中药成分分析方法
【专利摘要】本发明实施例提供的中药成分分析方法，可以通过配制中药样品的多个梯度浓度溶液，将相对较低浓度的待测溶液进行液相色谱-质谱联用检测，分析高丰度化合物；然后，将所检测出的高丰度化合物在相对较高浓度的待测溶液进行液相色谱-质谱联用检测时剔除。由于较高浓度的待测溶液的浓度相对较高，因此仍旧可以通过液相色谱-质谱联用仪检测出剩余成分中的高丰度化合物。由于可以配制多份梯度浓度溶液，因此对所有待测溶液依次进行上述剔除处理，可以将色谱峰峰高较高的化合物剔除，并最终可以检测到色谱峰峰高较低的化合物，从而对其进行分析，确定中药中含量较低的化合物成分，甚至微量、痕量成分。
【专利说明】中药成分分析方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及成分分析【技术领域】，特别是涉及中药成分分析方法。
【背景技术】
[0002]中药化学物质基础研究对制定中药质量标准、阐明中药有效成分和有效部位、揭示中药作用机制等方面具有重要意义。
[0003]近年来，液相色谱-质谱(LC-MS)联用技术得到飞速的发展，结合液相色谱对复杂样品快速、高效的分离能力与质谱的高灵敏度、高特异性、可以提供化合物分子量与结构碎片信息的优点，已广泛应用于中药研究领域中。
[0004]质谱的动态检测范围较窄，检测器容易饱和，难以同时实现中药中常量、微量、痕量成分的综合分析。但是中药化学成分中的微量、痕量成分常具有很强的药理活性和/或毒性作用，因此检测意义十分重要。
【发明内容】
[0005]本发明实施例的目的在于提供一种中药成分分析方法，以实现同时检测中药中常量、微量、痕量成分的目的。
[0006]为达到上述目的，本发明实施例公开了一种中药成分分析方法，包括以下步骤:
[0007](I)、配制待测中药样品的梯度浓度溶液，根据浓度由低到高的顺序将各浓度溶液称为第一待测溶液至第N待测溶液，N大于I且为整数；
[0008](2)、对所述第一待测溶液进行液相色谱-质谱联用检测，确定所述第一待测溶液中的高丰度化合物，所述高丰度化合物为经液相色谱-质谱联用检测的溶液中色谱峰峰高高于预设阈值的化合物；
[0009](3)、依次将正整数2到N作为i进行如下处理:
[0010]对第i待测溶液进行液相色谱-质谱联用检测，在对所述第i待测溶液进行液相色谱-质谱联用检测过程中，第i待测溶液经液相色谱分离后剔除所述第一待测溶液至第1-Ι待测溶液经液相色谱-质谱联用检测所确定的高丰度化合物，并对剩余的第i待测溶液中的成分进行液相色谱-质谱联用检测中的质谱检测，确定所述剩余的第i待测溶液中的高丰度化合物。
[0011 ] 优选的，所述各梯度浓度溶液的浓度呈等比数列。
[0012]优选的，所述中药样品为甘草或丹红注射液。
[0013]优选的，所述预设阈值为50%基峰峰高。
[0014]优选的，所述对所述第一待测溶液进行液相色谱-质谱联用检测的步骤，包括:将所述第一待测溶液注入液相色谱-质谱联用仪中进行液相色谱-质谱联用检测；
[0015]所述对第i待测溶液进行液相色谱-质谱联用检测的步骤，包括:
[0016]将所述第i待测溶液注入液相色谱-质谱联用仪进行液相色谱-质谱联用检测。
[0017]优选的，在对所述第i待测溶液进行液相色谱-质谱联用检测过程中，第i待测溶液经液相色谱分离后剔除所述第一待测溶液至第1-Ι待测溶液经液相色谱-质谱联用检测所确定的高丰度化合物，包括:
[0018]对所述第i待测溶液进行液相色谱-质谱联用检测过程中，使用质谱六通阀装置从液相色谱分离后的所述第i待测溶液中剔除所述第一待测溶液至第1-Ι待测溶液经液相色谱-质谱联用检测所确定的高丰度化合物。
[0019]优选的，所述配制待测中药样品的梯度浓度溶液的步骤，包括:
