一种中药活性成分筛选方法
【专利摘要】本发明适用于中药领域，提供了一种中药活性成分筛选方法，包括制备色谱柱、制备丹红样液及过色谱柱等步骤。本发明中药活性成分筛选方法成功筛选出丹红注中对于心脑血管疾病的活性成分，提高了筛选效率，同时大大提高了丹红针剂的安全性。
【专利说明】一种中药活性成分筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明属于新材料领域，尤其涉及一种中药活性成分筛选方法。
【背景技术】
[0002]中药注射剂是临床常用心血管类疾病治疗药物。中药注射剂是指在中医理论指导下，采用先进的制备工艺，将中药或天然药物的单方或复方制成可供注入体内的制剂，包括肌肉、穴位、皮内、皮下、静脉注射以及其他组织器官注射用的灭菌制剂以及供临床前配制溶液的无菌粉末或浓缩液。与传统剂型相比，中药注射剂具有药效迅速、无消化吸收过程等特点，适用于危重急症的治疗，尤以治疗心血管疾病为宜。近20年心血管类中药注射剂的研究取得了较大进展，并已广泛应用于临床。
[0003]心血管类中药注射剂治疗主要涉及脑卒中、心肌梗死及合并休克、心律失常、冠心病、心绞痛等适应症。已批准生产的品种达30余种。按药物组成分类，可分为单方和复方两类。其中单方注射剂指由一味中药或中药提取物制备的注射剂，主要以活血化瘀药物为主，如丹参、川芎等，也有补益类中药，如人参、黄芪、刺五加等；复方注射剂是指以两味及以上中药制备，例如丹参系列(丹香冠心注射液、香丹注射液、丹红注射液等)、人参/红参系列(参麦注射液、参附注射液等)。
[0004]从市场角度上讲，虽然目前心血管治疗仍以西药为主，但现实中中药的市场份额正逐步扩大，在目前心血管类中药制剂中，中药注射剂占有比例最大。
[0005]但是，目前中药注射液存在诸多问题。
[0006]中药注射剂安全性问题显著。
[0007]中药注射剂形式具有疗效准确、起效快、疗程短等优点。因而很适宜应用到重症、急症以及一些疑难杂症当中，并且其作用和疗效是其他种类中药制剂所不可比拟和相提并论的。然而，中药注射制剂在医学临床上越来越多的得到应用，但愈来愈多的中药注射剂所引发的不良反应以及医疗事故等现象频发，从而使得患者和医护人员对于中药注射剂的应用都存在着很大程度的隐忧。原因主要有:
[0008]注射剂由于直接进入人体，相对于口服制剂，对安全性有着更高的要求，明确的化学成分组成是最基本的技术要求，但中药注射剂成分复杂，有效成分不明确，因而造成疗效安全性不确定。例如部颁标准收载的70种注射剂中，有9种规定测定总黄酮成分，以芦丁计算含量，这些品种的总黄酮成分中不一定都含有芦丁，结构不同，分子量不同，最大吸收波长也不尽相同，应采用该品种本身含有的黄酮成分作对照品并计算含量。复方蒲公英注射液中蒲公英、鱼腥草、野菊花三味药均含黄酮类成分，但其结构与分子量各异，均以芦丁作对照并计算含量，科学性较差。
[0009]中药注射剂在临床缺乏信任的另一个重大原因是大多品种，尤其是早期研发品种没有经过严格的临床前评价和临床试验，作用机制不明，更多的是依赖于传统中医药理论的解释，而实际临床应用却大多在西医范畴，既没有中医的辩证论治，又没有机理说明，不能满足指导医生临床用药的需要。2002年版《国家基本药物目录》中中药注射剂及其同品种不同剂型药品共72个进行调查分析，结果发现72个药品中有5个药品未检索到文献，17个药品无临床治疗性文献。
[0010]含有大量不溶性微粒，致敏原不明确是造成中药注射剂不良反应的第三大因素。临床运用中常与输液配伍，出现配伍后不同粒径的微粒有倍增现象，输液中的不溶性微粒侵人机体能引起肉芽肿和肺气肿，造成供氧不足，引起静脉炎、局部组织血栓和坏死，造成过敏反应、热原样反应及肿瘤样反应，具有很大的危害性。一些中药注射剂的有效成分被认为有致敏作用，如双黄连注射液中所含的绿原酸和异绿原酸就具有致敏原作用，可引起变态反应，清开灵注射液含有水牛角提取物，内含蛋白质，也可能刺激机体产生相应的抗体，引起过敏反应(如发热、皮疹、紫癜)，又如复方丹参注射液致过敏机制，有报道说可能是由于丹参酮与酸性结晶体结合而非半抗原与血浆蛋白质结合，从而引起机体发生过敏反应，另一种说法则认为可能是鞣质所致。
