专利名称：：一种基于中药有效成分群的中药组方设计技术的制作方法
技术领域：
：本发明针对中药方剂现代研究的关键瓶颈问题，通过信息整合、数据挖掘、系统建模、层次分析、有效辨识、优化设计、整体评价，建立适宜于中医药整体作用特点的中药组方设计技术，为中药及其复方现代化的研究，同时也为中药的二次开发和创新药物的研发提供技术支撑。
背景技术：
：中药及其方剂(复方)是中医临床用药的主要形式。目前，中药的研究有两种基本思路一种是将中药当成植物或天然药物，按传统经典式的方法进行研究，提取其活性部位，分离化学成分，定结构，乃至人工合成，然后进行药效学、药动学、毒理学的研究，最后过渡到临床试验。这种研究思路，目前仍占相当的地位，他们主要研究单味中药，然后从中找到单体，应用于临床。另一种思路是近30多年来逐步形成的，即是中医药的观点，确切地说按中西医结合的观点对中药及其复方进行研究，其研究的特点是遵循中医药理论，密切结合中医临床疗效，运用现代科学的研究手段开展中药和复方的研究，其主要目的是阐明中医药理论，阐明组方规律和开发新药、研制新药，促进中药现代化。本发明的基本思路是以中医药配伍理论为指导，以临床有效方剂为研究对象，以已有中药有效物质基础和作用机理研究成果为基础，以化学信息学、生物信息学、分子生物学、分子药理学、数理统计学为理论支持，以系统建模和优化设计为主线，建立基于中药有效成分群的中药组方设计技术。即遴选一种临床常见且发病机制相对清楚的疾病为研究病种，优选药效物质基础研究较深入的临床有效方剂为研究对象，建立分子、细胞、整体三个水平的既相互补充又相互映证的系统药效筛选与验证模型，创建君、臣、佐、使四个层次的中药有效成分群辨识及其关联研究方法，集成信息学、现代生物学、计算机科学、现代药理学、数学药理学等五项主要技术，针对中药方剂现代研究的关键瓶颈问题，通过信息整合、数据挖掘、系统建模、层次分析、有效辨识、优化设计、整体评价，建立适宜于中医药整体作用特点的中药组方设计技术，为中药复方现代化的研究，同时也为中药的二次开发和创新药物的研发提供技术支撑。
发明内容本发明是在中医配伍理论的指导下，应用计算机辅助药物设计技术，现代生物学技术和数理统计方法，通过系统建模和优化技术，明确中药有效成分群与方剂配伍的关系，建立基于有效成分群的中药组方设计技术，为中药复方的二次开发和创新药物的研发提供技术支撑。目前，中药方剂的研究主要集中在基于药材或饮片(宏观层面)和基于有效部位(中观层面)的研究，缺少基于有效成分群(微观层面)的研究，制约了中药复方的二次开发和创新药物的研发。本发明提出的基于中药有效成分群的中药组方设计技术正是解决上述问题的有益尝试，对推进中药复方的现代化具有积极的意义，本发明以黄连解毒汤为研究对象，综合并集成信息整合(化学、生物学信息数据库建立)、数据挖掘(方剂巳有药理作用和分子机制的知识库建立)、系统建模(基于脓毒症发病机制的分子病理模型和细胞、整体水平的药效模型构建)、层次分析(基于中医配伍理论、现代分子生物学和药理学的有效成分群分类和基于脓毒症分子、细胞、整体水平药效模型的症侯分类)、有效辨识(计算机辅助药物设计技术和体内外药效模型验证)、优化设计(基于脓毒症发病机制的病理模型和计算机辅助药物设计技术的应用)、整体评价(多指标脓毒症整体动物模型和多指标综合指数评价法)等多项技术，用于黄连解毒汤中药有效成分群组方设计，最终确定黄连解毒汤中药有效成分群组方。中药有效成分群复方或中药分子复方与以饮片或有效部位配伍的中药复方相比较，具有化学成分清楚，药理作用明确、分子机制明了，质量标准可控，药物制剂简单，临床应用方便等诸多优点。黄连解毒汤中药有效成分群组方设计技术具有典型和示范作用，亦可用于其它化学成分相对清楚、药理作用相对明确、方剂药味组成相对较少的的中药复方有效成分群组方设计。具体歩骤是①选择临床治疗脓毒症的有效方剂黄连解毒汤(黄连、黄芩、黄柏、栀子)作为研究对象，以中医配伍理论君臣佐使为指导，根据脓毒症发病机理分子机制对方剂进行君臣佐使有效成分功能群的研究。②应用化学信息学及其相关技术，通过文献调研、数据库访问等方法，建立黄连解毒汤各单味药的化学成分信息数据库。其中包括化合物名称、分子式、分子量、结构式(二维、三维)、物化性质、药理作用、分子机制、药代、毒性、临床应用等。③通过文献调研、数据库访问等方法，建立黄连解毒汤复方数据库。其中包括组成、剂量、功能与主治、化学、药理作用、分子机制、药代、毒性、临床应用等。④在文献调研、数据库访问、数据挖掘的基础上，针对方剂主要且明确的药理作用，应用计算机辅助药物设计技术，系统建立其分子药理模型。⑤根据分子药理模型筛选结果，对有效成分聚类并以得分高低进行排对。◎根据计算机辅助药物设计功能分类方法，确定其君臣佐使作用，并对其聚类。⑦根据计算机辅助药物设计分子药理模型筛选结果，分别在对应的体内体外药理模型中验证。⑧根据分子药理模型筛选和君臣佐使聚类结果，结合体内体外药理模型药理作用强度、多靶点作用和化合物取得难易程度，从每类模型中选取数个分子组成复方。