一种青梅有效成分的提取方法
【专利摘要】本发明涉及一种青梅有效成分的提取方法，属于中药活性成分提取领域。为了克服现有技术中青梅提取物活性成分药效较差的技术不足，本发明提供一种青梅有效成分的提取方法，该有效成分通过超临界流体技术制备得到，其药效活性强，特别是在抗肿瘤方面，其显著优于采用现有技术制备得到的青梅提取物，适合制备成相应的药物用于临床。
【专利说明】
一种青梅有效成分的提取方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种青梅有效成分的提取方法，属于中药活性成分提取领域。
【背景技术】
[0002] 青梅为龙脑香科植物，多分布于我国福建、广东、海南等省。《神农本草》记载，青梅 性味甘平，入肝、脾、肺、大肠经，有收敛生津的作用。在民间长期用作杀菌消毒，治疗肝炎及 提取中药龙脑香。青梅是一种常见药食两用的植物。现代医学研究表明，青梅具有消除疲 劳、抗肿瘤、改善肠胃功能、抗菌、抗过敏、保护肝脏等功效。
[0003] 海南青梅叶部分的80%乙醇提取物已证实具有良好抗氧化活性(尹文清，宋鑫明， 陈光英，等.青梅叶中多酚含量测定及抗氧化活性研究.食品安全与检测，2009，34: 283-286)，但其活性成分是什么尚未确定；而其茎的粗提取物已经被证实具有优良抗HIVd-W 朴，陈光英，韩长日，等.药用植物的提取物及其应用CN102724990)、抗肿瘤(袁媛，王琳，田 丽美，等.MTT法筛选青梅对SPCA-I体外增殖抑制作用有效部位的研究，食品工业，2010，1: 10-11 )、抗炎(陈忠，杨燕，王天山，等.青梅和大叶鱼骨木提取浸膏的抑菌活性.时珍国医国 药，2009，20:445-446)等活性。
[0004]中国专利申请201410412708.8公开了一种青梅提取物在卷烟中的应用。将青梅洗 净、去核后称重，用5~10倍量的高粱酒浸泡，回流提取1~3小时后过滤，即得所需的青梅提 取物;将青梅提取物均匀地喷洒在烟丝上，并在恒温恒湿条件下平衡24h;青梅中的有效成 分以及其特有的香气在与烟丝复合后，能够有效改善卷烟的品质，提高卷烟的香气质。中国 专利申请200910014809.9公开了一种青梅花提取方法以及用途，其通过制备青梅花提取物 并将其与其他护肤成分复配，制得一种抗衰老护肤霜，并发现其具有抗氧化并能促进皮肤 细胞新陈代谢，延缓肌肤衰老的功效。中国专利申请201410210150.5公开了一种具有清除 自由基功能的海南青梅茎提取物及其制备方法，是在海南青梅茎的干燥粉末中加入有机溶 剂提取;提取液经过滤、减压浓缩得到总浸膏，加水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，减 压回收分别得到石油醚部分、乙酸乙酯部分，所得乙酸乙酯部分经氯仿与甲醇混合溶剂系 统梯度洗脱，其中体积比为100:30的氯仿与甲醇洗脱组分具有优良的清除自由基活性，其 可应用于抗氧化与清除自由基功能的保健食品、药品和食品中。
[0005] 超临界流体萃取(Supercritical Fluids Extraction，SFE)是利用超临界状态下 的流体作为萃取溶剂，从液体或固体物料中萃取出某种组分的一种新型分离技术。它克服 了传统萃取法费时费力、回收率低、污染严重、操作繁琐等问题，特别是消除了有机溶剂对 人体和环境的危害，因此被喻为"绿色环保技术"，并已广泛应用于医药、食品、化妆品及香 料工业等领域。经过20多年的发展，我国超临界流体萃取技术取得了显著成绩，实现了从理 论研究、中小试水平向大规模产业化的转型，使其研究应用同国际接轨。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术中青梅提取物活性成分药效较差的技术不足，本发明提供一种 青梅有效成分的提取方法，该有效成分通过超临界流体技术制备得到，其药效活性强，特别 是在抗肿瘤方面，其显著优于采用现有技术制备得到的青梅提取物，适合制备成相应的药 物用于临床。