[0011]由于活性成分不明确，是中药针剂的安全性较低，这也是中药针剂所面临的一个问题。
【发明内容】
[0012]有鉴于此，本发明提供一种中药活性成分筛选方法，解决现有技术中药制剂活性成分不明确的问题。
[0013]本发明是这样实现的， [0014]一种一种中药活性成分筛选方法，包括如下步骤:
[0015]提供a r肾上腺素受体亚型生物色谱柱；
[0016]提供含丹红样液；
[0017]将所述丹红样液经过所述a r肾上腺素受体亚型生物色谱柱处理，将a ^肾上腺素受体亚型生物色谱柱处理后的丹红样液经过反相色谱柱处理，收集保留成分，得到丹红活性成分；
[0018]所述含丹红样液是指丹参提取液和红花提取液的混合物。
[0019]本发明中药活性成分筛选方法，根据“锁与钥匙”理论，针对a A-AR开展丹红注射液中心血管类活性成分快速筛选，具备以下优势:
[0020]第一:作为二次开发，丹红注射液为中医临床常用治疗心脑血管疾病治疗药物，大量文献考证及临床证明其有效性，活性成分筛选难度小；
[0021]第二:已有文献研究表明丹参可通过阻断a 1-AR，减轻去甲肾上腺素对心肌细胞的损害，从而达到抗去甲肾上腺素损伤的作用；
[0022]第三:根据“锁与钥匙”理论，由于受体色谱能够较真实的反映体内药物和受体的作用规律，所以用这个体系筛选出的活性成分一般不会因为体内的影响因素而被淘汰，这就大大提高了筛选的成功率。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1是本发明实施例中药活性成分筛选方法过程中六通阀原理图；
【具体实施方式】[0024]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清除明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0025]本发明实施例提供一种中药活性成分筛选方法，包括如下步骤:
[0026]步骤SOl制备色谱柱:
[0027]提供a r肾上腺素受体亚型生物色谱柱；
[0028]步骤S02制备丹红样液:
[0029]提供含丹红样液；
[0030]步骤S03过色谱柱:
[0031]将所述丹红样液经过所述a r肾上腺素受体亚型生物色谱柱处理，将a r肾上腺素受体亚型生物色谱柱处理后的丹红样液经过反相色谱柱处理，收集保留成分(在254、280nm波长下，收集此时间之后的所有保留峰，以单个峰为收集单位，分开保存)，得到丹红活性成分；
[0032]所述含丹红样液是指丹参提取液和红花提取液的混合物。
[0033]具体地，步骤SOl中，该a r肾上腺素受体亚型生物色谱柱及其制备方法，请参见申请号为201210423978.X的中国发明专利申请公开文本。本发明包含申请号为201210423978.X的中国发明专利申请的全部内容。
[0034]本发明在申请号为201210423978.X的中国发明专利申请的基础上进行改进研究，该申请号为201210423978.X的中国发明专利申请提出了一种药物筛选模型，但是对于具体的药物的筛选，没有做进一步的阐述。
[0035]本发明在此基础上，将该药物筛选模型创造性的用于丹红类药物活性成分的筛选之中，准确的确定了丹红类药物的活性成分，取得了积极的、意想不到的技术效果。
[0036]例如，:
[0037]该a 肾上腺素受体亚型生物色谱柱制备过程如下:
[0038]K Q1A-肾上腺素受体的获得
[0039]分别贴壁培养膜上高表达a ,-AR的HEK293细胞系，收集细胞保存在磷酸盐缓冲液中。4 °C高速离心30.0min,转速20000.0g.min-1,加入裂解液冰水浴超声波提取 20min，(裂解液:10.0X 10-3mol.L-1Tris.HCl, pH7.4 ；50.0X10-3mol.L-1NaCl ；5X10-3mol.L-1EDTA ；1% Trit1nX-100 (V/V) ；0.05% SDS (ff/V) ；50.0X 10-3mol.L-1NaF ；100.0X 10_6mol.L-1Na3VO4 ；10.0X 10_3mol.L-1Na4P2O7 ；20.0yg.ml-1抑肽酶；20.0yg.ml-1亮抑酶肽；100.0yg.ml-1苯甲基磺酰氟)对细胞进行处理，获得受体粗膜溶液。