◎在体现中医证侯的整体动物模型中，对组方进行验证。取得反映复方整体作用特点的基于有效部位群的中药组方。⑩通过优化设计、系统研究和反复验证，最终建立起适宜于中医药整体作用特点的基于有效成分群的中药组方设计技术。中药复方中的每味药所处君、臣、佐、使地位不同，但它们却各司其职、互助互补、相互制约、相互协调，保持着完美组合，发挥整体或群体功效。本发明首先采用计算机辅助药物设计技术，系统建立脓毒症表症分子药理模型。根据分子药理模型筛选结果，对有效成分聚类并以得分高低进行排对，根据计算机辅助药物设计功能分类方法，确定其君臣佐使作用，并对其聚类，根据筛选结果将复方中含有有效成分同样划分为君、臣、佐、使群，然后探讨不同有效部位群的药物之间的整体作用。因此，其药效学试验、药理毒理学试验应以这样的整体为受试物质，分别进行各个"有效部位群"的药效、药理毒理试验。以动物试验反映这个群体的药效作用和毒性状况，为临床研究提供安全、有效性基础。本发明充分借助整体动物实验、化学信息学、生物信息学、计算机虛拟筛选技术，进行有效部位群中化合物活性的测定、有效部位群之间的相互关系以及组方各阶段的研究，将现代植物化学、化学信息学与数学药理学密切结合、联合应用，最后通过药理学这一研究工具，以利于我们从微观到客观，从局部到整体、从各个层面全方位研究传统药物的疗效物质基础，获得更多信息，为临床研究提供必要的依据。本发明建立的中药有效成分群的中药组成技术具有高效快捷、经济新颖的特点。该发明直接对应中药分子新型复方的产生。上述发明步骤筛选出来的化学成分分子，大多可以直接定购，少数不能购买的成分也可以从药材中提取，取材便利可行。这种分子新复方从原中药复方中来，继承了原方的其中一种药理作用，更具针对性，却又抛弃了中药方剂不利于制剂顺应性差的缺点，通过药效毒理实验验证之后，便可制剂成方，申报新药。该发明前段实验设计在计算机虚拟状态下完成，无需使用和耗费化学药剂，经济安全，而后期的药理实验又对该方法的实际药效进行了验证，使该发明更具合理性。本发明为中药复方现代化、中药复方创新提供了一条可行性思路。图1是黄连解毒汤化学成分分子库(部分)。图2是脓毒症发病机理分子机制系统建模。图3是脓毒症发病机理系统建模后耙标。图4有效成分分子组方(配伍)、整体评价技术路线。具体实施例方式下面结合实施例，对本发明做进一步的说明，但本发明并不受限于下述实施例。实施例1研究对象的确定病种及方剂的选择选取临床常见难治的脓毒症和化学成分清楚、主要药效明确、临床疗效肯定的治疗脓毒症方剂"黄连解毒汤"为研究对象。实施例2复方化学成分数据库的建立本发明应用化学信息学及其相关技术，通过文献调研、数据库访问等方法，建立"黄连解毒汤(黄连、黄芩、黄柏、栀子)"各单味药的化学成分及复方中由于煎煮等作用新产生的化学成分信息数据库。以中科院上海有机化学研究所的化学专业数据库和Dr.Duke'sPhytochemicalandEthnobotanicalDatabases这两个化合物数据库为主，通过数据库访问方式收集两方各单味药的化学成分，并结合文献调研，对复方中因煎煮等作用形成的新成分进行补遗。复方化学成分数据库的信息内容包括化合物中英文名称、分子式、分子量、结构式(二维、三维)、物化性质、药理作用、分子机制、药代、毒性、临床应用、相关文献等。主要利用ISIS/Draw的分子结构描画功能和ISIS/Base的数据库管理功能创建"黄连解毒汤"。本发明构建了黄连解毒汤四味组方药材的四个化学成分子库，共计分子数目为222个。(图1)实施例3针对脓毒症发病机理分子机制系统建模(图2)以脓毒症为实例，建立相应的病理机制系统模型，见附图2脓毒症发病机理分子机制生物网络图。实施例4针对脓毒症发病机理系统建模后靶标的确定(图3)在脓毒症的病理机制系统模型中，炎症、细菌感染、发热是症候中的主要矛盾，而这些病理途径中居于上游的靶点和起决定性作用的靶点是关键的靶标。见附图3"君臣佐使"有效成分分子群与病机靶标对映图。实施例5有效成分的功能分群以中医配伍理论"君臣佐使"为指导，以根据脓毒症发病机理分子机制建立的系统模型为基础，对"黄连解毒汤"方剂进行"君、臣、佐、使"有效成分功能分群。君药"分子群根据中医理论，君药是复方方剂中针对疾病与症候起主要治疗作用的药物，用药理学的现代语言阐释即是针对主要病机靶标的药物成分。在脓毒症的药理机制系统模型中，炎症是症候中的主要矛盾，而这些病理途径中又分布着一些关键的靶标。君药分子群筛分即针对这些关键靶标进行。筛分方法综合运用现代计算机药物设计与筛选技术和现代分子生物学筛选技术。筛分技术路线以计算机药物设计与筛选技术为起始运作模块，对大量的复方化学成分分子进行初步筛分，初歩筛分结果再进入分子生物学筛分通道进行验证与再次筛分，以此节约成本与人力物力。I.计算机药物设计与筛选技术A.分子对接对于在PDB蛋白分子库中可以找到三维晶体结构的靶标，直接采用分子对接的技术进行研究。