山梗菜的活性成分分析方法
【专利摘要】山梗菜的活性成分分析方法，属于植物成分分析技术领域，包括七个步骤，步骤一、山梗菜总提物的制备，步骤二、山梗菜不同极性部位样品溶液的配制，步骤三、山梗菜总生物碱样品溶液的配制，步骤四、细胞株的培养，步骤五、MTT溶液的配制，步骤六、阳性对照药环磷酰胺的配制，步骤七、山梗菜中抗肿瘤活性的测定。本发明对山梗菜进行系统的分析，从中找出抗肿瘤成分，以便于更好的服务人类健康，对人类的健康做出了更大的贡献。
【专利说明】
山梗菜的活性成分分析方法
技术领域
[0001] 本发明属于植物成分分析技术领域，特别是涉及到一种对山梗菜的成分进行分析 的方法。
【背景技术】
[0002] 我国是世界上中药资源最为丰富的国家，我国的传统医药不仅为中华民族的医药 事业做出了贡献，同时也为世界医药事业做出了巨大的贡献。现代医学研究越来越重视对 中药资源的研究与利用，天然药物已成为研究热点。山梗菜作为我国传统中药之一，它的研 究与开发有着良好的前景与价值。山梗菜(Lobelia sessilifolia Lamb.)，为多年生草本 植物。隶属桔梗科半边莲属(Lobelia L.)。直立圆柱根状茎，须根多。披针形叶呈密集螺旋 状排列，叶缘锯齿状，蓝紫色唇形花冠。蒴果倒卵形，种子红棕色呈半圆形。经现代医学研究 发现山梗菜(Lobelia sessilifolia Lamb.)中的半边莲类生物碱为中枢兴奋剂，有中枢兴 奋作用，是重要的中枢N-胆碱受体激动剂，临床上常用于治疗呼吸衰竭等。除此之外山梗菜 碱对帕金森病还具有潜在的治疗价值。并且山梗菜碱还具有保护血管内皮细胞的作用。另 有报道表明半边莲生物总碱是保护动脉内皮细胞和抑制动脉SMC增殖的有效成分。最为重 要的是山梗菜(Lobelia sessilifolia Lamb.)具有明显的抗肿瘤活性，这使其研究价值进 一步提高，故山梗菜(Lobelia sessilifolia Lamb.)的研究与开发将对医药事业意义深 远。经研究发现山梗菜(Lobelia sessilifolia Lamb.)中的生物碱、留醇、三砲类等化学成 分都具有抗肿瘤活性。山梗菜生物碱类化学成分的抗肿瘤活性研究：山梗菜生物碱是一类 含氮碱性有机化合物。研究表明，生物碱类化合物抗癌活性良好。生物碱类成分是山梗菜 (Lobelia sessilifolia Lamb.)最为主要的抗肿瘤活性成分。
[0003] 山梗菜留醇类化学成分的抗肿瘤活性研究：留醇类化合物是广泛存在于自然界 中，是的一类具有抗癌活性的化合物。研究表明，人们日常生活中留醇的摄入可抑制结肠 癌、乳腺癌、肺癌等癌症，现代流行病学研究支持了这一结论。其中豆留醇作为一种日常摄 入甾醇类化合物也有着良好的抗肿瘤作用。辛国等在山梗菜（Lobelia sessilifolia Lamb.)中分离得到甾醇类化合物豆甾醇，这也是在该属植物中的首次发现。证明了山梗菜 的抗肿瘤活性。随着抗肿瘤药物研究的不断深入，留醇类化合物的研究也将会成为热点。而 作为含有留醇类化合物的植物，山梗菜(Lobelia sessilifolia Lamb.)研究具有良好的前 景。