[0040]制备2-哌嗪基-4-氨基-6，7- 二甲氧基喹唑啉-S印harose6B亲和层析柱，采用亲和层析法纯化受体粗膜溶液。洗脱液A(100mM NaCl, 10.0mM Tris-HCl, 2.0mM EDTA，0.1%的脱氧胆酸钠，PH = 7.2)平衡层析柱30min后，将受体粗膜溶液上样，用200mLA液洗脱，流速 1.0mL.min-1 ο 待基线平稳后，换 200mLB 液(500mM NaCl, 50.0mM EDTA, 1.0% 的脱氧胆酸钠，PH = 7.2)洗脱。B液中加入盐酸特拉唑嗪梯度洗脱，盐酸特拉唑嗪梯度范围为0-80.0 μ M。收集120-150min的洗脱液。用S印hadex G50尺寸排阻柱除去收集液中游离的盐，_70°C冷藏备用。[0041]2、a 肾上腺素受体亚型生物色谱柱制备
[0042]3、固定相的合成
[0043]准确称取2g硅胶，加入60.0mL HC1，加热回流4h (微沸)，停止反应后，冷却至室温，抽滤(0.45μπι水系膜)，用水洗至pH为中性，110°C烘箱干燥过夜。将活化好硅胶放入250ml三颈瓶,加入Na干燥的甲苯10mL,通氮气加热回流,至甲苯沸腾,加入3mL Y -氨丙基三乙氧基硅烷，反应过夜，停止反应，抽滤，待有机试剂挥干，放入干燥器备用。
[0044]取2g干燥氨丙基硅胶，溶于50.0mLl.0g羰基二咪唑的乙腈溶液，置于圆底烧瓶中，室温下搅拌，反应2.0h ;停止反应后，抽滤，水洗除去乙腈；硅胶中加入磷酸盐缓冲液(pH7.2)及纯化后的受体溶液5.0mL，4°C搅拌反应2.0h ;抽滤，磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗去未键和蛋白质；加入1.0%甘氨酸乙酯溶液50.0mL，4°C搅拌反应30.0min ;抽滤，PBS洗去残留的甘氨酸乙酯，4°C保存备用。
[0045]4、装柱
[0046]采用湿法装柱，以5.0mM Tris-HCl溶液(pH7.2)为匀浆液和顶替剂，在400bar的压力下装填色谱柱(150X4.6mm, 7.0 μ M)。
[0047]具体地，步骤S02中，所述含丹红样液是指丹参提取液和红花提取液的混合物。丹红样液的制备方法如下:
[0048]其一，市售中药注射剂适量，超纯水稀释10-50倍，0.45 μ m水系滤膜过滤，备用。
[0049]或者；
[0050]其二，选取市售中药注射剂中对应原药材适量，超纯水8-15倍回流提取3次，每次30min,趁热过滤,收集续滤液，合并，冷却至室温后，0.45 μ m水系滤膜过滤,备用。
[0051]具体地，步骤S03中，该反相色谱柱处理和a r肾上腺素受体亚型生物色谱柱处理在六通阀的作用下进行，具体如下:
[0052]请参阅图1所示，将a ,-AR色谱柱及反相色谱柱通过六通阀并联。a A-AR色谱柱Α，柱温20°C，流动相A为5.0mM Tris-HCl溶液(pH7.2)，流动相B为65 %乙腈-5.0mMTris-HCl 溶液(ρΗ7.2)检测波长 254、280nm。
[0053]样品经进样器被流动相A输送至六通阀d 口，经c 口流经a ^-AR色谱柱，然后经f 口和e 口流入废液接受瓶中，测过程中活性成分在Ci1A-AR色谱柱中富集，不保留成分则随废液排除；富集完成后转换六通阀档位，用泵B以0.8ml/min的流速输送流动相B，从六通阀a 口进入，f 口留出流经Ci1A-AR色谱柱，将富集在该色谱柱上的活性成分洗脱下来，再经c 口进入，b 口留出，流经反相色谱柱分离后，检测器在指定波长处记录色谱峰(254、280nm波长下，收集此时间之后的所有保留峰，以单个峰为收集单位，分开保存)，并收集流分备用。
