本发明涉及青贮领域，尤其涉及一种玉米秸秆青贮用复合菌剂。
背景技术：
近年来，随着产业化沼气工程在我国的发展，对厌氧发酵原料的需求量逐渐增加。我国每年有大量的未利用的作物秸秆。作物秸秆是一种良好的厌氧发酵原料，将作物秸秆经微生物厌氧发酵生产沼气，是重要的生物质能源转化技术。由于秸秆的生产具有季节性，而产业沼气工程的运行需要原料的稳定持续供应，所以原料的保存非常重要。
作物秸秆的保存主要有风干和青贮两种方式。风干过程会造成可溶性物质消耗、纤维化程度增高、木质素含量升高、干物质损失严重等，从而降低秸秆的可降解性和产气潜力。
和风干相比，青贮是更好的保存作物秸秆的方式，能够有效保存青绿秸秆的营养成分，抑制纤维化过程；并且青贮保存造成的干物质损失远远低于风干保存。但是在不良的保存条件下或者在出料阶段，青贮料接触氧气后会发生二次发酵，造成干物质损失。
在青贮料制作过程中通常需要使用添加剂来提高成功率。乳酸菌添加剂是一种主要的发酵促进剂。使用乳酸菌添加剂的目的是保证乳酸菌在发酵中占优势，抑制不良微生物的活动，减少营养损失，获得优质的青贮料。
市面上有多种乳酸菌制剂，大多数为应用于青贮饲料的提高乳酸产量的同型发酵乳酸菌制剂，而异型发酵乳酸菌制剂较少。同型发酵乳酸菌制剂能够提高乳酸产量，降低乙酸产量，提高可溶性糖剩余量，而乳酸和可溶性糖都是酵母菌可以利用的底物，所以同型发酵往往会降低有氧稳定性，使青贮料易于腐败。异型发酵乳酸菌在青贮过程中能够提高乙酸产量，乙酸能够抑制酵母霉菌等真菌生长，因而能提高青贮料的有氧稳定性，防止二次发酵的发生，减少出料阶段干物质损失，因而异型乳酸菌剂的开发应引起足够的重视。
另外，市面上的乳酸菌通常为单纯化的单一菌剂或者几种乳酸菌的简单混合菌剂。纯化的单一菌剂存在纯化过程中产酸功能降低，对生长条件的适应范围窄，难以在青贮中取得优势地位，以及接种效果不理想的缺点。而简单混合的菌剂，由于组成简单，并且组成菌之间的协作关系或者拮抗关系尚有待证实。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种玉米秸秆青贮用复合菌剂，其活性菌包括：副布氏乳杆菌Lactobacillus parabuchneri、短乳杆菌Lactobacillus brevis和植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei，戊糖乳杆菌Lactobacillus pentosus和粘膜乳杆菌Lactobacillus mucosae。
本发明所述的复合菌剂，其活性菌副布氏乳杆菌Lactobacillus parabuchneri，短乳杆菌Lactobacillus brevis，植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei，戊糖乳杆菌Lactobacillus pentosus和粘膜乳杆菌Lactobacillus mucosae等各乳酸菌之间具有高度协同关系和高效稳定性，接种后在玉米秸秆中能够成为优势菌群，能够提高乳酸和乙酸的产量，提高乙酸/乳酸的比例，降低玉米青贮料的pH值，能够提高有氧稳定性抑制玉米青贮料二次发酵，进而有效减少干物质的损失。
本发明所述复合菌剂，以活菌数占总活菌数的百分比计，所述副布氏乳杆菌Lactobacillus parabuchneri、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum、短乳杆菌Lactobacillus brevis、副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei、戊糖乳杆菌Lactobacillus pentosus和粘膜乳杆菌Lactobacillus mucosae分别为：28％～35％、28％～35％、20％～25％、5％～8％、4％～6％和1％～2.5％。
优选的，以活菌数占总活菌数的百分比计，所述副布氏乳杆菌Lactobacillus parabuchneri、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum、短乳杆菌Lactobacillus brevis、副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei、戊糖乳杆菌Lactobacillus pentosus和粘膜乳杆菌Lactobacillus mucosae分别为：31.7％、31.7％和23.3％、6.7％、5.0％、1.6％。
本发明所述复合菌剂，所述副布氏乳杆菌Lactobacillus parabuchneri、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum、短乳杆菌Lactobacillus brevis、副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei、戊糖乳杆菌Lactobacillus pentosus和粘膜乳杆菌Lactobacillus mucosae的活菌数之比为28～35：28～35：20～25：5～8：4～6：1～2.5，优选为31.7：31.7：23.3：5.7：5：1.6。