[0004] 山梗菜三萜类化学成分的抗肿瘤活性研究：目前从半边莲属中分离得到的三萜类 化合物共10个。主要来自紫燕草、红山梗菜、长萼野烟和山梗菜。辛国等在山梗菜(Lobelia sessilifolia Lamb.)中分离得到两个五环三砲类化合物，分别为熊果酸和齐墩果酸。并通 过细胞药理实验证明熊果酸和齐墩果酸均具有抗人肺癌细胞增殖、侵袭和诱导细胞凋亡的 作用。这再次证明了山梗菜(Lobelia sessilifolia Lamb.)的抗癌作用。但目前来看，山梗 菜(Lobelia sessilifolia Lamb.)的资源还尚未得到充分利用。因此现有技术当中亟需要 一种新型的技术方案来解决这一问题。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是:提供一种山梗菜的活性成分分析方法，对山梗菜 进行系统的分析，从中找出抗肿瘤成分，以便于更好的服务人类健康，对人类的健康做出了 更大的贡献。
[0006] 山梗菜的活性成分分析方法，其特征是:包括以下步骤，
[0007] 步骤一、山梗菜总提物的制备
[0008] 取山梗菜全草3.6kg，进行粉碎，获得粒径为20目的粉末，采用18倍量的浓度为 95%的乙醇进行两次回流提取，采用18倍量的浓度为70%的乙醇进行一次回流提取，每次 回流提取的时间均为2小时;提取结束后，进行过滤，并将三次提取的乙醇液合并回收溶剂， 干燥后获得浸膏；
[0009] 步骤二、山梗菜不同极性部位样品溶液的配制
[0010]取所述步骤一获得的浸膏，悬浮与水中，向其中依次加入石油醚、氯仿、乙酸乙酯 和正丁醇萃取，获得石油醚层干膏、氯仿层干膏、乙酸乙酯层干膏、正丁醇层干膏以及水层 干膏；
[0011]称取山梗菜石油醚层干膏、乙酸乙酯层干膏、氯仿层干膏以及正丁醇层干膏各 1. OOmg，采用无血清的RPMI-1640培养基，溶解稀释至lmg/ml，过半径为0.45μηι的滤膜后分 别稀释，配制成终浓度分别为l〇〇μg/ml、10μg/ml、lμg/ml的样品溶液；
[0012] 步骤三、山梗菜总生物碱样品溶液的配制
[0013] 取山梗菜氯仿层干膏l.OOg，进行过滤和蒸干后，获得干膏，将获得的干膏溶于浓 度为20 %的甲醇中，过滤后取滤液;用Z60_C18HCE柱对滤液进行固相萃取，收集甲醇流份，蒸 干，获得总生物碱干膏；精密称取总生物碱干膏l.OOmg，采用无血清的RPMI-1640培养基溶 解稀释至lmg/ml，过半径为〇. 45μπι的滤膜后分别稀释，配制成终浓度分别为lOOμg/ml、10μ g/ml、lμg/ml的样品溶液；
[0014] 步骤四、细胞株的培养
[0015] 取人体肺癌细胞株Spc-Al细胞，置于10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养液中，在 C〇2浓度为5 %的饱和湿度培养箱内进行37 °C恒温培养，贴壁细胞采用0.25 %胰蛋白酶进行 消化传代，取对数生长期细胞备用；
[0016] 步骤五、MTT溶液的配制
[0017] 称取MTT250mg，用ros磷酸缓冲盐溶液溶解定溶至50ml容量瓶中，溶解完全后采用 0.22μπι的滤膜进行过滤除菌，在4°C的条件下，避光保存备用；
[0018] 步骤六、阳性对照药环磷酰胺的配制
[00?9] 称取环磷酰胺0.0 lmg，用1640无血清溶液溶解稀释至0. lμg/ml，过半径为0.45μL? 的滤膜，获得溶液备用；
[0020] 步骤七、山梗菜中抗肿瘤活性的测定