以真实实验数据形成的靶标分子三维结构为基础的分子对接技术，可以保证筛选的精度。对接技术环节采用最新的Schrodinger软件包中的专利技术Induced-fit，靶标的活性结合口袋真正实现柔性处理，并处理靶标口袋体积的伸缩与形状的柔变，靶标分子与复方化学成分分子实现真正的"诱导契合"式对接，大大加强了活性预测精度。B.同源模建对于目前尚没有三维晶体结构报道的耙标蛋白，利用同源模建技术构建靶标蛋白，并在此模建蛋白基础上进行分子对接。C.药效团搜索对于既没有三维晶体结构、又无法进行同源模建的靶标蛋白，则利用其配体结构构建活性相关药效团，利用构建完成的药效团模型作为提问结构对复方化学成分分子库进行搜索，命中的化合物即是可能具有该靶标生物活性的化学成分。同时，这项技术同时与以上两种技术配合使用，加强筛选精度。n.分子生物学筛选由以上计算机药物设计与筛选技术筛分出来的化合物，进入分子生物学筛选通道进行验证与二次筛分。最终确定君药分子群。②"臣药"分子群在中医理论中臣药是处方中辅助君药起治疗作用的药物，那么用现代药理学的语言阐释就是针对次要或起辅助作用的病机耙标的复方化学成分分子。臣药分子群的筛分与君药分子群的筛分流程是一样的，所不同的是针对不同的靶标。③"佐药"分子群依据中医理论，佐药是处方中佐助君药臣药，或与君药臣药能相反相成起治疗作用的药物。佐药作用的现代药理学阐释可能与一些非治疗性药物靶点相关，如P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白等。P-糖蛋白是ATP结合和转运载体蛋白中最大的一个亚系，它在许多组织有分布，是一种ATP依赖性膜转运体，作为药物转运子，其作用类似于排出泵，可将药物从细胞内外排而使胞内药物浓度降低，从而降低药效。因此，p-糖蛋白与底物及调节子之间的相互作用能影响药物的吸收、分布、代谢、排泄。抑制p-糖蛋白可以有效增强主要药效成分"君臣"药物的药效作用。因此，中药复方"佐药"分子群对君臣药的佐助作用很可能是通过对p-糖蛋白这一类非治疗性药物靶点产生作用而实现的。对佐药分子群的筛分依据以上理论分析，采用计算机辅助药物筛选技术，以p-糖蛋白等非治疗性靶点为筛选模板，筛分复方化学成分分子库中的佐药分子。④"使药"分子群在中医理论中"使药"是处方中引导诸药达到患病脏腑、相关经络、病位。研究发现，一些化合物分子可通过增加负责药物运输的水甘油通道蛋白、有机阴、阳离子转运体的含量，促使进入细胞的药物含量增多；另一方面，一些化合物分子可以通过改变其他药物分子作用的内环境，如增加细胞膜的通透性，而达到"引经"的作用，如冰片中的龙脑可以改变细胞膜通透性，促进血-脑脊液屏障开放，引药入脑。这些作用均纳入"使药"作用，具有这些作用的复方化学成分分子筛分进入"使药"分子群。使药分子群的筛分首先利用计算机QSAR(定量结构-活性关系)药物活性预测技术结合人工智能技术如人工神经网络和支持向量机技术，以己知的具有以上作用的化合物为训练集，训练产生使药识别模型，对复方中的化学成分分子进行分类识别，筛分可能具有"使药"功能的化学成分。筛分出来的化合物再采用细胞生物学、分子生物学等相关技术对其进行验证与二次筛分，通过测量这些化学成分分子对水甘油通道蛋白等的含量、细胞膜通透性的改变程度等验证并评价筛分最终"使药"分子群。实施例6君药有效成分群的计算机药物设计与筛选技术-分子对接分子对接对于在PDB蛋白分子库中可以找到三维晶体结构的靶标，直接采用分子对接技术进行研究。选择数据库中入录分子的三维结构作为靶标分子为基础进行分子对接技术研究，具有较好的筛选精度。对接技术环节采用最新的Schrodinger软件包中的专利技术Induced-fit，耙标的活性结合口袋真正实现柔性处理，并处理靶标口袋体积的伸縮与形状的柔变，耙标分子与复方化学成分分子实现真正的"诱导契合"式对接，大大加强活性预测精度。黄连解毒汤分子库222个分子与C0X-2对接结果打分见表1，并按打分高低排序。统计发现，打分大于5.0以上的分子有25个，说明黄连解毒汤中存在有效的C0X-2抑制活性化学成分，如己有C0X-2抑制活性报道的阿魏酸，在本发明中阿魏酸的打分为5.56，排序前十位。表1C0X-2分子对接打分表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>ferulicacid5.56alpha-cubebene5.55isoeugenol5.557-methoxybaicalein5.49methyldihydrojasmonate5,45phtha丄icacid-diocty1-ester5.38baicalcin5,29moslosooflavonc5.25neocnidi1ide5.224-phenyl-but-cis-3-eD-2-one5.21genipin5.16rivu丄arin5.155，2'，7'-trihydroxy-8-methoxy士'丄avanone5.13n-butylphthalide5.08panicolin5.02skullc即flavonel5.02scute柳oenin4,93实施例7君药有效成分群的计算机药物设计与筛选技术-同源模建同源模建对于目前尚没有三维晶体结构报道的靶标蛋白，利用同源模建技术构建靶标蛋白，并在此模建蛋白基础上进行分子对接。