促进细胞分泌可溶性纤连蛋白的方法
【专利摘要】本发明公开了一种促进细胞分泌可溶性纤连蛋白的方法，用于解决现有方法细胞的均一性差的技术问题。技术方案是首先在培养瓶中加入新鲜培养基，置于37℃细胞培养箱中培养12h到24h，使细胞贴壁。再取出培养瓶，倒掉旧的培养基，用新鲜培养基注满培养瓶至溢出。用胶塞和封口膜密封培养瓶口，将培养瓶放入海绵支架中，贴壁一面朝外侧放入随机定位仪，采用随机模式回转进行培养，12h到24h后收集细胞条件培养基。本发明采用三维回转方法，使细胞培养基处于一种均一的生长环境，既能避免形成梯度从而培养基中产生一些不利因子对细胞生长产生的干扰，又能促进细胞分泌更多的可溶性纤连蛋白，以利于后期提取纯化。
【专利说明】
促进细胞分泌可溶性纤连蛋白的方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种促进细胞分泌可溶性纤连蛋白的方法。【背景技术】
[0002]纤连蛋白主要有两种，一种是血浆纤连蛋白，另一种是细胞纤连蛋白，两者在功能和结构上均有区别。在结构上，血浆纤连蛋白无EmB和EmA区域，以二聚体的形式组成，并以不溶形式存在于细胞外基质及细胞表面，而细胞纤连蛋白拥有EmB和EmA区域，以多聚体的形式组成，并以可溶形式存在于血浆及各种体液中；(w i n g S To , Kim S Midwood.Plasma and cellular fibronectin:distinct and independent funct1ns during tissue repair.Fibrogeneesis&Tissue Repair 2011;4:21do1:10?1186/1755-1536-4-21)在功能上，虽然它们都能调控细胞的黏附性以及迀移，但细胞纤连蛋白更有助于血细胞凝集以及恢复细胞粘性，且在维持细胞形态方面有更大的作用(Yamada K.M.andOIden,K.Fibronectins-adhesive glycoproteins of cell surface and blood.Naturel978;275:179-184)。目前血浆纤连蛋白主要是从血液中提取，比如(国内专利ZL200510017717.8动物血纤维连接蛋白联产工艺)就是利用血浆来提取纤连蛋白，因为血浆中纤连蛋白含量比较高。现有一种滚瓶法从成纤维细胞的条件培养基中提取细胞纤连蛋白，这种方法属于二维回车专(Steven K,Akiyama.Purificat1n of fibronectin.Cell B1logy 1999; 10.5.1-10.5.13)。其简要步骤是:[〇〇〇3]1、将2000ml的无血清培养基加热到37°C。
[0004] 2、用50ml加热的无血清培养液轻轻的冲洗滚瓶四次。
[0005] 3、每个滚瓶中加入50ml无血清培养基，并在37°C细胞培养箱培养至少1小时，同时滚瓶以lrp二维回转耗尽吸附血清蛋白的单分子层。
[0006]4、倒掉滚瓶中的旧的无血清培养基，加100ml新鲜的无血清培养基，以lrpm二维回转，在37 °C细胞培养箱培养24h到48h。
[0007] 5、收集滚瓶中的无血清条件培养基，然后每1000ml条件培养基中加10ml 0.2M PMSF〇
[0008]6、在25000g，4°C条件下离心，然后收集含有纤连蛋白的上清。
[0009]上述的滚瓶法及二维回转，它容易使细胞培养基形成梯度，不能使细胞处于一种完全均一的状态，从而产生对细胞不利的影响。
【发明内容】
