一类角环素化合物及其在制备抗肿瘤或抗菌药物中的应用的制作方法

技术领域：

本发明属于天然产物领域，具体涉及三个海洋来源的角环素类化合物及其在制备抗肿瘤或抗菌药物中的应用。

背景技术：
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各种恶性肿瘤、致病性细菌尤其是耐药性的侵扰，不仅严重威胁人类的生命和生活质量，而且也是社会经济发展的重要包袱。近年来，随着社会经济的发展，恶性肿瘤引起的各种癌症疾病给人们造成的伤害不但没有减轻，反而逐渐成为引起我国死亡的主要原因。同时，具有很强耐药活性的所谓“超级细菌”不断出现，使得原有的抗生素治疗显得有些跟不上时代的要求。因此，加快具有抗肿瘤、抗耐药细菌等新型药物的研发，来解决当前面对的不断出现的各种癌症和耐药细菌给人类所造成的困境，已经成为当前新药研发的紧迫任务。

角环素是一类具有重要生物活性的化合物，包括具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、酶抑制等重要活性。具有芳香角环(benz[α]anthracene)基本骨架的该类化合物Tetrangomycin和tetrangulol在1965年和1966年分别被Dann和Kunstmann等人报道。在以后陆续报道的角环素化合物中，基本上是以化合物Tetrangomycin和tetrangulol为基础的衍生物，以tetrangulol为骨架的糖苷衍生物中，通常见到的为在C-8位以C-O键连接的糖苷单元，而在C-9位以C-C键连接的糖苷结构，除在1970年通过化学方法得到了aquayamycin的脱羟基衍生物dehydroxyaquayamycin外，此后该类化合物鲜有报道，直到2012年，dehydroxyaquayamycin做为一株海洋链霉菌Streptomyces sp.的次级代谢产物才被Supong等报道。

技术实现要素：
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本发明的第一个目的是提供一类具有抗肿瘤活性和抗菌活性，海洋来源的角环素化合物及其药用盐。

本发明的角环素化合物及其药用盐，其特征在于，其结构如式(Ⅰ)所示：

其中化合物1：

化合物2：

化合物3：

本发明人通过对初筛具有抑菌活性的海洋放线菌-红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)SCSIO 11594的发酵提取物进行分离，得到如式(Ⅰ)所示的三个角环素类化合物(化合物1-2)以及化合物3，其中化合物1和2为结构新颖的化合物。

因此本发明的第二个目的是提供红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)SCSIO 11594在制备上述化合物1、2和3中的应用。

通过对化合物1、化合物2和化合物3的抗肿瘤活性评价，发现化合物2对肺癌细胞株、鼻咽癌细胞株(CNE2)、乳腺癌细胞株(MCF-7)、人肝癌细胞(HepG-2)具有显著抑制作用，其IC₅₀值在0.25-0.56μM，比阳性对照药物顺铂的活性高出一个数量级，而对正常肝细胞HL7702的IC₅₀值却为3.67μM，因此，该化合物做为先导药物具有较强的成药研究前景。

本发明的第三个目的是提供化合物2，或其可药用盐，在制备抗肿瘤药物中的应用。

一种抗肿瘤药物，其特征在于，包含有效量的作为活性成份的如式(Ⅰ)所示的化合物2，或其药用盐，和药学上可以接受的载体。

所述的抗肿瘤药物优选为抗肺癌、鼻咽癌、乳腺癌和肝癌药物。

通过对化合物1、化合物2和化合物3的抑菌活性评价，发现化合物1-3对大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 25922)，金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus ATCC 29213)，粪链球菌(Enterococcus faecalis ATCC29212)，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MREA)在初始浓度为64μg/mL表现出抑制活性，而化合物3对耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE shhs-E1)具有选择性抑制活性，其MIC值为16μg/mL。