本发明中针对IKK-2的筛选采用这种方法。技术路线为l)序列比对利用Schrodinger软件包中的Prime模块比对IKK-2与蛋白库中的同源蛋白，找到合适的同源模建蛋白模板。2)蛋白模建以找到的同源蛋白为模板，进行IKK-2激酶的蛋白模建，特别是对于结合口袋的模建非常关键，采用与己知配体联合模建的方法，得到精确的蛋白模型。3)分子对接以同源模建的IKK-2蛋白为模板进行复方分子库的对接。GALAHAD得到药效团模型20个，结合IKK-]3同源模建体活性位点的分析，同时考虑药效团模型能量打分，经挑选得到药效团模型。将该药效团模型置入AndrewBaxter等构建的同源模建IKK-2活性结合腔中，发现该模型与IKK-2结合口袋的关键位点十分吻合。以该药效团模型为"提问模板"进行Unity的化合物搜索。得到命中化合物40个。表2中列出了所有搜索到的40个命中化合物，QFIT表示化合物与药效团模型命中程度的打分表2Unity搜索到的IKK-2抑制活性药效团命中化合物10<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例8君药有效成分群的抗炎耙点PDE-4的虚拟筛选黄连解毒汤化学成分分子与PDE-4的对接结果如表3，并依据对接打分高低排序。由于PDE-4的活性口袋并非封闭性结合腔，对接分子与结合腔残基的碰撞情况较少，所以整体的对接打分并无太多低分或负分，但是对接打分高的分子仍然应视为可能具有PDE-4抑制活性的化合物。统计结果表明，对接打分大于5.0的分子有23个，这说明黄连解毒汤中具有天然PDE-4抑制剂存在。表3PDE-4分子对接打分表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例9君药有效成分群中化学成分的综合评价以C0X-2和PDE-4分子对接打分排序前20%的分子作为可能具有C0X-2和PDE-4抑制生物活性的分子，IKK-2药效团搜索命中的分子作为可能具有IKK-2抑制生物活性的分子，分析黄连解毒汤化学成分的多耙导向作用。表4列出了可能同时抑制2个及2个以上耙酶的分子，共计28个，其中2个分子对三个靶标都呈现抑制作用。表4黄连解毒汤化学成分的针对多靶的综合评价<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>5，2'，5'-trihydro:xy-6，7，8-trimethoxyflavanone+—+5，2'-dihyrdoxy-6，7，8-trimethoxyflavone++5，5'-dimethylfurfuralether++一5，7，4'-trihydroxy-6-methoxyflavanone+—+5，8-dihydroxy-6，7-dimethoxyflavone++一baicalein—++chlorogenicacid-++chrysin-6-C-beta-glucoside—++gardoside—+十geniposide—++herculin++—isoscutellarein-8-O-glucoside++—ligustilide++—lirmlool++methyldihydrojasmonate++—oroxylin-A-7-0-glucuronide—++phthalicacid-dioctyl-ester++—rivularine++一salidroside+++scuteamoenin+—+viscidulinll++wogonin-5-beta-D-glucoside—++wogonin-7-beta-D-gluconide-methyl-ester一++wogonoside—++本发明中选取目前已经明确的炎症靶标COX-2、IKK-2、PDE-4，以之为筛选靶点对黄连解毒汤化学成分分子库进行虚拟筛选，并在此基础上进行综合分析，发现黄连解毒汤中存在大量具有多靶导向作用的分子，即能同时对两个或两个以上的耙点产生作用，抑制它们的活性，这说明中药复方的多靶治疗作用是有物质基础的，在此基础下筛选的多耙点化学成分进行体内外药理活性的研究。实施例10君药有效成分群的分子生物学筛选-COX-2酶抑制活性测试COX-2酶抑制活性测试应用体外酶反应实验体系，采用EIA法观察受试化合物对环氧化酶-2(C0X-2)纯酶活性的影响。参照试剂盒说明书，96孔酶标板设试剂空白对照孔、SI-S8标准对照孔、TA孔、NSB孔、B0孔、C0X-2空白对照孔、C0X-2100%酶活性孔、样品孔等，每孔设两个复孔。