用于测定靶物对可溶性候选物质的生物响应的方法和系统的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明根据各自的独立权利要求涉及一种用于测定靶向物质对可溶性候选物质 的生物响应的方法并涉及相应的系统。
[0002] 基于靶物的药物研发是通过并主要由合理的药物设计、化学合成、生物测定和数 据分析组成，以反复的方式实施直至出现引导结构（lead structure)。为了测定新合成的 药物候选物在感兴趣的靶物处的效能、选择性和功效的生物测定是该工作流程的一个基础 部分。
[0003] 该生物测定的一个具体类型是稀释测定。原则上，所述稀释测定提供了不同浓度 的候选物质溶质并力图涉及靶物对不同浓度的候选物质溶质的生物响应。
[0004] WO 2011/042509公开了一种用于产生多个具有在溶剂（缓冲液）中不同溶质（候 选物质溶质）浓度的微滴的方法。所述微滴也包含恒定浓度的靶物。通过将可溶性候选物 质引入流过微流体通道的溶剂的层流中以形成在所述溶剂中的候选物质溶质。在引入所述 溶剂后，所述溶质立刻具有脉冲形状的初始浓度分布曲线。由于Taylor-Aris-分散，缓冲 液流层引起溶剂中脉冲形状的初始浓度分布曲线将它的曲线改变为高斯形状分散的浓度 分布曲线。
[0005] 应该注意的是在该方面，在本申请中使用的术语"高斯形状分散的浓度分布曲线" 指理论上高斯形状的分散的浓度曲线，然而，在实践中，分散的浓度分布曲线的实际形状可 轻微地偏离理想的高斯形状分散的浓度分布曲线，尤其是关于所述曲线的精确对称性。因 此，每当这样的高斯形状的曲线描述为对称性曲线且实际分散的浓度分布曲线轻微地偏离 精确的高斯形状曲线时，实际分散的浓度分布曲线的形状也可偏离精确对称的形状。
[0006] 回到WO 2011/042509中描述的方法，在将靶物引入含高斯形状分散的浓度分布 曲线的溶质的溶剂中后，溶剂的连续流动分为多个离散的微滴。这些微滴通过使含高斯形 状分散的浓度分布曲线的溶质和恒定浓度的靶物的溶剂的连续流与特定的流体动力流聚 焦模块的油相结合而产生，以提供溶质在各个微滴中不同的平均浓度。相邻微滴中平均浓 度的不同给出了溶质溶度阶梯的大小，这依赖于液滴的生产速率：如果液滴的生产速率下 降，平均浓度的阶梯大小增加。
[0007] 所描述的以一系列的微滴提供溶剂中的靶物和溶质的方法与数个缺点相关。微滴 将浓度分布曲线分割成离散的平均浓度（在各个微滴中的平均浓度）。这使不同平均浓度 的数目（浓度阶梯的大小）受限于分割浓度曲线的微滴的数目，以使在不同浓度方面的"分 辨率"（阶梯大小）受到了限制。此外，用于产生微滴的油的使用排除了亲脂性候选物质或 靶物的使用，因为它们倾向于扩散至所述油中。
[0008] 因此，本发明的一个目的是提供用于测定靶物对可溶性候选物质的生物响应的方 法，其克服了或至少显著减少了从现有技术中已知的缺点。
[0009] 本发明建议了一种用于测定靶物对可溶性候选物质的生物响应的方法，并包含下 面的步骤：
[0010] -将可溶性候选物质引入流经分散通道的缓冲液的层流中以形成在所述缓冲液中 的具有初始浓度分布曲线的候选物质溶质；
[0011] -通过经过分散通道的缓冲液的层流，分散所述缓冲液中候选物质溶质的初始浓 度分布曲线以形成缓冲液中候选物质溶质的分散的浓度分布曲线；
[0012] -将含具有所述分散的浓度分布曲线的候选物质溶质的缓冲液的层流导入检测通 道以在检测通道内形成缓冲液中候选物质溶质的最终的对称的浓度分布曲线；
[0013] -以得到缓冲液中组合的浓度分布曲线的方式将靶物引入检测通道内，所述组合 的浓度分布曲线包含恒定的靶物浓度分布曲线叠加所述候选物质溶质的最终的对称浓度 分布曲线；
[0014] -在检测通道内保持至少一半的在缓冲液中的组合的浓度分布曲线；和
