一种猪链球菌2型弱毒株及其应用的制作方法

本发明属于疫苗制备技术领域，具体为一种猪链球菌2型弱毒株及其应用。

背景技术：

猪链球菌病是由多种溶血性链球菌引起的猪的一种多型性传染病，该病的临床特征是急性者表现为出血性败血症和脑炎，慢性者则表现为关节炎，心内膜炎和淋巴结脓肿。该病通常的致病菌为猪链球菌。该菌血清型有33个之多，目前已知猪链球菌2型为高毒力血清型，可引起猪发病死亡，可致人畜共患，给养猪业造成了严重的经济损失。国内预防猪链球菌病多使用单价或多价灭活疫苗，取得一定成果。上个世纪70年代以来，商品化的C群链球菌弱毒疫苗广泛应用，对马链球菌兽疫亚种引起的猪链球菌病起到很好的预防作用，大量临床试验证据表明细菌性活疫苗对控制细菌病起到积极作用，具有早期预防，诱导黏膜免疫、细胞免疫等特点。因此，目前开发针对流行血清型猪链球菌2型的活疫苗具有积极的意义，对临床上常年不断发生的猪链球菌病的预防具有明显优势。

目前我国针对猪链球菌2型的弱毒疫苗的研究多以基因工程构建为主，以猪链球菌2型菌株为亲本菌株，构建单缺失/双缺失等菌株，在一定程度上降低了猪链球菌菌的毒力，但是缺失菌株容易存在回复突变的可能，易造成菌株的毒力返强。自然弱毒株是在自然界中存在的，非人为改造的菌株，比目前以基因工程手段构建的缺失弱毒菌株更加稳定，不易产生毒力返强。本发明提供中所描述的猪链球菌是从健康猪中分离的自然弱毒株，毒力非常低，对仔猪不存在毒力，同时能刺激机体产生针对猪链球菌2型产生抗体，既安全，又有效。

技术实现要素：

本发明的目的是在于提供了一种猪链球菌2型弱毒株，所述菌株已于2017年1月4日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：猪链球菌2型(Streptococcus suis)XN，保藏编号：CCTCC NO：M2017003，地址：中国武汉武汉大学。

本发明的另一个目的在于提供了一种猪链球菌2型XN的应用，该菌株为猪链球菌2型的自然弱毒株，利用该菌株可用于制备猪链球菌2型疫苗，制得的疫苗无致病性、免疫原性好、刺激抗体迅速。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：

猪链球菌2型XN(SS2-XN株)的分离、筛选和鉴定：

申请人从2009年11月自湖北省咸宁某屠宰场屠宰猪的肺组织，经各项鉴定证明为猪链球菌2型，所述菌株已于2017年1月4日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：猪链球菌2型(Streptococcus suis)XN，保藏编号：CCTCC NO：M2017003，地址：中国武汉武汉大学。

猪链球菌2型XN(SS2-XN株)的生物学特性鉴定如下：

猪链球菌2型XN为链球菌属，大小0.1mm-1.0mm、灰白色、半透明、表面光滑、圆形、边缘整齐，在绵羊鲜血琼脂平板上形成的菌落周围可见β溶血环。新鲜培养物玻片固定后进行定革兰氏染色，镜检结果为革兰氏阳性，个体呈圆球状或卵圆形，与猪链球菌2型LT菌株(CCTCC NO：M2011282)的革兰氏结果比较，多以短链或长链排列(图1)。

猪链球菌2型在LB琼脂平皿上生长较差，37℃温箱培养20小时以上可见针尖大小菌落。在TSA平皿(含5％新生牛血清)上生长良好，37℃温箱培养12小时即见针尖大小菌落。

一种猪链球菌2型XN的应用，包括利用该链球菌制备成治疗或预防猪链球菌病2型的疫苗，或者与其他有效成分制备成联合疫苗。

优选的，上述应用中，所述疫苗的保护剂为明胶蔗糖保护剂，即疫苗中明胶的终含量为1.5％(g/ml)，蔗糖终含量为5％(g/ml)，疫苗的稀释液为20％(g/ml)氢氧化铝胶生理盐水。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本疫苗所用菌株对猪体无致病性，能较快的刺激机体产生针对同血清型的抗体。

2.本疫苗可以预防猪链球菌2型引起的疾病，对于同血清型的免疫保护效果达到90％以上，不会对机体产生应激反应，可应用于猪场中种猪和仔猪对猪链球菌病的预防，降低猪场猪链球菌病的发病率，提高仔猪存活率。