[0007] 本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：
[0008] -种青梅有效成分的提取方法，其具体包括如下步骤：
[0009] 1)预处理：将青梅叶洗净晒干后粉碎成青梅粉后过20目筛，将青梅粉与夹带剂 95%乙醇混合制备成提取溶液；
[0010] 2)超临界萃取:将提取溶液置于的萃取釜中，向萃取釜内输入超临界二氧化碳流 体，设置萃取釜压力为20-25MPa，温度为30-50°C，萃取时间为1.5-4h;
[0011] 3)有效成分分离:溶解有萃出物的超临界二氧化碳流体经减压阀先后进入分离釜 I和分离釜Π ，设置分离釜I压力为7-8MPa，温度为48-52°C，收集萃取液I;设置分离釜Π 压 力为4-510^，温度为34-36°(：，收集萃取液11;
[0012] 4)有效成分的浓缩与制备:合并萃取液I和萃取液Π 得到萃取液的混合液，采用旋 转蒸发仪浓缩至少量液体，50-60°C烘干成膏状即可得到青梅有效成分。
[0013] 上述所述的青梅有效成分的提取方法中，所述的提取溶液中青梅粉与夹带剂95% 乙醇的质量比1:0.8-4,优选为1:2.4。
[0014] 上述所述的青梅有效成分的提取方法中，所述的超临界萃取工艺中二氧化碳的流 量为 30-35L/h。
[0015] 作为本发明所优选的一种实施方式，所述的青梅有效成分的提取方法具体包括如 下步骤：
[0016] 将青梅叶洗净晒干后粉碎成青梅粉后过20目筛，将青梅粉与夹带剂95%乙醇混合 制备成提取溶液;将提取溶液置于的萃取釜中，向萃取釜内输入超临界二氧化碳流体，设置 萃取釜压力为23MPa，温度为40°C，萃取时间为2.5h;溶解有萃出物的超临界二氧化碳流体 经减压阀先后进入分离釜I和分离釜Π ，设置分离釜I压力为7.5MPa，温度为50°C，收集萃取 液I;设置分离釜Π 压力为4.5MPa，温度为35°C，收集萃取液Π ;合并萃取液I和萃取液Π 得 到萃取液的混合液，采用旋转蒸发仪浓缩至少量液体，55°C烘干成膏状即可得到青梅有效 成分;其中所述的提取溶液中青梅粉与夹带剂95%乙醇的质量比1:2.4。
[0017] 本发明还请求保护按照上述提取工艺制备得到的青梅提取物。
[0018] 发明人将得到的青梅提取物进行药效动物实验，发现上述青梅提取物在药效方面 均显著优于采用现有工艺制备得到的青梅提取物，尤其是在抗肿瘤方面，其药效更为优异。 基于此，本发明请求保护上述中药提取物在制备抗肿瘤药物中的用途。
[0019] 本发明与现有技术相比具有如下有益的技术效果：
[0020] 本发明青梅有效成分通过超流体萃取技术制备得到，其产品的纯度高，产品的制 备工艺简单，易于操作，具有很强的应用前景。采用本发明所述的工艺制备得到的青梅提取 物的药效活性强，特别是在抗肿瘤方面，显著优于采用现有技术制备得到的青梅提取物，适 合制备成相应的药物用于临床。
【具体实施方式】
[0021] 下面采用具体实施例进一步说明本发明的内容。
[0022] 以下内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护范围。