样品孔中加入950uL反应缓冲液[O.1MTris-HCl(pH8.0)含5mMEDTAand211M苯酚]、10iiL亚铁血红素、10uL。COX-2、20uL倍比稀释的不同浓度的受试化合物溶液；100%酶活性孔除不加受试化合物外，其余同样品孔COX-2空白对照孔加970wL反应缓冲液、10uL亚铁血红素和灭活的C0X-210uL。各孔37。C预孵IO分钟后，加入花生四烯酸(100umol/L)混匀后37°C，水浴2分钟后，加入50yL1MHC1终止酶反应。取出后各管加入IOOpLSnC12。溶液混匀置室温避光反应5分种。标准对照对照孔加倍比稀释的不同浓度的PGE2以酶免疫测定法(EIA法)检测前列腺PGE2。，以PGE2。的生成量计算酶的活性。计算IC50，分析其对酶活性的抑制强度及选择性。实施例ll君药有效成分群的分子生物学筛选-IKK-2抑制活性测试IKK-2抑制活性测试实验方法将IkB-a底物及ATP的溶液加于以受试化合物预先培养5分钟于含IKK-2酶的聚丙烯板内开始反应。然后将反应混合物于25"C培养1小时，置于冰上通过加150u].10%三氯醋酸及5%焦磷酸二钠停止反应。混合后，将整个停止反应的反应混合物移入预湿的PackardUnifilter过滤板，抽吸并用250yLddH20洗6次，使用PackardFiltermateHarvester。然后将过滤板风干，补充40yLMicroscint20闪烁液，使用PackardT叩Count闪烁计数器定量"P-标记的反应产物，可以得到不同化合物IKK-2抑制活性。实施例12君药有效成分群的分子生物学筛选-PDE-4抑制活性测试PDE-4抑制活性测试:实验材料96孔微量滴定板(MTS);混合物(20mMTris(pH7.4)，5mMMgCl2,0.5pMcAMP，[:!H]cAMP(约30，OOOcpm/测定)，试验化合物，主要含有PDE4活性物的人嗜中性粒细胞胞质溶胶)；PDE-3特异性抑制剂Motapizone(liiM);DMSO;;5'-核苷酶(响尾蛇毒液(Crotalusatroxsnakevenom);QAES印hadexA-25柱;甲酸铵(pH6.0)。实验方法37'C预温育5分钟后，加入底物(cAMP)启动反应，于37'C进一步温育测定物15分钟。加入50yl0.2NHCL终止反应，在冰上放置测定物约10分钟。在37。C与25yg5'-核苷酶(响尾蛇毒液(Crotalusatroxsnakevenom))—起温育10分钟后，将测定物上柱到QAES印hadexA-25柱(lml床体积)。柱用2ml30mM甲酸铵(PH6.0)洗脱，计数洗出液测定放射活性，然后得出不同化合物对PDE-4抑制活性。实施例13君药有效成分群的分子生物学筛选-HMGB-l抑制活性测试HMGB-1抑制活性测试实验材料动物模型制备清洁级雄性Wistar大鼠，体重220250g。大鼠适应性词养1周后行CLP，复制严重腹腔感染致脓毒症模型。术前将大鼠称重、编号，并禁食12h，自由饮水。以盐酸氯胺酮注射液与速眠新II注射液按8:3体积比混合，肌肉注射麻醉大鼠后固定，常规消毒，铺无菌洞巾。沿腹正中线作一长约1.5cm的切口，暴露盲肠并于根部结扎，避免结扎回肠以及盲肠系膜血管，用16号穿刺针贯通穿刺盲肠3次形成肠瘘，并留置一条宽2.0ram的橡皮片以防针孔闭合。将盲肠还纳腹腔，逐层缝合腹壁切口，术毕立即皮下注射生理盐水抗休克，术后自由饮水。动物分组及给药将大鼠按随机数字表法分为正常对照组、假手术组、模型组和治疗组4组。治疗组分别于CLP后0.5、12、24、36、48和60h经阴茎背静脉注射供试品，按照观察时间点分为CLP后2、8、24、48和72h时间点，每个时间点8只动物；模型组依同法分组并平行注射等量生理盐水。标本采集与处理按相应时间点将动物麻醉后，腹主动脉无菌采血，留取3ml血于质量分数为3.8。/。的枸橼酸钠(1:9)抗凝试管中，4。C下离心5min，分离血浆，-80。C保存待测。检测指标血浆HMGB-l含量用HMGB-l酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒测定血浆HMGB-1含量，检测步骤严格按说明书进行，将样品吸光度(A)值代入标准曲线，计算出样品HMGB-1浓度。受试化合物对HMGB-l的抑制作用采用以上方法检测。实施例14君药有效成分群的生物学筛选-内毒素抑制活性的实验内毒素抑制活性的生物实验体外鲎试剂定性法试验设受试分子组、地塞米松阳性对照组、内毒素组、溶媒对照组、阴性对照组。将侯选分子组、地塞米松用溶媒稀释为一系列所需浓度，用试剂溶解液将内毒素溶解(10IU/ml).在O.Olml内毒素加入0.lml药液，于37'C恒温水浴中保温1小时或4小时。其它组同样条件下温浴。温浴后，另取一套试管分别加入鲎试剂0.lml及温浴反应后之反应液0.lml混匀，再置37t:恒温水浴中保温1小时，第二次温浴后轻轻取出试管架，缓缓将试管架倒转180°，观察判断试验结果。