[0010]为了克服现有方法细胞的均一性差的不足，本发明提供一种促进细胞分泌可溶性纤连蛋白的方法。该方法首先在培养瓶中加入新鲜培养基，置于37°C细胞培养箱中培养12h 到24h，使细胞贴壁。再取出培养瓶，倒掉旧的培养基，用新鲜培养基注满培养瓶至溢出。用胶塞和封口膜密封培养瓶口，将培养瓶放入海绵支架中，贴壁一面朝外侧放入随机定位仪，采用随机模式回转进行培养，12h到24h后收集细胞条件培养基。本发明采用三维回转方法， 使细胞培养基处于一种均一的生长环境，既能避免形成梯度从而培养基中产生一些不利因子对细胞生长产生的干扰，又能促进细胞分泌更多的可溶性纤连蛋白，以利于后期提取纯化。
[0011]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种促进细胞分泌可溶性纤连蛋白的方法，其特点是包括以下步骤:
[0012]步骤一、在培养瓶中接种细胞密度为以2 X 104个/cm2至2 X 105个/cm2,加入新鲜培养基，置于37 °C细胞培养箱中培养12h到24h，使细胞贴壁。
[0013]步骤二、取出培养瓶，倒掉旧的培养基，用新鲜培养基注满培养瓶，用镊子柄部轻轻敲打培养瓶细胞贴壁一面，观察培养瓶颈处上升的小气泡，待无气泡上升后停止，然后用弯管吸出培养瓶口的气泡，补加培养基至溢出。
[0014]步骤三、取出胶塞，轻放到培养瓶口，用镊子移动胶塞与培养瓶口重合，用约1.5cm 至2cm的封口膜，左短右长拉开，小心轻放拉开，盖在培养瓶盖上，绕半圈后在培养瓶盖上打十字缠绕。
[0015]步骤四、封好后，把培养瓶放入海绵支架中，贴壁一面朝外侧放入随机定位仪，采用随机模式回转进行培养，12h到24h后收集细胞条件培养基。[〇〇16]步骤五、检测收集的条件培养基中纤连蛋白的表达。
[0017]本发明的有益效果是:该方法首先在培养瓶中加入新鲜培养基，置于37°C细胞培养箱中培养12h到24h，使细胞贴壁。再取出培养瓶，倒掉旧的培养基，用新鲜培养基注满培养瓶至溢出。用胶塞和封口膜密封培养瓶口，将培养瓶放入海绵支架中，贴壁一面朝外侧放入随机定位仪，采用随机模式回转进行培养，12h到24h后收集细胞条件培养基。本发明采用三维回转方法，使细胞培养基处于一种均一的生长环境，既能避免形成梯度从而培养基中产生一些不利因子对细胞生长产生的干扰，又能促进细胞分泌更多的可溶性纤连蛋白，以利于后期提取纯化。
[0018]下面结合【具体实施方式】对本发明作详细说明。【具体实施方式】
[0019]实施例1:使用本发明所述方法提高细胞纤连蛋白的表达量。
[0020]1.准备人骨肉瘤细胞系MG-63,以5 X 104个/cm2的密度在反口瓶(规格:10cm2)中接种细胞，共接种6瓶，其中实验组3瓶，对照组3瓶，然后加入新鲜培养基(MEM+10 % FBS+1 %双抗+1%谷氨酰胺)3mL。置于37°C细胞培养箱中培养12h，汇合率达到约80%。[0021 ]2.取出培养瓶，倒掉旧的培养基，用新鲜培养基注满培养瓶，用镊子柄部轻轻敲打反口瓶细胞贴壁一面，观察瓶颈处上升的小气泡，待无气泡上升后停止，然后用弯管吸出瓶口的气泡，补加培养基至溢出。
[0022]3.取出胶塞，轻放到瓶口，用镊子移动胶塞与瓶口重合，用宽约1.5cm至2cm的封口膜，左短右长拉开，小心轻放拉开，盖在瓶盖上，绕半圈后在瓶盖上打十字缠绕。
[0023]4.封好后，把反口瓶放入海绵支架中，贴壁一面朝外侧，采用随机模式回转12h后收集条件培养基。
[0024]5.通过检测收集的条件培养基发现可溶性纤连蛋白的表达有了较大的提高。
[0025]采用本发明所述的方法来促进细胞产生纤连蛋白，由本实施例可以看出，在三维回转下，细胞培养基能更好形成一个均一的状态，避免形成梯度从而产生对细胞生长不利的影响，细胞在这种环境下分泌的纤连蛋白也有了明显的提高。
[0026]实施例2:使用本发明所述方法提高细胞纤连蛋白的表达量。[〇〇27]1.准备人骨肉瘤细胞系MG-63,以6 X 104个/cm2的密度在反口瓶(规格:10cm2)中接种细胞，共接种6瓶，其中实验组3瓶，对照组3瓶，然后加入新鲜培养基(MEM+10 % FBS+1 %双抗+1%谷氨酰胺)3mL。置于37°C细胞培养箱中培养18h，使其生长至80%的汇合率。