[0020]将待测中药样品粉末与溶剂混合，得到混合溶液，其中，所述待测中药样品为中药材或中药固体制剂；
[0021]对所述混合溶液进行超声或热回流处理，获得处理后溶液；
[0022]取所述处理后溶液的上清液；
[0023]对所述上清液进行离心处理，获得第N待测溶液；
[0024]用所述溶剂依次等比稀释所述第N待测溶液，得到待测中药样品的梯度浓度溶液。
[0025]优选的，所述配制待测中药样品的梯度浓度溶液的步骤，包括:
[0026]将待测中药样品作为第N待测溶液，所述中药样品为中药注射剂或中药液体制剂；
[0027]用所述溶剂依次等比稀释所述第N待测溶液，得到待测中药样品的梯度浓度溶液。
[0028]优选的，所述N大于I且小于100。
[0029]优选的，所述N为3或5。
[0030]优选的，配制待测中药样品的梯度浓度溶液所使用的溶剂为醇类化合物水溶液。[0031 ] 本发明实施例提供的中药成分分析方法，可以通过配制中药样品的多个梯度浓度溶液，将相对较低浓度的待测溶液进行液相色谱-质谱联用检测，分析高丰度化合物；然后，将所检测出的高丰度化合物在相对较高浓度的待测溶液进行液相色谱-质谱联用检测时剔除。由于较高浓度的待测溶液的浓度相对较高，因此仍旧可以通过液相色谱-质谱联用仪检测出剩余成分中的高丰度化合物。由于可以配制多份梯度浓度溶液，因此对所有待测溶液依次进行上述剔除处理，可以将色谱峰峰高较高的化合物剔除，并最终可以检测到色谱峰峰高较低的化合物，从而对其进行分析，确定中药中含量较低的化合物成分，甚至微量、痕量成分。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0033]图1是本发明提供的中药成分分析方法中化合物剔除原理示意图；
[0034]图2是本发明提供的实施例中对甘草样品进行化合物剔除的原理示意图；
[0035]图3是本发明实施例1得到的负离子模式下，甘草的第一待测溶液的基峰强度BPI色谱图；[0036]图4是本发明实施例1得到的负离子模式下，甘草的第二待测溶液的BPI色谱图；
[0037]图5是本发明实施例1得到的负离子模式下，甘草的第三待测溶液的BPI色谱图；
[0038]图6是本发明实施例1得到的正离子模式下，甘草的第一待测溶液的BPI色谱图；
[0039]图7是本发明实施例1得到的正离子模式下，甘草的第二待测溶液的BPI色谱图；
[0040]图8是本发明实施例1得到的正离子模式下，甘草的第三待测溶液的BPI色谱图；
[0041]图9是本发明实施例2得到的负离子模式下，丹红注射液1/81原液BPI色谱图；
[0042]图10是本发明实施例2得到的负离子模式下，丹红注射液1/27原液BPI色谱图；
[0043]图11是本发明实施例2得到的负离子模式下，丹红注射液1/9原液BPI色谱图；
[0044]图12是本发明实施例2得到的负离子模式下，丹红注射液1/3原液BPI色谱图；
[0045]图13是本发明实施例2得到的负离子模式下，丹红注射液原液BPI色谱图；
[0046]图14是本发明实施例2得到的正离子模式下，丹红注射液1/81原液BPI色谱图；
[0047]图15是本发明实施例2得到的正离子模式下，丹红注射液1/27原液BPI色谱图；
[0048]图16是本发明实施例2得到的正离子模式下，丹红注射液1/9原液BPI色谱图；
[0049]图17是本发明实施例2得到的正离子模式下，丹红注射液1/3原液BPI色谱图；
[0050]图18是本发明实施例2得到的正离子模式下，丹红注射液原液BPI色谱图。
【具体实施方式】
[0051]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0052]本发明提供了一种中药成分分析方法，包括以下步骤:
[0053](I)、配制待测中药样品的梯度浓度溶液，根据浓度由低到高的顺序将各浓度溶液称为第一待测溶液至第N待测溶液，N大于I且为整数；
[0054](2)、对所述第一待测溶液进行液相色谱-质谱联用检测，确定所述第一待测溶液中的高丰度化合物，所述高丰度化合物为样品溶液经液相色谱-质谱联用检测后色谱峰峰高高于预设阈值的化合物；
[0055](3)、依次将正整数2到N作为i进行如下处理:
[0056]对第i待测溶液进行液相色谱-质谱联用检测，在对所述第i待测溶液进行液相色谱-质谱联用检测过程中，第i待测溶液经液相色谱分离后剔除所述第一待测溶液至第1-Ι待测溶液经液相色谱-质谱联用检测所确定的高丰度化合物，并对剩余的第i待测溶液中的成分进行液相色谱-质谱联用检测中的质谱检测，确定所述剩余的第i待测溶液中的高丰度化合物。
[0057]本实施例提供的中药成分分析方法，可以通过配制中药样品的多个梯度浓度溶液，将相对较低浓度的待测溶液进行液相色谱-质谱联用检测，分析高丰度化合物；然后，将所检测出的高丰度化合物在相对较高浓度的待测溶液进行液相色谱-质谱联用检测时易繼。由于较高浓度的待测溶液的浓度相对较高，因此仍旧可以通过液相色谱-质谱联用仪检测出剩余成分中的高丰度化合物。由于可以配制多份梯度浓度溶液，因此对所有待测溶液依次进行上述剔除处理，可以将色谱峰峰高较高的化合物剔除，并最终可以检测到色谱峰峰高较低的化合物，从而对其进行分析，确定中药中含量较低的化合物成分，甚至微
量、痕量成分。
[0058]本发明对所配制的中药样品溶液的梯度浓度没有特殊的限制，本领域技术人员可以根据需要进行配制，优选的，本发明所配制的中药样品的梯度浓度溶液的浓度呈等比数列，更优选的，本发明所配制的中药样品的梯度浓度溶液的浓度呈等比数列且公比为3。
[0059]本发明对所配制的中药样品的梯度浓度溶液的份数没有特殊的限制，优选的，为2份到100份，更优选的，为3份或20份，最优选的，为3份或5份。
[0060]本发明对中药样品中含有的中药种类没有特殊的限制，本发明中的中药样品中可以仅含有一种中药，也可以同时含有多种中药。同时，本发明对中药样品的形态没有特殊限制，可以为中药粉末、中药颗粒、中药注射液、中药液体制剂、中药饮片、中药固体制剂等。在上述各种形态中，可以仅包含有中药成分，也可以同时包含有其他物质，例如中药注射液中可以同时含有注射用氯化钠溶液，中药饮片中可以同时含有淀粉等。
[0061 ] 本发明对中药样品中的中药没有特殊的限制，优选的，为植物性或动物性中药，更优选的，为植物性中药，最优选的，为甘草或丹红注射液。所述丹红注射液中包含有丹参、红花。本发明对中药样品的获得途径没有特殊的限定，可以自行种植或收集、采集后进行制备，也可以从市场进行购买，优选的，可以从中药药材产地和生产厂家处购买。
[0062]本发明对待测中药样品的梯度浓度溶液的配制方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的中药样品溶液配制方法即可。优选的，可以在中药样品中添加溶剂以配制中药样品溶液，更优选的，可以将中药粉末与溶剂(甲醇水溶液)相混合，得到混合溶液，对所述混合溶液进行超声或热回流处理，取处理后的混合溶液的上清液，对所述上清液进行离心处理，获得第N待测溶液，用溶剂(如甲醇水溶液)依次等比稀释所述第N待测溶液，得到待测中药样品的梯度浓度溶液。其中，超声或热回流处理过程及离心过程本发明没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的超声或热回流处理方法及离心方法即可。在中药样品为中药注射剂或中药液体制剂时，可以直接使用溶剂依次等比稀释即可。
[0063]也即:在所述待测中药样品为中药材或中药固体制剂时，步骤(I)中的所述配制待测中药样品的梯度浓度溶液的步骤，可以包括:
[0064]将待测中药样品粉末与溶剂混合，得到混合溶液；
[0065]对所述混合溶液进行超声或热回流处理，获得处理后溶液；
[0066]取所述处理后溶液的上清液；
[0067]对所述上清液进行离心处理，获得第N待测溶液；
[0068]用所述溶剂依次等比稀释所述第N待测溶液，得到待测中药样品的梯度浓度溶液。
[0069]在所述中药样品为中药注射剂或中药液体制剂时，步骤(I)中的所述配制待测中药样品的梯度浓度溶液的步骤，可以包括:
[0070]将待测中药样品作为弟N待测溶液；
[0071]用所述溶剂依次等比稀释所述第N待测溶液，得到待测中药样品的梯度浓度溶液。
[0072]本发明对配制中药样品的梯度浓度溶液所使用的溶剂没有特殊的限制，可以为醇类化合物水溶液。在本发明中，所述醇类化合物水溶液优选为C原子数为I?3的醇类化合物水溶液，更优选为甲醇水溶液或乙醇水溶液，最优选为甲醇水溶液，最最优选为50%甲醇水溶液或10%甲醇水溶液；所述含醇水溶液的纯度优选为色谱纯。
[0073]本发明对进行液相色谱-质谱联用检测的技术方案没有特殊限定，可以使用本领域技术人员常用的液相色谱-质谱联用检测方法。优选的，本发明可以将步骤(2)中的第一待测溶液注入液相色谱-质谱联用仪中进行液相色谱-质谱联用检测；将步骤(3)中的第i待测溶液注入液相色谱-质谱联用仪中进行液相色谱-质谱联用检测。本发明对所使用的液相色谱-质谱联用仪没有特殊限定，可以从市场中购得。当然，也可以通过液相色谱仪和质谱仪的联用来进行液相色谱-质谱联用检测，具体的，液相色谱仪可以进行色谱分离和检测，质谱仪可以对进行了液相色谱分离后的待测溶液中的成分进行质谱检测。对于液相色谱-质谱联用仪而言，其内部也具有液相色谱分离和检测功能的组成部分和具有质谱检测功能的组成部分，当然，也可以称具有液相色谱分离和检测功能的组成部分为液相色谱仪，称具有质谱检测功能的组成部分为质谱仪。对于第i待测溶液而言，在第i待测溶液在液相色谱仪中进行了液相色谱分离后，可以将所述第一待测溶液至第1-Ι待测溶液经液相色谱-质谱联用检测所确定的高丰度化合物剔除(具体的，可以使用质谱六通阀装置来进行剔除处理)，并将未剔除的化学成分导入质谱仪中进行质谱检测，以确定未剔除的物质中的高丰度化合物。
[0074]优选的，本发明中所使用的液相色谱-质谱联用仪包括一套液相分离系统、质谱仪，其中液相色谱分离系统包括一套液相泵系统、一种或多种流动相、一个自动进样器、一个柱温箱、一根色谱柱；其中，质谱仪为高分辨或低分辨质谱并配有质谱六通阀装置。
[0075]液相色谱质谱联用仪(LC-MS,Liquid Chromatograph-Mass Spectrometer),是有机物分析市场中的高端仪器。液相色谱(LC)能够有效分离待测样品中的化合物，而质谱(MS)能够对分离的化合物逐个的分析，得到化合物分子量、结构(在某些情况下)和浓度(定量分析)的信息。LC-MS是有机物分析实验室，药物、食品检验室，生产过程控制、质检等部门必不可少的分析工具。但是现有的液相色谱质谱联用检测技术的动态检测范围较窄，检测器容易饱和，在检测含量较高的化合物时，无法同时对含量较低的化合物进行检测，如对微量、痕量成分的检测。其中，本发明中的微量成分是指质量分数在0.01%?1%范围内的成分。本发明中的痕量成分是指质量分数小于0.01%的成分。