以管内呈坚实之凝胶者为(+)，不呈凝胶状或呈凝胶状但不能保持完整者为(-)。通过该试验观察受试分子体外抗内毒素作用并为体内试验剂量设计提供依据。体内抗内毒素活性实验取昆明种小鼠，随机分组，每组12只小鼠，正常组灌胃自来水每天0.5mL，连续4d;受试组灌胃不同剂量的黄连解毒汤4d，末次给药后受试组、正常组、地塞米松组腹腔注射D—GALN150mg/kg，24h后眼睚取血分离血清，置-30°C冰箱，待测IL-2。实施例15君药有效成分群的生物学筛选-抑菌实验抑菌实验主要针对脓毒症常见感染源革兰氏阴性菌，也包括部分革兰氏阳性菌，具体如下肺炎链球菌(31002)、金黄色葡萄球菌(26003)、绿脓假单胞菌(10104)、大肠埃希菌(44102)。经活化、鉴定后取对数生长期菌液进行实验肺炎链球菌37'C培养18h，肺炎链球菌用血清肉汤培养基及血液琼脂培养基培养外，其它3种菌均用肉膏汤及普通琼脂培养基培养。1)琼脂扩散法(抑菌环直径大小的测定)取直径12cm平皿，倾入培养基(血液琼脂培养基或普通琼脂培养基)15mL，冷凝后用灭菌的棉拭子蘸取供试菌菌液均匀涂布在培养基表面，室温下放置一定时间。用直径6mm的打孔器在琼脂平皿上打孔，每孔加一定量药液，每种药液设3L。37'C培养24h后取出，测抑菌环直径，并求出每种药液3个孔抑菌环直径的平均值。2)试管稀释法(MIC、MBC的测定)取无菌试管若干支，用液体培养基(血清肉汤或肉膏汤)等倍稀释药物后，各管加0.1mL供试菌液，同时设培养基对照管和菌液对照管，37'C培养24h后取出观察结果，在对照管符合要求的情况下，逐一观察各试验管，以能抑制试验菌生长的药物最高稀释度为最低抑菌浓度(MIC)，并将各无菌生长的试管中的培养物转接至相应培养基的琼脂平板上。37'C培养24h后取出观察结果，以杀死99.9%试验菌菌体的药物最高稀释度为最低杀菌浓度(MBC)。实施例16君药有效成分群的生物学筛选-解热作用解热作用的动物实验取Wistar种大鼠50只，体重220-250g，雌雄各半，分为受试化合物高中低剂量三组、阿斯匹林阳性对照组组及生理盐水空白对照组。除生理盐水组外其余各组大鼠给与参考剂量筛选得出的目标化合物，注射后2h给药，每隔lh测l次肛温.连续8h。记录服药前体温及服药后不同时间的体温变化。受试化合物的降温效果与对照组比较并进行统计学分析，判定受试化合物的解热作用并给出最佳剂量参考。实施例17其他有效成分分子群的研究各有效部位群均采用上述研究方法进行系统筛选，针对不同靶点和病理模型针对不同有效群进行逐个分析研究，得出各有效部位群中关键的有效成分分子。实施例18有效成分分子组方(配伍)、整体评价原则与方法组方(配伍)遵循的基本原则经过系统筛选和验证得到的"君臣佐使"有效成分分子群，还须进行有效成分的配伍设计得到与原方药理作用相同(或大于原方药理作用)的新方剂。中药有效成分群配伍的研究，其实质是药物相互作用动力学的研究。当中药有效成分群配伍时，中药有效成分间发生不同类型的相互影响，综合表现为药效的增强或减弱等，通过分析多个有效成分不同剂量与效应间的定量规律，最终实现中药有效成分群配伍的最优化。中药有效成分群组方的基本原则是有理、有利、有据。有理就是在中医理论和药理机制上，组方或配伍有合理的文献或实验依据。有利就是药效上有协同作用而毒性不增；毒性降低或毒性器官分散，而药效不减；起效或作用时间互补；药效范围扩展，作用于多种症状。有据就是组分药选择合理；剂量配比合适，已接近最佳配比；用药剂量恰当，过小药效减小，过大并无必要。其次，科学、合理、客观的中药有效成分群复方，必须选择理想的整体评价方法。中药有效成分群组方的理想评价方法是数学上可立。数学模型严谨；专业上可行。具有治疗学价值；统计上可信。测定指标合理；逻辑上合理。根据以上原则，由于中药17有效成分群复方为多成分、多剂量和多比例配伍，应将多指标进行单一化处理，即综合分析。多指标综合指数法由于可以对多指标进行综合分析，所以更适合中药有效成分群组方进行评价。通过以上信息整合、数据挖掘、系统建模、层次分析、有效辨识、优化设计、整体评价等研究过程，建立黄连解毒汤中药有效成分群组方技术。最终确定黄连解毒汤中药有效成分群组方。实施例19有效成分分子组方(配伍)、整体评价技术路线遵循中医配伍理论和中药有效成分群组方有理、有利、有据的原则进行。依据均匀设计的原理，以"君臣佐使"四个有效分子群为考察因素，分子个数为考察水平，导出新配伍方剂。每个分子以最佳剂量配伍入方。组方与整体评价技术路线见图4。实施例20中药有效成分群分子组方入选标准①同类中药有效成分群分子中药效作用强的分子优先入选；②同类中药有效成分群分子中药效作用相同或相近时，参考计算机筛选、体外筛选和文献报道结果进行综合评价，选优者。③同类中药有效成分群分子中上述①和②相同或相近时，作用靶点多者优先。