[0021] 将所述步骤四获得的处于对数生长期的Spc-Al细胞按lxio5/孔接种至96孔板中 培养，待细胞贴壁后，弃去培养液，分别加入含对照药物的培养液、无对照药物的培养液以 及阳性对照培养液，对照药物分别为总生物碱、石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、氯仿 萃取部位以及正丁醇萃取部位，药物终浓度分别为l〇〇μg/ml、lOμg/ml、lμg/ml，无对照药物 的培养液为无血清RPMI-1640培养液，阳性对照培养液为O.lμg/ml的环磷酰胺;每组药物培 养设3个复孔，将给药后的细胞置于37 °C、C02浓度为5 %的饱和湿度培养箱中培养44h，加入 浓度为5mg/ml的MTT溶液20μ1，继续培养4h，培养结束后弃去培养液，加入二甲基亚砜 DMSOlOOyl，震荡溶解lOmin，采用全自动酶标仪于波长490nm处测定吸光度值，用均数进行 比较，获得肿瘤细胞抑制率。
[0022] 所述步骤三中的Z60-C18HCE柱的粒径规格为60um、内填料孔径为100A。
[0023] 所述步骤七中肿瘤细胞抑制率通过￥=[以14())/^()]\100%获得，其中4 1为给药 组吸光度值，Ao为空白组吸光度值。
[0024] 通过上述设计方案，本发明可以带来如下有益效果：山梗菜的活性成分分析方法， 对山梗菜进行系统的分析，从中找出抗肿瘤成分，以便于更好的服务人类健康，对人类的健 康做出了更大的贡献。
【附图说明】
[0025]以下结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步的说明：
[0026] 图1为本发明山梗菜的活性成分分析方法流程示意图。
【具体实施方式】
[0027] 山梗菜的活性成分分析方法，如图1所示，包括以下步骤，
[0028]步骤一、山梗菜总提物的制备:取干燥的山梗菜全草3.6kg，粉成粗粉(20目），依次 用18倍量95 %乙醇回流提取两次，70 %乙醇回流提取一次，每次2小时，过滤，合并乙醇液， 回收溶剂，干燥，得浸膏。
[0029] 步骤二、山梗菜不同极性部位样品溶液的配制：浸膏悬浮于水中，依次用石油醚、 氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得石油醚层干膏，氯仿层干膏，乙酸乙酯层干膏，正丁醇层干 膏，水层干膏。
[0030] 精密称取山梗菜石油醚层干膏、乙酸乙酯层干膏、氯仿层干膏、正丁醇层干膏各 1.00mg，用无血清的RPMI-1640培养基溶解稀释至lmg/ml，过膜，逐级稀释，配制成终浓度分 别为100μg/ml、10μg/ml、lμg/ml 的样品溶液。
[0031] 步骤三、山梗菜总生物碱样品溶液的配制：称取山梗菜氯仿层干膏l.OOg，用甲醇 溶解，过滤，蒸干，得干膏。将干膏溶于20%甲醇中，充分溶解，过滤，得滤液。用Z60-C 18HCE (规格:60um，100A)柱对滤液进行固相萃取，收集甲醇流份，蒸干，即得总生物碱干膏。精密 称取总生物碱干膏1 .〇〇mg，用无血清的RPMI-1640培养基溶解稀释至lmg/ml，过膜，逐级稀 释，配制成终浓度分别为1 〇〇μg/ml、10μg/ml、lμg/ml的样品溶液。
[0032] 步骤四、细胞株的培养:人体肺癌细胞株Spc-Al细胞为本实验室细胞药理实验室 自主培养，培养液为含10 %胎牛血清的RPMI-1640完全培养液，5 % C02饱和湿度培养箱37 °C 恒温培养，贴壁细胞采用0.25 %胰蛋白酶消化传代。取对数生长期细胞用于细胞药理实验。 [0033] 步骤五、MTT溶液的配制：精密称取MTT250mg，用PBS磷酸缓冲盐溶液溶解定溶至 5〇mL容量瓶中，完全溶解。用0.22μπι滤膜过滤除菌，4°C避光保存，备用。