[0076]而本发明首先对浓度相对较低的待测溶液进行液相色谱-质谱联用检测，检测出较低浓度待测溶液中的高丰度化合物；由于本发明配制了 N个中药样品的梯度浓度溶液，因此这N个中药样品的多个梯度浓度溶液中含有的各化合物及其比例相同。本发明通过在较高浓度的待测溶液进行液相色谱-质谱联用检测时，剔除较低浓度待测溶液中检测出的高丰度化合物使得原本在较高浓度的待测溶液中的次高丰度化合物变为高丰度化合物。又由于剔除高丰度化合物的待测溶液的浓度相对较高，因此仍能够检测出样品中的高丰度化合物，即剔除处理前的次高丰度化合物。按照这种方法对所有的N个待测溶液进行处理，可最终分析得到待测溶液中含量较低的化合物，如微量及痕量成分。本发明中的微量成分是指质量分数在0.01%?1%范围内的成分。本发明中的痕量成分是指质量分数小于0.01%的成分。
[0077]本发明对高丰度化合物的剔除处理没有特殊的限定，使用本领域技术人员所熟知的剔除处理方案即可。优选的，在进行液相色谱-质谱联用检测中，使用质谱六通阀装置从液相色谱分离后的所述第i待测溶液中剔除所述第一待测溶液至第1-Ι待测溶液经液相色谱-质谱联用检测所确定的高丰度化合物。
[0078]为方便理解，下面举例说明:
[0079]如图1所示，N=3，也即配制3份中药样品的梯度浓度溶液，根据这3份待测溶液浓度高低分别命名为:高浓度样品、中浓度样品和低浓度样品。
[0080]首先对低浓度样品进行液相色谱-质谱联用检测，确定低浓度样品中的高响应成分，即高丰度化合物，为峰3、5、7所示的化合物。然后通过控制质谱六通阀装置，在中浓度样品中将峰3、5、7所示的化合物的出峰时间段设为切换废液时间，使得峰3、5、7所示的化合物被剔除进入废液，其余时间不做改变，使化合物导入质谱仪中检测，确定中浓度溶液中的高丰度化合物，为峰4、6所示的化合物，可以理解的是，峰4、6所示的化合物即为所配制的中药样品的梯度浓度溶液中的次高响应成分。最后分析高浓度样品，通过控制质谱六通阀装置，剔除低浓度样品和中浓度样品中所确定的高丰度化合物，也即剔除峰3、4、5、6、7所示的化合物，并将高浓度样品中剩余成分导入质谱仪中检测，确定高浓度样品中的高丰度化合物，也即峰1、2、8所示化合物，可以理解的是，峰1、2、8所示化合物即为所配制的中药样品的梯度浓度溶液中的低含量成分。可以看出，通过上述方法，即可确定样品中的低含量成分。需要说明的一点是，本举例中的高含量成分、中含量成分、低含量成分仅为相对而言的称谓，并不代表具体的含量数值。在实际应用中，可以不进行含量高低的区分，而使用一预设阈值来进行是否为所需剔除化合物的比较。将含量高于预设阈值的所检测出的化合物剔除即可。优选的，该预设阈值根据液相色谱-质谱联用检测的色谱图中的基峰峰高设定，更优选的，该预设阈值为50%基峰峰高，其中，基峰为总离子流图中峰高最高的峰。
[0081]图1所示的色谱图中的色谱峰仅为示意性，为了方便理解，图1所示的色谱图十分简单。在实际应用中，色谱图较为复杂，如图2所示，为对甘草进行成分分析的示意图。由于甘草中所含化合物较多，因此图2中甘草的色谱图中的峰较多。
[0082]本发明使用较低浓度样品检测高丰度化合物，较高浓度样品在剔除高丰度化合物后检测溶液中其他化合物的梯度浓度定向剔除技术，不仅可以更简便的全面分析高、中、低、微、痕量成分，而且可以避免污染检测器和/或消除“离子抑制效应”、“残留记忆效应”等，检测结果更加可靠。
[0083]为了进一步了解本发明，下面结合实施例对本发明提供的甘草和丹红注射液成分的检测方法进行详细描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0084]以下各实施例中，进行液相色谱-质谱联用检测的仪器为液相色谱-质谱联用仪，该液相色谱-质谱联用仪包括进行液相色谱检测采用的仪器，具体为=Waters ACQUITYUPLC超高效液相色谱仪(美国，Waters公司)，包括一套泵系统、一个自动进样器，一个柱温箱、一根色谱柱；
[0085]该液相色谱-质谱联用仪包括进行液相色谱-质谱联用检测中质谱检测采用的仪器，具体为=Synapt G2HDMS质谱仪(美国，Waters公司)；