附图说明

图1：猪链球菌2型LT株和猪链球菌2型XN革兰氏染色对比图。

图1中A：猪链球菌2型LT菌株革兰氏染色；图1中B：猪链球菌2型XN革兰氏染色。

图2：一种猪链球菌通用引物扩增的PCR示意图；

其中泳道M：DNA分子Marker；泳道1：阴性对照(H₂O)，泳道2～5：猪链球菌分离菌株；泳道6：猪链球菌2型XN菌株。

图3：一种猪链球菌2型引物扩增的PCR示意图；

其中泳道1：DNA分子Marker；泳道2～5：猪链球菌分离菌株；泳道6：猪链球菌2型XN。

具体实施方式

为了使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的实施例。结合实施对本发明做进一步的描述和论证。但是该实施例不是对本发明的限制。

实施例1：

猪链球菌2型XN的分离和鉴定

待分离的病料——各组织病料是申请人从2009年11月自湖北省咸宁某屠宰场屠宰猪的肺组织分离得到。其具体分离方法为：无菌采集肺部组织接种于TSA(购自美国BD公司)平皿上，37℃培养12-24小时后观察。挑取直径为0.1mm-1.0mm、灰白色、半透明、表面光滑、圆形、边缘整齐的小菌落接种于TSB液体培养基中37℃摇床培养过夜。将纯培养后的细菌进行革兰氏染色镜检。然后用光学显微镜观察，革兰氏染色呈阳性，对其传代纯化。

猪链球菌2型的分类鉴定，采用PCR方法和玻片凝集试验进行了鉴定，具体步骤如下：

(1)PCR方法鉴定：根据参考文献(赵战勤，2007年)合成猪链球菌通用引物和猪链球菌2型特异性引物。其中猪链球菌通用引物JP4和JP5是根据谷氨酸盐脱氢酶基因(gdh，基因登录号：gb|EF539838.1|)设计，

上游引物为JP4(5’-CCATGGACAGATAAAGATGG-3’)；

下游引物为JP5(5’-GCAGCGTATTCTGTCAAACG-3’)，可扩增长度为689bp的目的DNA片段(其PCR图片见附图2)。

猪链球菌2型的特异性引物是根据猪链球菌具有型特异性的荚膜多糖抗原基因cps2J(基因登录号：JN024705.1)设计，上游引物为cps2J-F(5’-TGATAGTGATTTGTCGGGAGGG-3’)，

下游引物为cps2J-R(5’-GAGTATCTAAAGAATGCCTATTG-3’)，可扩增长度为557bp目的DNA片段(其PCR图片见附图3)。

(2)玻片凝集试验：将分离的猪链球菌2型XN接种TSB(购自美国BD公司)培养基，置37℃摇床170rpm/min，培养8小时，使OD600达到1.3～1.5，采用玻片凝集的方法对该菌液进行血清学分型鉴定。操作方法如下：

取洁净玻片1张，用微量移液器吸取3μl猪链球菌(SS)标准阳性血清(购自丹麦哥本哈根国立血清研究所)滴于载玻片上，另吸取3μl生理盐水做对照，然后吸取3μl菌液分别加入血清和生理盐水中，充分混匀(注：每次加样都要更换移液器的TIP头)。轻轻摇动载玻片，1～2min后观察结果。血清与待检菌液混合后出现明显可见的凝集块，液体变为透明，而盐水对照滴仍为均匀混浊状态，即判定为凝集反应阳性。若血清与菌液混合后为均匀混浊状态，没有出现明显可见的凝集块判定为阴性。玻片凝集试验表明，本发明分离的猪链球菌2型XN仅与猪链球菌2型标准阳性血清发生凝集反应，不与其他血清型凝集。

猪链球菌2型LT株和猪链球菌2型XN革兰氏染色对比发现：猪链球菌2型LT株多以单个或双个排列，而猪链球菌2型XN株多以多个或成串排列(图1)。

所述菌株已于2017年1月4日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：猪链球菌2型(Streptococcus suis)XN，保藏编号：CCTCC NO：M2017003，地址：中国武汉武汉大学。

实施例2

猪链球菌2型XN的毒力试验

1.1 猪链球菌2型XN(SS2-XN)对小鼠的感染试验

使用4周龄昆明系小鼠测定猪链球菌2型XN致病力。用报道的已知强毒菌株LT株(CCTCC NO：M2011282)作为参照。每株细菌分为3个剂量组(3×10⁹CFU、5×10⁸CFU、5×10⁷CFU)，每个剂量组用10只小鼠皮下接种，每只接种0.5ml的菌悬液。观察7日，统计结果如表1所示。