[0028] 2.取出培养瓶，倒掉旧的培养基，用新鲜培养基注满培养瓶，用镊子柄部轻轻敲打反口瓶细胞贴壁一面，观察瓶颈处上升的小气泡，待无气泡上升后停止，然后用弯管吸出瓶口的气泡，补加培养基至溢出。
[0029] 3.取出胶塞，轻放到瓶口，用镊子移动胶塞与瓶口重合，用宽约1.5cm至2cm的封口膜，左短右长拉开，小心轻放拉开，盖在瓶盖上，绕半圈后在瓶盖上打十字缠绕。[〇〇3〇] 4.封好后，把反口瓶放入海绵支架中，贴壁一面朝外侧，采用随机模式回转18h后收集条件培养基。[〇〇31] 5.通过检测收集的条件培养基发现可溶性纤连蛋白的表达有了较大的提高。
[0032]采用本发明所述的方法来促进细胞产生纤连蛋白，由本实施例可以看出，在三维回转下，细胞培养基能更好形成一个均一的状态，避免形成梯度从而产生对细胞生长不利的影响，细胞在这种环境下分泌的纤连蛋白也有了明显的提高。
[0033]实施例3:使用本发明所述方法提高细胞纤连蛋白的表达量。[〇〇34]1.准备人骨肉瘤细胞系MG-63,以2X 105个/cm2的密度在反口瓶(规格:10cm2)中接种细胞，共接种6瓶，其中实验组3瓶，对照组3瓶，然后加入新鲜培养基(MEM+10 % FBS+1 %双抗+1%谷氨酰胺)3mL。置于37°C细胞培养箱中培养24h，使其生长至80%的汇合率。
[0035] 2.取出培养瓶，倒掉旧的培养基，用新鲜培养基注满培养瓶，用镊子柄部轻轻敲打反口瓶细胞贴壁一面，观察瓶颈处上升的小气泡，待无气泡上升后停止，然后用弯管吸出瓶口的气泡，补加培养基至溢出。
[0036] 3.取出胶塞，轻放到瓶口，用镊子移动胶塞与瓶口重合，用宽约1.5cm至2cm的封口膜，左短右长拉开，小心轻放拉开，盖在瓶盖上，绕半圈后在瓶盖上打十字缠绕。[〇〇37]4.封好后，把反口瓶放入海绵支架中，贴壁一面朝外侧，采用定速模式回转24h后收集条件培养基。
[0038] 5.通过检测收集的条件培养基发现可溶性纤连蛋白的表达有了较大的提高。
[0039]采用本发明所述的方法来促进细胞产生纤连蛋白，由本实施例可以看出，在三维回转下，细胞培养基能更好形成一个均一的状态，避免形成梯度从而产生对细胞生长不利的影响，细胞在这种环境下分泌的纤连蛋白也有了明显的提高。
【主权项】
1.一种促进细胞分泌可溶性纤连蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤:步骤一、在培养瓶中接种细胞密度为以2 X 104个/cm2至2 X 105个/cm2,加入新鲜培养基， 置于37 °C细胞培养箱中培养12h到24h，使细胞贴壁；步骤二、取出培养瓶，倒掉旧的培养基，用新鲜培养基注满培养瓶，用镊子柄部轻轻敲 打培养瓶细胞贴壁一面，观察培养瓶颈处上升的小气泡，待无气泡上升后停止，然后用弯管 吸出培养瓶口的气泡，补加培养基至溢出；步骤三、取出胶塞，轻放到培养瓶口，用镊子移动胶塞与培养瓶口重合，用约1.5cm至 2cm的封口膜，左短右长拉开，小心轻放拉开，盖在培养瓶盖上，绕半圈后在培养瓶盖上打十 字缠绕；步骤四、封好后，把培养瓶放入海绵支架中，贴壁一面朝外侧放入随机定位仪，采用随 机模式回转进行培养，12h到24h后收集细胞条件培养基；步骤五、检测收集的条件培养基中纤连蛋白的表达。
【文档编号】C12P21/02GK105969829SQ201610313164
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月12日
【发明人】李京宝, 商澎, 薛艳茹, 续惠云, 蔺潇, 李亚楠, 杨建成, 李文彬
【申请人】西北工业大学