优选的，所述副布氏乳杆菌Lactobacillus parabuchneri具体可为副布氏乳杆菌Lactobacillus parabuchneri JCM 12493T；
所述短乳杆菌Lactobacillus brevis具体可为短乳杆菌Lactobacillus brevis JCM 1170；
所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum具体可为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum JCM 1149T；
所述副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei具体可为副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei CGMCC No.1.3112；
所述戊糖乳杆菌Lactobacillus pentosus具体可为戊糖乳杆菌Lactobacillus pentosus JCM 1158T；
所述粘膜乳杆菌Lactobacillus mucosae具体可为粘膜乳杆菌Lactobacillus mucosae CGMCC No.6733。
本发明所述复合菌剂，其活性菌也可仅有上述副布氏乳杆菌Lactobacillus parabuchneri、短乳杆菌Lactobacillus brevis、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum、副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei、戊糖乳杆菌Lactobacillus pentosus和粘膜乳杆菌Lactobacillus mucosae组成。
本发明所述复合菌剂为液体制剂。
所述液体制剂包括甘油和EDTA；优选的，所述活性成分、甘油和EDTA的配比为1×1011CFU:1-5g甘油：1-2g EDTA，更优选为1×1011CFU:4g甘油：1g EDTA。液体制剂可使活菌数量和活性长期保持稳定，运输和使用方便。
本发明还提供了所述复合菌剂在制备玉米青贮秸秆中的应用。
本发明的上述技术方案具有以下有益效果：本发明的复合菌剂，具有组成稳定，适应性强，生长迅速，成本低廉的优点。其接种发酵效果非常明显，可以有效的提高玉米秸秆青贮料的发酵品质和乙酸产量，提高其有氧稳定性，抑制其二次发酵，减少干物质损失，在青贮领域具有广阔的市场发展前景和应用推广价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。
实施例1、玉米秸秆青贮用复合菌剂中活性菌的筛选
制备改良的SL培养液：将10g胰蛋白胨、10g酵母粉、10g葡萄糖、10g蔗糖、6g磷酸二氢钾、2g柠檬酸铵、15g无水乙酸钠、1ml吐温80、0.58g七水合硫酸镁、0.03g七水合硫酸亚铁、0.11g四水合硫酸锰以及100ml煮玉米水进行混合，加水至1000ml，用乙酸调节pH到5.3左右，即得。所述煮玉米水的制作：取4个带皮的鲜玉米，约1.5kg重，加2.5L去离子水，煮至约800ml即得。
以发酵良好的白菜泡菜为筛选菌群来源。取45mL所述改良的SL培养液装入50ml蓝盖瓶，加入5g泡菜，30℃条件下静置培养。培养72h后，按10％(体积分数比)的接种量转接培养物连续继代培养，保留pH下降迅速、产乙酸量较多且对外界环境变化相对稳定的培养物，淘汰与之相反的培养物，直到获得性质和菌种组成稳定的乳酸菌复合系。
通过平板分离技术和克隆文库技术对所述乳酸菌复合系进行研究，发现其组成菌主要为副布氏乳杆菌Lactobacillus parabuchneri、短乳杆菌Lactobacillus brevis、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，其活菌数占总活菌数的比例分别为31.7％、31.7％和23.3％，另外还有少量的副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei、戊糖乳杆菌Lactobacillus pentosus和粘膜乳杆菌Lactobacillus mucosae，其活菌数占总活菌数的比例分别为6.7％、5％和1.6％。
实施例2、玉米秸秆青贮用复合菌剂的制备
本实施例中所用的菌种均为本领域常规的菌种。
将副布氏乳杆菌Lactobacillus parabuchneri、短乳杆菌Lactobacillus brevis、植物乳杆菌Lactobacillus plantaru、副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei、戊糖乳杆菌Lactobacillus pentosus和粘膜乳杆菌Lactobacillus mucosae分别接种到MRS培养基中，30℃静置培养48h，将31.7ml上述副布氏乳杆菌的发酵液、23.3ml上述短乳杆菌的发酵液、31.7ml上述植物乳杆菌的发酵液混合6.7ml上述副干酪乳杆菌，5ml上述戊糖乳杆菌，1.6ml上述粘膜乳杆菌，使得所述混合发酵液中副布氏乳杆菌、短乳杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、戊糖乳杆菌和粘膜乳杆菌的活菌数量百分比分别为31.7％:31.7％:23.3％:6.7％:5％:1.6％，且使该混合液发酵液中总的活菌数为108CFU/ml。