表1 猪链球菌2型菌株的毒力差异

*HV高致病力：致死剂量≤5×10⁸CFU,MV中等致病力：致死剂量为≤3×10⁹CFU,LV低致病力：3×10⁹CFU不致死。

表1的结果表明，用3×10⁹CFU的SS2-XN菌株接种10只昆明鼠，对昆明鼠无致病性。

1.2 猪链球菌2型XN(SS2-XN)对仔猪感染试验

仔猪试验前需检测血清抗体确认猪链球菌2型抗体阴性，方可用于该试验。按照试验菌株数将仔猪随机分组，通过颈部肌肉注射方法接种测试菌株的新鲜培养物。剩下两组作为对照，一组接种2ml PBS，另一组接种1.2×10⁶CFU的LT株菌液2ml。连续观察14天，统计发病与死亡情况。结果如表2所示。

表2 猪链球菌2型XN菌株对仔猪致病性

由表2结果表明，猪链球菌2型XN以1.1×10¹⁰CFU肌肉接种仔猪，不会对仔猪产生任何影响。

实施例3：

猪链球菌2型XN在制备猪链球菌病2型疫苗中的应用：

1.1 明胶蔗糖稳定剂的制备

明胶蔗糖保护剂，为含12％(g/ml)明胶、40％(g/ml)蔗糖的溶液。

1.1.1 精确称取进口明胶颗粒(Sigma公司)1200g，加入10L配液瓶中，然后注入约8L注射用水(pH值应为6.8～7.2)，65℃水温条件下充分搅拌，溶解均匀。

1.1.2 精密称取蔗糖(国药集团)4000g，加入上述配液瓶中，同样条件溶解均匀。

1.1.3 注射用水补足配液瓶中溶液体积至10L。

1.1.4 灭菌 116℃高压灭菌30分钟，备用。

1.1.5 储存 在2-8℃冰箱保存。使用前放入37℃温箱预热。

1.2 生产用种子菌的制备

1.2.1 一级种子菌的繁殖及检验 取猪链球菌2型XN(SS2-XN)冻存菌种接种含5％新生牛血清TSA培养基，37℃培养20～24小时，选5个以上典型菌落，混合接种含5％新生牛血清TSA斜面若干个，37℃培养16～20小时，经纯粹检查合格作为一级种子。2～8℃保存，应不超过7日，在培养基上传代，应不超过5代。

1.2.2 二级菌种繁殖及检验 取一级种子菌接种含5％新生牛血清TSB培养基，37℃，150转/分钟振荡培养8～10小时，经纯粹检查合格作为二级菌种。2～8℃保存，应不超过7日。

1.3 制苗用培养基 为含5％新生牛血清TSB培养基。

1.4 制苗菌液的制备 取检验合格的二级种子菌按体积比2％接种含5％(ml/ml)新生牛血清TSB培养基，置50升发酵罐，装液量是30升，发酵罐37℃发酵培养10小时，控制及维持发酵罐通气量(1.5VVM)、溶解氧浓度(60％)、搅拌速率(100r/min)、pH值(7.2±0.2)，放罐时的菌浓度为15亿/ml。根据疫苗规格，菌液可用高速离心法浓缩用于配苗。

1.5 半成品检验

1.5.1 纯粹检验 按现行《中国兽药典》附录进行测定，应纯粹。

1.5.2 活菌计数 取制苗菌液按《中国兽药典》附录进行计数。每毫升菌液含活菌数应不低于4.0×10⁹CFU，作为配苗计算头份的参考。

1.6 配苗及分装 将检验合格的菌液混合后，加入2.1中制备的明胶蔗糖稳定剂，使其最终明胶含量为1.5％(g/ml)，蔗糖含量为5％(g/ml)，充分混合均匀，定量分装，考虑冻干损失，每头份含活菌数应不少于7.0×10⁸CFU。