[0086]离心处理所采用的仪器为:Hettich MIKR0220R离心机(德国，Hettich公司)；
[0087]超声处理采用的仪器为；SCIENTZ25_12超声仪(中国，宁波新芝生物科技股份有限公司)。
[0088]称定重量采用的仪器为:METTLERTOLEDO AL204 (瑞士，METTLER TOLEDO 公司)；[0089]所用的甘草粉末购自河北安国药材市场，购于2012年。
[0090]所用的丹红注射液由菏泽步长制药有限公司提供，产品批号为12031007。
[0091]实验用水来自Mi I I1-Q纯水系统(美国，Mi I Iipore公司)，甲酸购自MREDA (美国，MREDA公司)，乙腈、甲醇购自Sigma Aldrich(美国，Sigma公司)，以上试剂均为色谱纯。
[0092]实施例1
[0093]精密称取0.5g甘草粉末，置于IOOmL具塞三角瓶中，加入10mL50%甲醇水溶液，超声30分钟，吸取上清液，HOOOrpm离心10分钟，取出上清液，将上清液中的部分溶液用50%甲醇水溶液依次稀释成与上清液具有梯度浓度的待测溶液，得到甘草的三个梯度浓度溶液。根据浓度由低到高的顺序，将这三个梯度浓度溶液称为第一待测溶液、第二待测溶液和第三待测溶液。
[0094]将以上制备的三个梯度浓度溶液进行液相色谱-质谱联用检测，检测的条件具体为:
[0095]色谱柱:ACQUITYUPLC BEH Shield RP18 (2.1 X 100mm, 1.7 μ m)；
[0096]流动相A:0.1%甲酸水溶液；流动相B:乙腈；梯度洗脱。
[0097]流速0.4mL/分钟；柱温40°C ;进样2 μ L。
[0098]质谱仪采用Synapt G2HDMS Q-T0F，采用负离子和正离子模式，分别采集一级和二级质谱数据，其中一级质谱质量扫描范围为50?1500Da。
[0099]首先对第一待测溶液进行液相色谱-质谱联用检测，得到如图3所示的负离子模式BPI色谱图和如图6所示的正离子模式BPI色谱图。预设阈值为50%基峰峰高，从图3中可以看出，第一待测溶液中第40秒处的峰、第10分钟处的峰、第22分钟处的峰所示的化合物的负离子峰高高于预设阈值，因此通过质谱六通阀装置，在第二待测溶液中将这三处峰所示化合物的出峰时间段设为切换废液时间加以剔除。从图6中可以看出，第10分钟处的峰、第22分钟处的峰所示的化合物的正离子响应高于预设阈值，因此使用质谱六通阀装置将第二待测溶液中的这三处峰所示化合物剔除。
[0100]然后在进行液相色谱-质谱联用检测时，将第二待测溶液中高丰度成分剔除后的其他成分(即未被剔除成分)导入质谱仪中，得到如图4所示的负离子模式BPI色谱图和如图7所示的正离子模式BPI色谱图。同样可以确定剔除处理后的第二待测溶液中响应高于预设阈值的高丰度化合物。再将第三待测溶液中的图4及图7所示的高于预设阈值的化合物剔除，并同时将图3及图6所示的高于预设阈值的化合物剔除；
[0101]最后在进行液相色谱-质谱联用检测时，将第三待测溶液中高丰度成分剔除后的其他成分导入质谱仪中，得到如图5所示的负离子模式BPI色谱图和如图8所示的正离子模式BPI色谱图。此时检测得到的化合物成分即为含量较低的化合物。
[0102]通过本发明的梯度浓度定向剔除技术分析甘草样品，共检测出232个化合物。从图3至图5、图6至图8中可以发现，化合物主要是在图5和图8中被检测到，其次是图4和图7，而图3和图5的化合物检测数量最少，即本发明所建立的中药成分分析方法与常规的分析方法相比，不仅能够检测出更多的化合物，特别是微量、痕量成分，而且能够实现复杂体系中常量、微量、痕量成分的综合分析。此外，从图3至图8所示色谱图可以看出甘草负离子模式的信号比正离子模式好，这主要是由于甘草中含有的化合物在负离子模式下响应较好。[0103]实施例2