将上述混合发酵液、甘油和EDTA按照1×103ml：4g：1g的配比混合，得到玉米秸秆青贮用复合菌剂的液体制剂。
实施例3、玉米秸秆青贮用复合菌剂的制备
本实施例中，副布氏乳杆菌Lactobacillus parabuchneri JCM 12493T、短乳杆菌Lactobacillus brevis JCM 1170、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum JCM 1149T和戊糖乳杆菌Lactobacillus pentosus JCM 1158T均保藏于日本微生物保存中心，副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei CGMCC No.1.3112和粘膜乳杆菌Lactobacillus mucosae CGMCC No.6733均保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
将副布氏乳杆菌Lactobacillus parabuchneri JCM 12493T、短乳杆菌Lactobacillus brevis JCM 1170、植物乳杆菌Lactobacillus plantaru JCM 1149T、副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei CGMCC No.1.3112、戊糖乳杆菌Lactobacillus pentosus JCM 1158T和粘膜乳杆菌Lactobacillus mucosae CGMCC No.6733分别接种到MRS培养基中，30℃静置培养48h，将35ml上述副布氏乳杆菌的发酵液、20ml上述短乳杆菌的发酵液、30ml上述植物乳杆菌的发酵液混合6.7ml上述副干酪乳杆菌，5ml上述戊糖乳杆菌，2ml上述粘膜乳杆菌，使得所述混合发酵液中副布氏乳杆菌、短乳杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、戊糖乳杆菌和粘膜乳杆菌的活菌数量百分比分别为31％:35％:20％:6％:6％:2％，且使该混合液发酵液中总的活菌数为108CFU/ml。
将上述混合发酵液、甘油和EDTA按照1×103ml：5g：2g的配比混合，得到玉米秸秆青贮用复合菌剂的液体制剂。
试验例1、玉米秸秆青贮用复合菌剂的接种发酵效果
将刚收获的新鲜玉米秸秆粉碎成粒径为1～2cm的秸秆颗粒，将实施例2制备的液体乳酸菌复合菌剂按照24ml:1000g所述玉米秸秆颗粒均匀混合，进行密封青贮。进行密封青贮。室温发酵50天后，所得青贮料的乳酸产量分别为22.60g/kg，乙酸产量14.11g/kg，pH值为3.7。
另作对照组1，即：取所述玉米秸秆颗粒进行密封青贮，不接种所述乳酸菌复合菌剂，室温发酵50天后，所得青贮料的乳酸和乙酸产量分别为18.53g/kg和4.33g/kg，pH值为4.0。
结果表明该乳酸菌复合系能够提高乳酸和乙酸产量，改善发酵效果。
试验例2、有氧稳定性的测定
上述试验例1的青贮结束后，立即取1000g青贮料松散地置于聚乙烯泡沫盒中，不压实、不密封，盖上盖子以减少水分蒸发。置于20℃恒温培养箱中，用YOKOGAWA DX1006无纸记录仪记录温度变化。将各热电偶探头置于秸秆中心位置，设定仪器每30s记录一次。青贮料在空气中暴露后其核心温度高出外界温度2℃所需要的小时数即为有氧稳定性。
观察发现，试验例1的未接种处理(即对照组1)的有氧稳定性为185h，接种处理的有氧稳定性为1682h，证明该乳酸菌复合菌剂大大提高了青贮玉米秸秆的有氧稳定性。青贮料在有氧暴露5天后，接种所述乳酸菌复合菌剂的青贮料相比于对照组1，其干物质损失降低10.9％；有氧暴露12天后，接种所述乳酸菌复合菌剂的青贮料相比于对照组1，其干物质损失降低了31％；可见接种乳酸菌复合菌剂有效提高了有氧稳定性并降低了干物质损失。
另作对照组2，即：取副布氏乳杆菌Lactobacillus parabuchneri按照实施例2所述方法制备具有单一菌种的液体乳酸菌复合菌剂，并进行如下试验：
(1)按照试验例1进行接种发酵效果试验，观察发现，所得青贮料的乳酸和乙酸产量分别为16.26g/kg和10.95g/kg，pH值为4.1；
(2)接着按照试验例2进行有氧稳定性的测定试验，观察发现，所得青贮料的有氧稳定性为268h；青贮料在有氧暴露5天后，相比于对照组1，其干物质损失降低8.5％；有氧暴露12天后，相比于对照组1，其干物质损失降低了26.4％。
结果表明，该乳酸菌复合系在提高乙酸产量，提高有氧稳定性和降低干物质损失方面的效果均优于单独接种副布氏乳杆菌Lactobacillus parabuchneri。
本发明的实施例是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。