[0015] -光学扫描保持在检测通道内的至少一半的在缓冲液中的组合的浓度分布曲线以 检测在组合的浓度分布曲线的候选物质溶质的不同浓度下的代表靶物对可溶性候选物质 的生物响应的光学信号。
[0016] 相应地，根据本发明的方法建议将在检测通道内至少一半的组合的浓度分布曲线 保持为稳定的连续曲线，以使原则上可沿着所述曲线选择无限制数目的检测位点用于光学 扫描（仅受光扫描器分辨率的限制）。所述固定的连续的曲线允许在一个预定的时间段内 光学扫描所述组合的浓度分布曲线，其中由于（分子）扩散过程在该预定时间段内是可忽 略的，因此在该时间段内所述组合的浓度分布曲线是稳定的。仅在缓冲液中（无油相）提 供候选溶质的组合的浓度分布曲线，以使也可在测定中使用亲脂的候选物质或靶物。
[0017] 所描述的方法原则上适用于已知的稀释测定，其中可溶候选物质的效能、选择性 或功效通常对感兴趣的靶物测定。所述"靶物对可溶性候选物质的生物响应"在本发明的 含义内包括任何适于利用稀释测定建立的剂量-响应曲线的生物、生物化学、药物等响应。 下面测定实例的示例性表格相对于不同的读出信号被分类，所述不同的读出信号是靶物对 可溶性候选物质的生物响应的代表。
[0018] 荧光件
[0019]
[0025] 举例来说，革巴物可属于由蛋白质（可溶性蛋白质、膜蛋白质），例如酶（例如激酶、 蛋白酶、肽酶）、转运蛋白（例如离子通道、白蛋白）、G蛋白偶联受体（例如组胺受体、5-羟 色胺受体）、转录因子等组成的组。
[0026] 可溶性候选物质可理解为感兴趣的靶物可对其响应的物质。例如，所述可溶性候 选物质可为自身可溶于缓冲液的活性成分，或者，所述可溶性候选物质可为已溶在溶剂中 (例如含活性成分的溶液）的活性成分（例如药物活性物质）且所述含活性成分的溶液可 溶于缓冲液中。术语"可溶"指所限定的可溶性候选物质溶解在各自用于具体测定的缓冲 液中的能力。术语"缓冲液"指任何相对于将被测定的生物响应通常是惰性的的合适的已 知液体。在本申请中使用的术语"靶物"理解为包含单个物质和下文描述的"组合的靶物"。
[0027] 可通过任何导致缓冲液的层流停止的测量使缓冲液保持在检测通道中，以中断检 测通道内与Taylor-Aris-分散相关的分散效应。在实施光学扫描所需的时间内，其他（分 子）扩散过程可被忽略，更确切地说，包含在固定地保持在检测通道内的缓冲液中的结合 的对称的浓度分布曲线可认为是稳定的。
[0028] 分散通道和检测通道均可为内径小于2mm，更优选地小于1mm，最优选小于100 μ m 的微流体通道。分散通道和检测通道均需要使流经的缓冲液层流，这要求适当的雷诺数。由 于Taylor-Aris-分散，缓冲液的层流引起候选物质溶质的初始浓度分布曲线变化（参见上 文的描述）。Taylor-Aris-分散使候选物质溶质浓度分布曲线变为高斯形状的浓度分布曲 线。
[0029] 在根据本发明的方法的一个方面中，通过停止将缓冲液进一步引入至分散通道和 将靶物进一步引入至检测通道来实施保持检测通道中至少一半的包含在缓冲液中的组合 的浓度分布曲线的步骤。在一个实例中，通过断开缓冲液供应栗停止缓冲液的进一步供应， 以中断缓冲液的层流。这样的栗可以是时间控制的，以便在预定的时间段后自动断开。所 述时间段在含候选物质溶质的分散的浓度分布曲线的缓冲液的层流进入检测通道时开始， 在至少一半的组合的浓度分布曲线完全在检测通道内时结束。相似的考虑应用至停止靶物 至检测通道内的引入，这可通过断开将靶物层流引入检测通道的靶物供应栗实现。
[0030] 根据本发明的方法的另一方面，含具有分散的浓度分布曲线的候选物质溶质的缓 冲液的层流以恒定的流速被引入检测通道。靶物也以恒定的流速被导入检测通道以得到组 合的浓度分布曲线，所述组合的浓度分布曲线包含恒定的靶物浓度分布曲线叠加候选物质 在缓冲液中的最终的对称的浓