④同类中药有效成分群分子中上述①、②和③相同或相近时，易获得者(在中药中有效成分含量高、制备方法简单)优先。⑤同类中药有效成分群分子中上述①、②、③和④相同或相近时，剂量小(用量少)者优先。实施例21入选有效成分分子组方后验证试验建立试验动物模型，针对不同的病理模型将大鼠按随机数字表法分为正常对照组、假手术组、模型组、阳性对照组和治疗组。治疗组根据临床给药途径给药。模型组依同法分组并平行给予等量生理盐水，阳性对照组分别给予黄连解毒汤煎剂，观察得出结果。实施例22有效成分中抗炎作用分子预方的药理实验药效验证建立二甲苯致小鼠耳廓肿胀的炎症药理模型，对实施例17得到的黄连解毒汤抗炎作用分子预方中的每个成分小檗碱、阿魏酸、7—甲氧基黄芩素、京尼平分别进行抗炎药效验证。1.材料1.1实验动物本研究所自行繁殖昆明种小鼠，雌雄各半，体重20.0士2.0g。1.2药物小檗碱、阿魏酸、7—甲氧基黄芩素、京尼平均购于sigma公司。用蒸馏水溶解配成溶液备用。阳性对照药物为黄连解毒汤水煎煮浓缩液(0.8g生药/ml)。二甲苯(分析纯)购于天津大学科威公司。1.3仪器电子精密天平，日本，ShimadzuAUY220。2.实验方法取60只小鼠随机分为6组，每组10只，各组分别灌胃给药，空白对照组灌以蒸馏水，受试组分别给予4种受试药物，均按照150mg/kg给药，阳性对照组按25ml/kg给药，连续7d。所有小鼠，于末次给药后12h，右耳涂以二甲苯0.05ml，2h后，脱椎处死小鼠，剪取小鼠两耳用直径O.9cm的打孔器取其耳片，称重。小鼠耳廓肿胀度计算肿胀度-右耳重量一左耳重量。肿胀抑制率计算肿胀抑制率=(空白组肿胀度一给药组肿胀度)/空白组肿胀度X100%。3.实验结果表5抗炎药理实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注与空白组比较，*p<0.01，**p<0.001实验结果(表5)表明5种药物均有一定的抗炎效果，可用于"黄连解毒汤"抗炎作用分子新复方的组方成分。实施例23抗炎作用分子新复方的剂量配比与实验设计运用均匀设计软件UD2.2，以实施例18得到的4个分子为影响因子，因子取7水平，各因子水平都取200、100、50、25、12.5、6,25、0(单位:mg/kg)。软件生成均匀设计表117，根据设计表安排各因子和水平，得到表2的实验方案，其中一列为一种药，一行就是一种新配方，按表中行数值取相应的药混合即得此配方，共7种，其中第7组即为空白对照组，同时设黄连解毒汤水煮液阳性对照组。实施例24抗炎作用分子新复方的抗炎药理实验1.材料1.l实验动物本研究所自行繁殖昆明种小鼠，雌雄各半，体重20.0士2.0g。1.2药物小檗碱、阿魏酸、7—甲氧基黄芩素、京尼平均购于sigma公司。用蒸馏水溶解配成溶液备用。阳性对照药物为黄连解毒汤水煎煮浓縮液(0.8g生药/ml)。二甲苯(分析纯)购于天津大学科威公司。1.3仪器电子精密天平，日本，ShimadzuAUY220。2.实验方法取80只小鼠随机分为8组，每组10只，小鼠分别按表1灌胃给予受试药物，阳性对照组按25ml/kg给药，连续7d。所有小鼠，于末次给药后12h，右耳涂以二甲苯0.05ml，2h后，脱椎处死小鼠，剪取小鼠两耳用直径O.9cm的打孔器取其耳片，称重。小鼠耳廓肿胀度计算肿胀度=右耳重量_左耳重量。肿胀抑制率计算肿胀抑制率=(空白组肿胀度一给药组肿胀度)/空白组肿胀度X100X。3.实验结果结果见表6。黄连解毒汤水煎液阳性对照组肿胀抑制率为71.25%。直观分析，各种配方均有很好的炎症抑制效果，尤其是第一种配方炎症抑制率甚至超过了黄连解毒汤水煎液阳性对照。由软件生成的回归方程y=16.3+0.24*X(l)+0.128*X(2)+0.0802*X(3)+0.246*X(4)X(l)代表小檗碱给药剂量；X(2)代表阿魏酸给药剂量X(3)代表7_甲氧基黄芩素给药剂量；X(4)代表京尼平给药剂量y代表肿胀抑制率。因为回归系数某种程度上代表了其对应变量对结果炎症抑制率的贡献大小，通过回归系数比较0.24:0.128:0.0802:0.2466:3:2:6，粗略推测该黄连解毒汤抗炎作用分子新复方以小檗碱阿魏酸7—甲氧基黄芩素京尼平=6:3:2:6的配比成方炎症抑制效果可能会更好，经药理实验验证，其肿胀抑制率为71.02%，因此保留第一种配方32:16:8:1的剂量配比。