[0023] 实施例1 一种青梅有效成分的提取方法
[0024] 所述的青梅有效成分的提取方法具体包括如下步骤：
[0025]将青梅叶洗净晒干后粉碎成青梅粉后过20目筛，将青梅粉与夹带剂95%乙醇混合 制备成提取溶液;将提取溶液置于的萃取釜中，向萃取釜内输入超临界二氧化碳流体，设置 萃取釜压力为20MPa，温度为30°C，萃取时间为1.5h;溶解有萃出物的超临界二氧化碳流体 经减压阀先后进入分离釜I和分离釜Π ，设置分离釜I压力为7MPa，温度为48°C，收集萃取液 I;设置分离釜Π 压力为4MPa，温度为34°C，收集萃取液Π ;合并萃取液I和萃取液Π 得到萃 取液的混合液，采用旋转蒸发仪浓缩至少量液体，50°C烘干成膏状即可得到青梅有效成分； 其中所述的提取溶液中青梅粉与夹带剂95%乙醇的质量比1:0.8。
[0026] 实施例2-种青梅有效成分的提取方法
[0027] 所述的青梅有效成分的提取方法具体包括如下步骤：
[0028]将青梅叶洗净晒干后粉碎成青梅粉后过20目筛，将青梅粉与夹带剂95%乙醇混合 制备成提取溶液;将提取溶液置于的萃取釜中，向萃取釜内输入超临界二氧化碳流体，设置 萃取釜压力为25MPa，温度为50°C，萃取时间为4h;溶解有萃出物的超临界二氧化碳流体经 减压阀先后进入分离釜I和分离釜Π ，设置分离釜I压力为8MPa，温度为52°C，收集萃取液I; 设置分离釜Π 压力为5MPa，温度为36°C，收集萃取液Π ;合并萃取液I和萃取液Π 得到萃取 液的混合液，采用旋转蒸发仪浓缩至少量液体，60°C烘干成膏状即可得到青梅有效成分;其 中所述的提取溶液中青梅粉与夹带剂95%乙醇的质量比1:4。
[0029] 实施例3-种青梅有效成分的提取方法
[0030] 所述的青梅有效成分的提取方法具体包括如下步骤：
[0031]将青梅叶洗净晒干后粉碎成青梅粉后过20目筛，将青梅粉与夹带剂95%乙醇混合 制备成提取溶液;将提取溶液置于的萃取釜中，向萃取釜内输入超临界二氧化碳流体，设置 萃取釜压力为23MPa，温度为40°C，萃取时间为2.5h;溶解有萃出物的超临界二氧化碳流体 经减压阀先后进入分离釜I和分离釜Π ，设置分离釜I压力为7.5MPa，温度为50°C，收集萃取 液I;设置分离釜Π 压力为4.5MPa，温度为35°C，收集萃取液Π ;合并萃取液I和萃取液Π 得 到萃取液的混合液，采用旋转蒸发仪浓缩至少量液体，55°C烘干成膏状即可得到青梅有效 成分;其中所述的提取溶液中青梅粉与夹带剂95%乙醇的质量比1:2.4。
[0032] 实施例4 一种青梅有效成分的提取方法
[0033] 所述的青梅有效成分的提取方法具体包括如下步骤：
[0034]将青梅叶洗净晒干后粉碎成青梅粉后过20目筛，将青梅粉与夹带剂95%乙醇混合 制备成提取溶液;将提取溶液置于的萃取釜中，向萃取釜内输入超临界二氧化碳流体，设置 萃取釜压力为20MPa，温度为50°C，萃取时间为2.5h;溶解有萃出物的超临界二氧化碳流体 经减压阀先后进入分离釜I和分离釜Π ，设置分离釜I压力为7MPa，温度为52°C，收集萃取液 I;设置分离釜Π 压力为4MPa，温度为36°C，收集萃取液Π ;合并萃取液I和萃取液Π 得到萃 取液的混合液，采用旋转蒸发仪浓缩至少量液体，50°C烘干成膏状即可得到青梅有效成分； 其中所述的提取溶液中青梅粉与夹带剂95%乙醇的质量比1:3。
[0035] 实施例5-种青梅有效成分的提取方法
[0036] 所述的青梅有效成分的提取方法具体包括如下步骤：