1.7 冻干 分装后迅速进行冷冻真空干燥，完成后置－15℃以下保存。

1.8 疫苗稀释液的制备

本发明所述的疫苗稀释液为铝胶盐水稀释液，成分为20％(g/ml)氢氧化铝胶生理盐水。

1.8.1 使用注射用水配制0.85％生理盐水8000ml。

1.8.2 称取氢氧化铝凝胶原胶(LV公司)2000g置上述生理盐水中，充分搅拌均匀。

1.8.3 注射用水(pH值应为6.8～7.2)补足配液瓶中溶液体积至10L

1.8.4 灭菌 116℃高压灭菌30分钟，备用。

1.8.5 分装 洁净条件下定量分装100ml/瓶，立即盖上灭菌胶塞并压铝塑盖。

按上述步骤制备三批疫苗，批号分别为201201、201202、201203，用疫苗稀释液稀释至每头份(2ml)活菌含量不少于5.0×10⁸CFU，用于以下实施例。

实施例4：

疫苗(猪链球菌2型XN)的安全性试验：

1.1 对断奶仔猪一次单剂量接种的安全性

将制备的3批疫苗分别通过颈部肌肉接种28～35日龄健康断奶仔猪，每批疫苗注射5头，每头以1次单剂量(含活菌5.0×10⁸CFU)2ml接种，观察14日，并测定体温。

1.2 对断奶仔猪一次超剂量接种的安全性

将3批疫苗分别通过颈部肌肉接种28～35日龄健康断奶仔猪，每批疫苗注射5头，每头超剂量(含活菌1.0×10¹⁰CFU)接种，观察14日。并测定体温。

2.试验结果

2.1 疫苗对断奶仔猪1次单剂量接种的安全性

接种后，仔猪体温、呼吸情况、精神状况、食欲等均正常，未见异常变化。说明该疫苗对断奶仔猪安全性很好(表3)。

表3 3批疫苗单剂量接种28～35日龄断奶仔猪后的平均体温

2.2 疫苗对断奶仔猪1次超剂量重复接种的安全性

3 批疫苗分别通过颈部肌肉以超剂量(含活菌1.0×10¹⁰CFU)接种28～35日龄健康断奶仔猪，所有猪在整个观察期间体温无明显升高，呼吸、食欲、精神状态都正常(表4)，表明该疫苗对断奶仔猪1次超剂量接种是安全的。

表4 3批疫苗单超量1次接种28～35日龄断奶仔猪后的平均体温

实施例5：

疫苗(猪链球菌2型XN)免疫效力试验

1 材料与方法

1.1 疫苗

实施例3制备的三批疫苗(猪链球菌2型XN株)，批号分别为201201、201202、201203。

1.2 效检菌株

猪链球菌血清2型LT株(CCTCC NO：M2011282)，用于攻毒试验。

1.3 实验动物

购买自湖北咸宁市神童牧业公司的28～35日龄断奶仔猪(长大)，经猪链球菌2型抗体ELISA检测试剂盒检测抗体阴性。

1.4 抗体检测方法

使用武汉科前生物有限公司生产的猪链球菌2型ELISA抗体检测试剂盒进行血清抗体水平测定

1.5 试验设计

将28～35日龄猪链球菌血清2型抗体阴性仔猪随机分成3个免疫组(分别免疫201201、201202、201203批疫苗)与1个空白对照组(未免疫)，每组5头。其中免疫组仔猪每头颈部肌肉接种疫苗1头份(5.0×10⁸CFU)。同时设置空白对照组，不进行免疫。免疫28天后，采集并分离各组猪群血清，使用猪链球菌2型抗体ELISA检测试剂盒检测特异性抗体水平，耳静脉注射致死剂量(1.2×10⁶CFU)的LT株菌悬液进行攻毒试验，攻毒后观察14天，统计保护与死亡情况。

2 结果

2.1 于首免后7天、14天、21天、28天采集并分离猪群血清，使用猪链球菌2型ELISA试剂盒检测抗体水平。具体结果如表5，表6和表7所示。

表5 201201批疫苗抗体检测记录

表6 201202批疫苗抗体检测记录

表7 201203批疫苗抗体检测记录

如表5、表6和表7结果所示，3批疫苗免疫仔猪后7天、14天、21、28天抗体检测结果表明，仔猪在免疫后7天有80％以上仔猪ELISA抗体即能转阳，随后抗体逐渐升高。

2.2 3批猪链球菌病活疫苗免疫28天后，对免疫仔猪及非免疫仔猪进行攻毒试验。攻毒后空白组仔猪24小时内均开始发病，3天内相继发病且最终死亡4头；201201、201202批疫苗免疫组攻毒后猪群均未观察到明显临床症状，5/5保护；201203批疫苗免疫组攻毒后各出现1头发病，保护率为4/5。