[0034] 步骤六、阳性对照药环磷酰胺的配制:精密称取环磷酰胺O.Olmg，用无血清1640溶 解稀释至O.Uig/ml，过膜，备用。
[0035]步骤七、山梗菜抗肿瘤活性的测定:将处于对数生长期的Spc-Al细胞按lxlO5/孔 接种96孔板中培养，待细胞贴壁后，弃去培养液，加入含药品的培养液，药物终浓度分别为 100μg/ml、10μg/ml、lμg/ml。实验分组如下：
[0036] (1)空白组:接种与给药组等量Spc-Al细胞，无血清RPMI-1640培养液处理；
[0037] (2)阳性对照组:接种与给药组等量Spc-Al细胞，加入0. lμg/ml环磷酰胺；
[0038] (3)总生物碱组：100μg/ml、10μg/ml、lμg/ml的总生物碱给药；
[0039] (4)石油醚组：100μg/ml、10μg/ml、lμg/ml的石油醚萃取部位给药；
[0040] (5)乙酸乙酯组：100μg/ml、10μg/ml、lμg/ml的乙酸乙酯萃取部位给药；
[0041 ] (6)氯仿组组：100μg/ml、10μg/ml、lμg/ml的氯仿萃取部位给药；
[0042] (7)正丁醇组：100μg/ml、10μg/ml、lμg/ml的正丁醇萃取部位给药；
[0043] 每组设3个复孔，按照实验设计给药后将细胞置于37°C、含5%C02饱和湿度培养箱 中培养44h后，精密加入ΜΤΤ 20μ1 (浓度:5mg/ml)，继续培养4h，培养结束后弃去培养液，精 密加入DMSOlOOyl，震荡溶解lOmin，用全自动酶标仪于波长490nm处测定吸光度(0D)值，用 均数进行比较，计算肿瘤细胞抑制率。样品的抑制率计算公式:YzUArAd/AdXlOO%，式 中:Ai =给药组吸光度(0D)值，A〇 =空白组吸光度(0D)值。
[0044] 山梗菜抗肿瘤活性的测定：四个极性部位及总生物碱对Spc-Al细胞在药物终浓度 分别为1 OOμg/ml、1 Oμg/ml、lμg/ml时的抑制率和阳性对照药比较。具体数据如下表所示，
[0047]对山梗菜5个极性部位及总生物碱、总提物利用Spc-Al瘤细胞株进行了初步的体 外细胞活性测试，结果表明它们的总体抗肿瘤活性顺序从大到小依次为:总生物碱〉氯仿层 >总提物组〉石油醚层〉乙酸乙酯层〉正丁醇层〉水层。并且其活性与浓度呈正相关。可以看 出，总生物碱的抗肿瘤活性最强，其高、中、低剂量的肿瘤细胞抑制率分别为阳性对照药的 2.57、1.60、1.08倍。氯仿层高、中、低剂量组的肿瘤细胞抑制率分别为阳性对照组的2.25、 1.34、1.01倍。总提取物的抗肿瘤活性低于总生物碱和氯仿层。而乙酸乙酯、正丁醇的肿瘤 抑制率较低，说明抗肿瘤活性相对较弱，而水层的肿瘤细胞抑制率最低。由此可以判断:氯 仿层是山梗菜醇提物抗肿瘤活性最强的部位，这为进一步深入研究山梗菜氯仿层抗肿瘤活 性部位成分奠定了基础。
【主权项】
1. 山梗菜的活性成分分析方法，其特征是:包括以下步骤， 步骤一、山梗菜总提物的制备 取山梗菜全草3.6kg，进行粉碎，获得粒径为20目的粉末，采用18倍量的浓度为95 %的 乙醇进行两次回流提取，采用18倍量的浓度为70%的乙醇进行一次回流提取，每次回流提 取的时间均为2小时;提取结束后，进行过滤，并将三次提取的乙醇液合并回收溶剂，干燥后 获得浸膏； 步骤二、山梗菜不同极性部位样品溶液的配制 取所述步骤一获得的浸膏，悬浮与水中，向其中依次加入石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正 丁醇萃取，获得石油醚层干膏、氯仿层干膏、乙酸乙酯层干膏、正丁醇层干膏以及水层干膏； 称取山梗菜石油醚层干膏、乙酸乙酯层干膏、氯仿层干膏以及正丁醇层干膏各l.OOmg， 采用无血清的RPMI-1640培养基，溶解稀释至lmg/ml，过半径为0.45μπι的滤膜后分别稀释， 配制成终浓度分别为l〇〇μg/ml、10μg/ml、lμg/ml的样品溶液； 步骤三、山梗菜总生物碱样品溶液的配制 取山梗菜氯仿层干膏1. 