[0037]将青梅叶洗净晒干后粉碎成青梅粉后过20目筛，将青梅粉与夹带剂95%乙醇混合 制备成提取溶液;将提取溶液置于的萃取釜中，向萃取釜内输入超临界二氧化碳流体，设置 萃取釜压力为25MPa，温度为30°C，萃取时间为3h;溶解有萃出物的超临界二氧化碳流体经 减压阀先后进入分离釜I和分离釜Π ，设置分离釜I压力为8MPa，温度为48°C，收集萃取液I; 设置分离釜Π 压力为5MPa，温度为34°C，收集萃取液Π ;合并萃取液I和萃取液Π 得到萃取 液的混合液，采用旋转蒸发仪浓缩至少量液体，52°C烘干成膏状即可得到青梅有效成分;其 中所述的提取溶液中青梅粉与夹带剂95%乙醇的质量比1:2。
[0038]对比实施例1按照CN 103961383A实施例所述的制备方法制备得到。
[0039] 海南青梅茎提取物的制备方法步骤如下：1)取海南青梅的茎于室温阴干后粉碎， 过20-80目筛，然后加入甲醇、丙酮或50-95%的乙醇，室温浸泡、加热或超声提取，提取时间 为60分钟至7天，料液比为1:1~1:10;2)将提取液过滤、减压回收得到总浸膏，加水混悬，依 次用石油醚、乙酸乙酯萃取，减压回收分别得到石油醚部分和乙酸乙酯部分；乙酸乙酯部分 经氯仿与甲醇混合溶剂体系(梯度为100:0、100:5、100:30、100:40、100:60和100:100，体积 比）进行梯度洗脱，薄层色谱检测合并相同组分，得6个组分A-F(A，100 :0;B，100:5;C，100: 30;D，100:40;E，100:60;F，100:100);
[0040] 对比实施例2按照CN 101536967B实施例1所述的制备工艺制备得到。
[0041] 1)青梅花提取物通过以下方法制备：1)C02超临界提取青梅花的非极性成分:将含 水量彡1.5%干青梅花放入HA121-50-01型超临界C02萃取釜中，通入35Mpa的C02,在60°C温 度下循环动态萃取2h;然后进行减压分离，分离温度40°C，分离压力4Mpa，得到青梅花中的 非极性成分;2)极性成分的提取:将1)步萃取残渣用体积比为30%的乙醇，残渣与乙醇的重 量比为1:15,在80°C的温度下热回流提取2h;然后过滤得到滤液，在78°C温度下蒸馏得青梅 花中的极性成分;3)将1)步和2)步所得非极性成分与极性成分混合。
[0042] 实施例6青梅活性成分的抗肿瘤实验研究
[0043] 1、材料
[0044] 1.1 S18q小鼠腹水瘤细胞，由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供； RPMI-1640培养基购自GIBCO公司；ICR小鼠4-6周，18-22g，购自北京维通利华实验动物技术 有限公司；
[0045] 1.2受试药物及处理方法:实施例1-5、对比实施例1、对比实施例2所制备得到的青 梅提取物，采用生理盐水溶解。
[0046] 2、方法
[0047] 2.1 S18q细胞株传代培养方法
[0048]取体质量(20±2)g健康ICR小鼠，将体外培养良好的S18q细胞用生理盐水调节至浓 度为IX IO7个/mL，0.2mL/只注射入小鼠腹腔，每天摄取食、水。每日观察，见腹部胀大，备 用。
[0049] 2.2肿瘤接种、给药方法
[0050] 无菌条件下抽取生长良好传代小鼠的腹水，生理盐水清洗5遍，去除蛋白等杂质， 用生理盐水调节细胞浓度为I X IO7个/mL，0.2mL/只接种于常规皮肤消毒后的小鼠腋下。
[0051]将已成功接种的小鼠按体重随机分组，将各组分按实验设计剂量灌胃给药，模型 组给予等剂量生理盐水，1次/d。末次给药24h后，小鼠称重，处死小鼠剥取瘤块，精密称重。 [0052] 2.3数据处理方法