表8 不同批次疫苗(猪链球菌2型XN)免疫效力试验

实施例7：

疫苗的与国内产品对比试验

1 材料与方法

1.1 试验用疫苗

实施例3制备的3批猪链球菌2型弱毒疫苗，批号为201201、201202、201203；由武汉科前生物有限公司生产的猪链球菌病灭活疫苗(2型LT株+7型YZ株+C群XS株)，简称科前灭活苗。

1.2 实验动物

28～35日龄健康断奶仔猪(长大)，使用武汉科前猪链球菌2型ELISA抗体检测试剂盒检测抗体阴性，由湖北咸宁市神童牧业有限责任公司提供。

1.3 疫苗效力比较试验

1.3.1 免疫程序

将50头健康断奶仔猪(猪链球菌2型抗体检测阴性)随机等分为5组，每组10头。

1组仔猪免疫科前灭活疫苗(2型LT株+7型YZ株+C群XS株)，肌肉注射，2ml/头。

2～4组仔猪分别免疫实施例3制备的三批的猪链球菌弱毒疫苗(SS2-XN株)，每头颈部肌肉注射1头份，接种时间同科前灭活疫苗。

第5组为空白对照组，不进行任何疫苗的接种。

1.3.2 抗体测定

免疫科前灭活苗(1组)与免疫本室试制活疫苗(2－5组)的仔猪于免疫后第7、14、21、28天采血分离血清，使用科前猪链球菌2型ELISA抗体检测试剂盒检测抗体。血清抗体检测判定标准如下：样品OD630nm值≥0.35，判为阳性；样品OD630值＜0.35，判为阴性。

抗体水平差异使用t检验方法进行统计分析，p＜0.05表明两者差异显著。

1.4.3 攻毒保护性试验

本发明活疫苗与科前灭活疫苗免疫28天，对包括空白对照的所有免疫仔猪进行攻毒保护试验。检验用菌株为猪链球菌2型强毒株LT株，攻毒方式为耳静脉注射，攻毒剂量为致死剂量(1.2×10⁶CFU/mL，1mL/头)。比较2种疫苗的免疫效力。

2 结果与分析

2.1 猪链球菌2型抗体水平比较结果

免疫科前灭活苗组与本发明提供的活疫苗组于首免后7、14、21和28天采血，用猪链球菌2型和ELISA试剂盒检测特异性抗体，操作步骤及判定标准详见说明书，结果如下。

由表9与表10看出，3批本室试制活疫苗免疫仔猪7天后即能有效诱导抗体产生，抗体阳性率超过60％，14天后仔猪抗体阳性率达到100％，且OD630nm值均值超过0.5，免疫28天后上升至均值0.7左右；科前灭活苗一次免疫后第14天仔猪抗体开始转阳，到21天时抗体阳性率达到100％，均值超过0.5，攻毒前(免疫第28天)抗体上升至0.8左右。

表9 仔猪免疫猪链球菌2型活疫苗血清抗体ELISA检测结果

注：每孔测定值OD_630nm≥0.35，判定为阳性；每孔测定值OD_630nm＜0.35，判定为阴性。

表10 仔猪免疫灭活疫苗血清抗体ELISA检测结果

通过对各组疫苗免疫后抗体水平的比较，结果表明活疫苗接种7天、14天时抗体水平显著高于灭活疫苗组(p<0.05)，科前灭活疫苗诱导抗体随接种时间稳步上升，至28天时超过活疫苗诱导的抗体水平，但差异不显著。

2.2 免疫攻毒试验结果

2.2.1 免疫28天攻毒结果

本发明提供的活疫苗与科前灭活疫苗免疫28天后，对包括空白对照的所有免疫仔猪进行攻毒保护试验。攻毒后观察发病和死亡情况，计算每批疫苗的保护率。

由表11与表12数据看出，未免疫对照组仔猪经攻毒后全部发病，死亡9头，攻毒试验成立。三批本室试制活疫苗免疫仔猪经攻毒后提供的保护率分别为9/10、9/10、10/10，与科前灭活苗保护率无明显差异。

表11 猪链球菌2型活疫苗免疫仔猪攻毒试验保护性试验结果(免疫28天)

表12 商品化灭活疫苗免疫仔猪攻毒保护试验结果(免疫28天)

攻毒实验可以看出本室研制的猪链球菌2型活疫苗与科前灭活疫苗(一次免疫)攻毒保护率相当，均在90％以上，能对猪群起到针对猪链球菌病有效保护。攻毒保护试验结果亦证明按照推荐免疫程序接种活疫苗(SS2-XN株)针对猪链球菌2型的免疫效力与灭活疫苗一致。