表6配方均匀设计表及实验结果组别繁赋阿魏酸7—甲氧基黄萃素京尼平耳廓肿胀度(mg)抑制率(1200.0100.050.06.256.2±1.5**72.322100.025.06.2512.59.2±2,1*58.93350.06.25100.025.08.9±2.8*60.27425.0200.012.550.07.6±2.4*66.0712.550.0200.0100.09.0±2.2*59.8266.2512.525.0200.06.7±2.3*70.097000022.4±3.00注与空白组比较，*p<0.01，**p<0.00120权利要求1、本发明提供一种基于有效成分群的中药组方设计技术，其特征在于该技术集成信息整合(化学、生物学信息数据库建立)、数据挖掘(方剂已有药理作用和分子机制的知识库建立)、系统建模(基于发病机制的分子病理模型和细胞、整体水平的药效模型构建)、层次分析(基于中医配伍理论、现代分子生物学和药理学的有效成分群分类和基于病症分子、细胞、整体水平药效模型的症侯分类)、有效辨识(计算机辅助药物设计技术和体内外药效模型验证)、优化设计(基于发病机制的病理模型和计算机辅助药物设计技术的应用)、整体评价(多指标整体动物模型和多指标综合指数评价法)等多项技术，用于中药有效成分群组方设计。主要包括以下步骤1)选择临床有效方剂黄连解毒汤作为研究对象。2)应用化学信息学及其相关技术，通过文献调研、数据库访问等方法，建立方剂黄连解毒汤各单味药的化学成分信息数据库。其中包括化合物名称、分子式、分子量、结构式(二维、三维)、物化性质、药理作用、分子机制、药代、毒性、临床应用等。3)通过文献调研、数据库访问等方法，建立黄连解毒汤复方数据库。其中包括组成、剂量、功能与主治、化学、药理作用、分子机制、药代、毒性、临床应用等。4)在文献调研、数据库访问、数据挖掘的基础上，针对方剂主要且明确的药理作用，系统建立其脓毒症分子药理模型。5)以中医配伍理论君臣佐使为指导，根据脓毒症发病机理分子机制对方剂进行君臣佐使有效成分功能群的研究。6)应用计算机辅助药物设计技术，并结合分子药理模型筛选结果，对有效成分聚类并以得分高低进行排对。7)根据计算机辅助药物设计分子药理模型筛选结果，分别在对应的体内体外药理模型中验证。8)根据分子药理模型筛选和君臣佐使聚类结果，结合体内体外药理模型药理作用强度、多靶点作用和化合物取得难易程度，从每类模型中选取数个分子组成分子复方。9)在体现中医证侯的整体动物模型中，对组方进行验证。取得反映复方整体作用特点的基于有效部位群的中药组方。10)通过优化设计、系统研究和反复验证，最终建立起适宜于中医药整体作用特点的基于有效成分群的中药组方设计技术，得到新的中药分子复方。2、根据权利要求i所述的一种基于有效成分群的中药组方设计技术，其特征在于该方法不仅仅应用于权利要求l中(1)中所提到的黄连解毒汤，同时也可以应用于临床治疗有效、发病机理研究明确其他任何方剂。3、根据权利要求l和权利要求2所述的-种基于有效成分群的中药组方设计技术，其特征在于该方法不仅仅应用于权利要求1中(1)中所提到的脓毒症病理模型，同时也可以应用于发病机理研究明确的其他任何病理模型的研究。4、根据权利要求1所述的一种基于有效成分群的中药组方设计技术，其特征在于该方法中(4)涉及到分子药理模型建立中使用计算机辅助药物设计时使用的软件和方法不仅仅为实施例所列举，同等效果技术和方法亦可互相取代。5、根据权利要求1所述的一种基于有效成分群的中药组方设计技术，其特征在于该方法中(5).涉及到有效成分相似性聚类，以复方分子数量为指标，控制聚类相似度，在结构相似的分子群中挑选类药性评分靠前的分子进入对接，以加快对接速度，提高工作效率。6、根据权利要求]所述的一种基于有效成分群的中药组方设计技术，其特征在于该方法中(8)根据分子药理模型筛选和君臣佐使聚类结果，结合体内体外药理模型药理作用强度、多耙点作用和化合物取得难易程度，选择候选分子组成新分子复方，其中候选分子的数目无严格限制，根据每个实验结果综合分析得出合理数目。7、根据权利要求1所述的-种基于有效成分群的中药组方设计技术，其特征在于该方法同样适用于成分复杂的单味中药药效物质基础、作用机理及药效物质基础系药理筛选和验证模型建立，步骤(1)、(2)、(3)中的研究对象替换为单味中药，其他步骤如权利要求1所述。全文摘要本发明是以黄连解毒汤为研究对象，综合并集成信息整合(化学生物学信息数据库建立)、数据挖掘(方剂已有药理作用和分子机制的知识库建立)、系统建模(基于脓毒症发病机制的分子病理模型和细胞、整体水平的药效模型构建)、层次分析(基于中医配伍理论、现代分子生物学和药理学的有效成分群分类和基于脓毒症分子、细胞、整体水平药效模型的症侯分类)、有效辨识(计算机辅助药物设计技术和体内外药效模型验证)、优化设计(基于脓毒症发病机制的病理模型和计算机辅助药物设计技术的应用)、整体评价(多指标脓毒症整体动物模型和多指标综合指数评价法)等多项技术，用于黄连解毒汤中药有效成分群的组方设计，最终确定黄连解毒汤中药有效成分群组方。本发明建立的中药有效成分群的中药组方技术具有示范、高效、快捷、经济、新颖的特点。应用该发明可产生基于中药有效成分群的中药分子新复方，为中药复方现代化、中药复方创新提供了一条可行性思路。文档编号G06F19/00GK101615222SQ20081005360公开日2009年12月30日申请日期2008年6月23日优先权日2008年6月23日发明者刘培勋,李欣孺,陈龙飞,静高,伟龙申请人:中国医学科学院放射医学研究所