[0053]应用SPSS17.0软件进行统计学分析，实验数据以（X土 s)表示，P〈0.05为有统计学 差异。
[0054] 抑瘤率=(模型组平均瘤重一用药组平均瘤重)/模型组平均瘤重X 100%
[0055] 3、结果
[0056] 结果见表1。
[0057]表1抗肿瘤活性成分对S18q小鼠腋下实体瘤的抑瘤率（_γ±5)
[0059] 与模型组对照比较，*Ρ〈0.05,林？〈0.01;与对比实施例1组比较，卞〈0.05， #叩〈 0.01；
[0060] 与对比实施例2组比较，*P〈0.05，Mp〈0.01。
[0061] 本发明制备方法所得抗肿瘤活性部位能显著降低S18q小鼠腋下实体瘤的瘤重，具 有显著的抗肿瘤效果，与对比实施例相比较，其抗肿瘤效果更好。其中以实施例3所对应的 的工艺的青梅提取物的抗肿瘤活性最强，为本发明的最优实施例。
【主权项】
1. 一种青梅有效成分的提取方法，其具体包括如下步骤： 1) 预处理:将青梅叶洗净晒干后粉碎成青梅粉后过20目筛，将青梅粉与夹带剂95%乙 醇混合制备成提取溶液； 2) 超临界萃取:将提取溶液置于萃取釜中，向萃取釜内输入超临界二氧化碳流体，设置 萃取釜压力为20-25MPa，温度为30-50 °C，萃取时间为1 · 5-4h; 3) 有效成分分离:溶解有萃出物的超临界二氧化碳流体经减压阀先后进入分离釜I和 分离釜Π ，设置分离釜I压力为7-8MPa，温度为48-52°C，收集萃取液I;设置分离釜Π 压力为 4-5MPa，温度为34-36 °C，收集萃取液Π ; 4) 有效成分的浓缩与制备:合并萃取液I和萃取液Π 得到萃取液的混合液，采用旋转蒸 发仪浓缩至少量液体，50-60°C烘干成膏状即可得到青梅有效成分。2. 根据权利要求1所述的青梅有效成分的提取方法，其特征在于，所述的提取溶液中青 梅粉与夹带剂95%乙醇的质量比1:0.8-4。3. 根据权利要求2所述的青梅有效成分的提取方法，其特征在于，所述的提取溶液中青 梅粉与夹带剂95 %乙醇的质量比1:2.4。4. 根据权利要求1所述的青梅有效成分的提取方法，其特征在于，所述的超临界萃取工 艺中二氧化碳的流量为30_35L/h。5. 根据权利要求1所述的青梅有效成分的提取方法，所述的青梅有效成分的提取方法 具体包括如下步骤： 将青梅叶洗净晒干后粉碎成青梅粉后过20目筛，将青梅粉与夹带剂95%乙醇混合制备 成提取溶液;将提取溶液置于的萃取釜中，向萃取釜内输入超临界二氧化碳流体，设置萃取 釜压力为23MPa，温度为40°C，萃取时间为2.5h;溶解有萃出物的超临界二氧化碳流体经减 压阀先后进入分离釜I和分离釜Π ，设置分离釜I压力为7.5MPa，温度为50°C，收集萃取液I; 设置分离釜Π 压力为4.5MPa，温度为35°C，收集萃取液Π ;合并萃取液I和萃取液Π 得到萃 取液的混合液，采用旋转蒸发仪浓缩至少量液体，55°C烘干成膏状即可得到青梅有效成分。6. -种根据权利要求1-5任一所述的青梅有效成分的提取方法制备得到青梅提取物。7. 权利要求6所述的青梅提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
【文档编号】A61K36/185GK105943569SQ201610396795
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】钱书元, 邹伟权, 缪来耿
【申请人】惠州同富康生物科技有限公司