〇〇g，进行过滤和蒸干后，获得干膏，将获得的干膏溶于浓度为 20 %的甲醇中，过滤后取滤液；用Z60-C18HCE柱对滤液进行固相萃取，收集甲醇流份，蒸干， 获得总生物碱干膏;精密称取总生物碱干膏l.OOmg，采用无血清的RPMI-1640培养基溶解稀 释至lmg/ml，过半径为0.45μηι的滤膜后分别稀释，配制成终浓度分别为100μg/ml、10μg/ml、 1 yg/m 1的样品溶液； 步骤四、细胞株的培养 取人体肺癌细胞株Spc-Al细胞，置于10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养液中，在C02浓 度为5%的饱和湿度培养箱内进行37°C恒温培养，贴壁细胞采用0.25%胰蛋白酶进行消化 传代，取对数生长期细胞备用； 步骤五、MTT溶液的配制 称取MTT250mg，用roS磷酸缓冲盐溶液溶解定溶至50ml容量瓶中，溶解完全后采用0.22 μπι的滤膜进行过滤除菌，在4°C的条件下，避光保存备用； 步骤六、阳性对照药环磷酰胺的配制 称取环磷酰胺0 . Olmg，用1640无血清溶液溶解稀释至0 . lμg/ml，过半径为0.45μηι的滤 膜，获得溶液备用； 步骤七、山梗菜中抗肿瘤活性的测定 将所述步骤四获得的处于对数生长期的Spc-Al细胞按1χ105/孔接种至96孔板中培养， 待细胞贴壁后，弃去培养液，分别加入含对照药物的培养液、无对照药物的培养液以及阳性 对照培养液，对照药物分别为总生物碱、石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、氯仿萃取部 位以及正丁醇萃取部位，药物终浓度分别为l〇〇μg/ml、lOμg/ml、lμg/ml，无对照药物的培养 液为无血清RPMI-1640培养液，阳性对照培养液为0. lμg/ml的环磷酰胺;每组药物培养设3 个复孔，将给药后的细胞置于37 °C、C02浓度为5 %的饱和湿度培养箱中培养44h，加入浓度 为5mg/ml的MTT溶液20μ1，继续培养4h，培养结束后弃去培养液，加入二甲基亚砜DMSOlOOy 1，震荡溶解l〇min，采用全自动酶标仪于波长490nm处测定吸光度值，用均数进行比较，获得 肿瘤细胞抑制率。2. 根据权利要求1所述的山梗菜的活性成分分析方法，其特征是:所述步骤三中的Z60- C18HCE柱的粒径规格为60um、内填料孔径为100A。3.根据权利要求1所述的山梗菜的活性成分分析方法，其特征是:所述步骤七中肿瘤细 胞抑制率通过Y= [ (ArAd/Ao] X 100%获得，其中，Ai为给药组吸光度值，Ao为空白组吸光度 值。
【文档编号】C12Q1/02GK105969838SQ201610307913
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】张辉, 吴楠, 孙佳明, 刘冬, 王丹, 王秀丽, 赵娜娜, 张静, 吴咏梅
【申请人】长春中医药大学