[0104]取丹红注射液原液，用10%甲醇水溶液依次稀释成1/3、1/9、1/27、1/81原液。根据以上五种待测溶液浓度由低到高的顺序，将1/81原液称为第一待测溶液，将1/27原液称为第二待测溶液，将1/9原液称为第三待测溶液，将1/3原液称为第四待测溶液，将丹红注射液原液称为第五待测溶液。
[0105]将以上制备的五个梯度浓度溶液进行液相色谱-质谱联用检测，检测的条件具体为:
[0106]色谱柱:ACQUITYUPLC HSS T3 (2.1 X 100mm, 1.8 μ m)；
[0107]流动相A:0.1%甲酸水溶液；流动相B:乙腈；梯度洗脱。
[0108]流速0.4mL/分钟；柱温40°C ;进样2 μ L
[0109]质谱仪采用Synapt G2HDMS Q-T0F，采用负离子和正离子模式，分别采集一级和二级质谱数据，其中一级质谱质量扫描范围为50?1500Da。
[0110]首先对第一待测溶液进行液相色谱-质谱联用检测，得到如图9所示的负离子模式BPI色谱图和如图14所示的正离子模式BPI色谱图。预设阈值为50%基峰峰高，从图9中可以看出，第一待测溶液的第2.5分钟处的峰所示的化合物的负离子响应高于预设阈值，因此可以使用质谱六通阀装置将第二待测溶液中的该处峰所示化合物剔除。从图14中可以看出，第一待测溶液的第38秒处的峰所示的化合物的正离子响应高于预设阈值，因此可以使用质谱六通阀装置将第二待测溶液中的该处峰所示化合物剔除。
[0111]然后在进行液相色谱-质谱联用检测时，将第二待测溶液中高丰度成分剔除后的其他成分导入质谱仪中，得到如图10所示的负离子模式BPI色谱图和如图15所示的正离子模式BPI色谱图。然后再将第三待测溶液中的图10及图15所示的高于预设阈值的化合物剔除，并同时将第三待测溶液中的图9及图14所示的高于预设阈值的化合物剔除。
[0112]然后在进行液相色谱-质谱联用检测时，将第三待测溶液中高丰度成分剔除后的其他成分导入质谱仪中，得到如图11所示的负离子模式BPI色谱图和如图16所示的正离子模式BPI色谱图。然后再将第四待测溶液中的图11及图16所示的高于预设阈值的化合物剔除，并同时将第四待测溶液中的图10及图15所示的高于预设阈值的化合物剔除，同时将第四待测溶液中的图9及图14所示的高于预设阈值的化合物剔除。
[0113]依照上述方法依次对第四待测溶液和第五待测溶液进行液相色谱-质谱联用检测及剔除处理，依次得到如图12所示的剔除处理后的第四待测溶液的负离子模式BPI色谱图、如图17所示的剔除处理后的第四待测溶液的正离子模式BPI色谱图、如图13所示的剔除处理后的第五待测溶液的负离子模式BPI色谱图、如图18所示的剔除处理后的第五待测溶液的正离子模式BPI色谱图。
[0114]通过本发明的梯度浓度定向剔除技术分析丹红注射液，共检测出135个色谱峰，且色谱峰主要集中在图12和13、图17和18。其中，图9、10、11、12、13为丹红注射液1/81母液、1/27母液、1/9母液、1/3母液、母液的负离子模式BPI色谱图；图14、15、16、17、18为丹红注射液1/81母液、1/27母液、1/9母液、1/3母液、母液的正离子模式BPI色谱图。从色谱图可以看出丹红注射液负离子模式的信号比正离子模式响应好，这主要是由于丹红注射液中含有的化合物在负离子模式下响应较好。
[0115]对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
【权利要求】
