实施例中流动相流速为〇. 22mL/min。得到的色谱图如图11所示。图11是本发明 实施例13提供的桂枝茯苓胶囊中三萜类成分的色谱图。
[0125] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种桂枝茯苓胶囊中三萜类成分指纹图谱的建立方法，包括以下步骤： a) 、桂枝茯苓胶囊内容物依次经过提取剂提取和除提取剂后，与溶剂混合，得到供试品 溶液;将茯苓酸与溶剂混合，得到对照品溶液； b) 、分别将照品溶液与供试品溶液注入超高效液相色谱仪中进行检测，得到桂枝茯苓 胶囊中三萜类成分指纹图谱。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测的过程中，以乙腈为流动相的A相，以 0. 00~0.5vol %酸的水溶液为流动相的B相，所述酸包括磷酸、甲酸和冰醋酸中的一种或多 种。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，检测的过程中，洗脱方式为梯度洗脱，洗脱 程序设置为： 起始时，A相与B相的体积比为50:50;1211^11时4相与8相的体积比为55:45 ;161^11时4 相与B相的体积比为60:40; 20min时，A相与B相的体积比为65:35; 24min时，A相与B相的体积 比为70:30;2811^11时4相与时目的体积比为75 :25;321^11时4相与財目的体积比为85:15;34 ~60min时，A相与B相的体积比为90:10。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测的过程中，检测的波长200~220nm。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测的过程中，流动相的流速为0.18~ 0·22mL/min〇6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测的过程中，超高效液相色谱仪中色谱 柱的柱温为20~30°C。7. 根据权利要求1~6任一项所述的方法，其特征在于，检测的过程中，理论塔板数按茯 苓酸峰计算不低于40000。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)中，所述提取的方式为加热回流提 取。9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以茯苓酸作为内参物，其相对保留时间为1. 〇〇,所述指纹图谱中其它共有峰的相对保留时间分别为：0.375±20%、0.461 ±20%、 0.519±20%、0.645±20%、0.662±20%、0.707±20%、0.903±20%、0.923±20%、0.937 ± 20 %、0.952 ±20 %、0.969 ±20 %、1.085 ±20 %、1.109 ±20 %、1.151 ±20 %、1.210 土 20%、1.439±20%、1.478±20%、1.656±20%和1.735±20%。10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述指纹图谱中，相对保留时间分别为 0.375±20%、0.461±20%、0.519±20%、0.645±20%、0.707±20%、0.903±20%、0.937 ± 20 %、0.952 ±20 %、0.969 ±20 %、1.085 ±20 %、1.151 ±20 %、1.210 ±20 %、1.439 土 20 %、1.478 ± 20 %和1.735 ± 20 %，对应的化合物依次为：常春藤皂苷、去氢土莫酸、土莫 酸、猪苓酸C、3_表去氢土莫酸、茯苓酸D、a_亚麻酸、去氢茯苓酸、齐墩果酸、亚油酸、棕榈油 酸甲酯、棕榈酸、棕榈酸乙酯、胡萝卜苷和阿福豆苷。
【文档编号】G01N30/02GK105974030SQ201610583987
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月22日
【发明人】萧伟, 林夏, 何艳梅, 王伟, 秦建平, 李家春, 黄文哲, 丁岗, 王振中
【申请人】江苏康缘药业股份有限公司