[0054]活性成分检测:
[0055]采用HPLC-MSn方法对2.4项下样品进行分析。色谱条件为:色谱柱C18, 4.6 X 250mm ;柱温30°C ;流动相:甲醇水体系；检测波长254、280nm ;进样量50 μ L。质谱条件为=ESI源，正负 离子模式，扫描范围50-2000m/z ;雾化气压力:40.0psi，载气流量8L/min ;干燥气温度:325°C，毛细管电压:_4200V。分别对样品总离子流、多级裂解情况进行分析。
[0056]本发明实施例中药活性成分筛选方法，以丹红注射液等为具体研究对象，已经从中药注射液中初筛出2种活性成分，并经过定性分析确定其可能的分子结构。经过与注射液相同的前处理和分析方法，平行制备的原药材丹参及红花样品中也筛选出了上述成分，证明其确来源于药材，方法真实可靠。
[0057]以下通过具体实施例对上述中药活性成分筛选方法进行详细阐述。
[0058]实施例
[0059]以丹红注射液为例，筛选心血管类活性成分。
[0060]本发明实施例中药活性成分筛选方法，包括如下步骤:
[0061]首先:提供a r肾上腺素受体亚型生物色谱柱
[0062]步骤二:样品前处理
[0063]市售丹红注射剂适量，超纯水稀释50-100倍，0.45 μ m水系滤膜过滤，备用。中药丹参、红花饮片适量，超纯水8-15倍回流提取3次，每次30min，趁热过滤，收集续滤液，合并，冷却至室温后，0.45 μ m水系滤膜过滤,备用。
[0064]步骤三:丹红注射液心血管类活性成分二维色谱初筛
[0065]将步骤二项下制备各样品依次通过a A-AR色谱柱-反相色谱中药注射剂心血管类活性成分二维色谱初筛系统(进样样量为50 μ L)，根据色谱图，在废液端收集保留成分，备用。
[0066]步骤三、中药注射剂心血管类活性成分分析
[0067]采用HPLC-MSn方法对4.2项下样品进行分析。色谱条件为:色谱柱C18, 4.6 X 250mm ;柱温30°C ;流动相:甲醇水体系；检测波长254、280nm ;进样量50 μ L。质谱条件为=ESI源，正负离子模式，扫描范围50-2000m/z ;雾化气压力:40.0psi，载气流量8L/min ;干燥气温度:325°C，毛细管电压:_4200V。分别对样品总离子流、多级裂解情况进行分析。在丹红注射液中发现两种活性物质丹参素和羟基红花黄色素。
[0068]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种中药活性成分筛选方法，包括如下步骤: 提供a r肾上腺素受体亚型生物色谱柱； 提供含丹红样液； 将所述丹红样液经过所述a r肾上腺素受体亚型生物色谱柱处理，收集保留成分； 将a r肾上腺素受体亚型生物色谱柱处理后的丹红样液经过反相色谱柱处理，收集保留成分，得到丹红活性成分； 所述含丹红样液是指丹参提取液和红花提取液的混合物。
2.如权利要求1所述的中药活性成分筛选方法，其特征在于，所述丹红样液为经过膜过滤处理后的丹红注射液。
3.如权利要求1所述的中药活性成分筛选方法，其特征在于，所述丹红样液的制备方法包括如下步骤: 提供丹参、红花； 将丹参、红花回流提取； 将提取液进行水系膜过滤，得到丹红样液。
4.如权利要求1所述的中药活性成分筛选方法，其特征在于，所述反相色谱柱处理过程中，流动相为5.0mM的Tris-HCl溶液。
5.如权利要求1所述的中药活性成分筛选方法，其特征在于，所述Ci1-肾上腺素受体亚型生物色谱柱处理过程中，流动相为65%乙腈溶液与5.0mM的Tris-HCl溶液的混合液。
【文档编号】G01N30/89GK104034819SQ201410284388
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月23日 优先权日:2014年6月23日
【发明者】王雪艳, 郑晓晖, 裴渭静, 唐旭东 申请人:深圳清华大学研究院