1.一种中药成分分析方法，包括以下步骤: (I )、配制待测中药样品的梯度浓度溶液，根据浓度由低到高的顺序将各浓度溶液称为第一待测溶液至第N待测溶液，N大于I且为整数； (2)、对所述第一待测溶液进行液相色谱-质谱联用检测，确定所述第一待测溶液中的高丰度化合物，所述高丰度化合物为经液相色谱-质谱联用检测的溶液中色谱峰峰高高于预设阈值的化合物； (3)、依次将正整数2到N作为i进行如下处理: 对第i待测溶液进行液相色谱-质谱联用检测，在对所述第i待测溶液进行液相色谱-质谱联用检测过程中，第i待测溶液经液相色谱分离后剔除所述第一待测溶液至第i_l待测溶液经液相色谱-质谱联用检测所确定的高丰度化合物，并对剩余的第i待测溶液中的成分进行液相色谱-质谱联用检测中的质谱检测，确定所述剩余的第i待测溶液中的高丰度化合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述各梯度浓度溶液的浓度呈等比数列。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述中药样品为甘草或丹红注射液。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述预设阈值为50%基峰峰高。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对所述第一待测溶液进行液相色谱-质谱联用检测的步骤 ，包括:将所述第一待测溶液注入液相色谱-质谱联用仪中进行液相色谱-质谱联用检测； 所述对第i待测溶液进行液相色谱-质谱联用检测的步骤，包括: 将所述第i待测溶液注入液相色谱-质谱联用仪进行液相色谱-质谱联用检测。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，在对所述第i待测溶液进行液相色谱-质谱联用检测过程中，第i待测溶液经液相色谱分离后剔除所述第一待测溶液至第1-1待测溶液经液相色谱-质谱联用检测所确定的高丰度化合物，包括: 对所述第i待测溶液进行液相色谱-质谱联用检测过程中，使用质谱六通阀装置从液相色谱分离后的所述第i待测溶液中剔除所述第一待测溶液至第1-Ι待测溶液经液相色谱-质谱联用检测所确定的高丰度化合物。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述配制待测中药样品的梯度浓度溶液的步骤，包括: 将待测中药样品粉末与溶剂混合，得到混合溶液，其中，所述待测中药样品为中药材或中药固体制剂； 对所述混合溶液进行超声或热回流处理，获得处理后溶液； 取所述处理后溶液的上清液； 对所述上清液进行离心处理，获得第N待测溶液； 用所述溶剂依次等比稀释所述第N待测溶液，得到待测中药样品的梯度浓度溶液。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述配制待测中药样品的梯度浓度溶液的步骤，包括: 将待测中药样品作为第N待测溶液，所述中药样品为中药注射剂或中药液体制剂； 用所述溶剂依次等比稀释所述第N待测溶液，得到待测中药样品的梯度浓度溶液。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述N大于I且小于100。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述N为3或5。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，配制待测中药样品的梯度浓度溶液所使用的溶剂为醇类化合物水溶液。
【文档编号】G01N30/02GK103616455SQ201310667224
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年12月9日 优先权日:2013年12月9日
【发明者】王跃飞, 江振作, 朱彦, 刘二伟, 姜苗苗, 柴欣, 张蕾 申请人:天津中医药大学