本发明的第四个目的是提供化合物1、2或3，或其可药用盐，在制备抗菌药物中的应用。

一种抗菌药物，其特征在于，包含有效量的作为活性成份的如式(Ⅰ)所示的化合物1、2或化合物3，或其药用盐，和药学上可以接受的载体。

所述的抗菌药物优选为抗大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，粪链球菌，藤黄微球菌，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的药物。进一步优选，当为化合物3时，所述的抗菌药物为抗耐甲氧西林表皮葡萄球菌的药物。

本专利所涉及的3个化合物1-3中，化合物3即dehydroxyaquayamycin再次以海洋链霉菌次级代谢产物形式被分离出来，而化合物2和3是化合物1的衍生物，化合物1中以olivose和amicetose组合的糖苷单元为首次被发现。

本发明从红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)SCSIO 11594分离到三个化合物-化合物1-3，其中化合物2-3具有抗肿瘤活性，能用于制备抗肿瘤药物。化合物1-3具有抑菌活性，能用于制备抗菌药物。因此本发明为研制新的抗肿瘤或抗菌药物提供了新的或新功能的先导化合物，对开发中国海洋药物资源具有重要的意义。

本发明的红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)SCSIO 11594于2014年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC No.10269。

附图说明：

图1是化合物1-2的¹H-¹H COSY和部分HMBC相关信息；

图2是化合物1和2的代表性NOE相关信息。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

其中化合物1：

化合物2：

化合物3：

如式(Ⅰ)所示的化合物1和化合物2，以及化合物3的制备和结构鉴定

一、如式(Ⅰ)所示的化合物1、化合物2或化合物3的制备

1.种子培养

(1)种子培养基(MAM2ab配方)：按质量分数计，包括可溶性淀粉0.5％，大豆粉0.5％，葡萄糖2％，酵母膏0.2％，蛋白胨0.2％，K₂HPO₄ 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，NaCl 0.4％，粗海盐0.3％，CaCO₃ 0.2％，余量为水，pH 7.2-7.4。按照配方，将各组份全部混合配好后分装于250mL的锥形瓶中，每瓶装50mL，121℃灭菌20分钟，做为备用的种子培养基，发酵培养基与种子培养基配方相同。

(2)种子的培养：将菌株红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)SCSIO 11594的菌丝体或孢子接入到种子培养基(MAM2ab配方)中，以200rpm的转速、在28℃下、摇床培养36小时得种子培养液。

2.放大发酵培养

(1)发酵培养

在无菌操作下，将培养好的种子培养液分别接种于发酵培养基(MAM2ab配方)中，每1000ml锥形瓶(含200mL发酵培养基)接种一瓶种子培养液(50mL)。然后将其置于控温摇床中，以200rpm的转速、在28℃下、摇床培养8天得发酵产物。

3.提取分离

将上述发酵产物，以3600rpm离心，得上清发酵液和沉淀菌丝体。发酵液用丁酮等体积萃取3次，丁酮萃取液在低于40℃减压浓缩得发酵液浸膏；菌体用丙酮反复萃取三次，丙酮萃取液在低于40℃下减压浓缩得菌体浸膏；经HPLC-DAD检测后，目标产物主要在要分布在菌液相，合并发酵液浸膏和菌体浸膏，该浸膏用100-200目硅胶分离，经拌样、干法装柱后，采用石油醚(P)/氯仿(C)(200/0,100/100，v/v)和氯仿/甲醇(150/0,147/3,144/6,141/9,138/12,145/15,120/30,75/75，v/v)梯度洗脱顺序得10个组分(A.1-A.10)。组分A4-A8(即氯仿/甲醇147/3,144/6,141/9,138/12,145/15，v/v洗脱的组份)合并后使用反相ODS中压MPLC在323nm检测波长，15mL/min的流速下梯度洗脱(MeCN/H₂O/HAc在60min内从70/30/0.1v/v的比例到100/0/0.1v/v洗脱，在达到100/0/0.1v/v的比例后继续用该比例洗脱30min，共得到9个组分B1-B9。组分B6-B7(保留时间为50-70min的馏分)以石油醚(P)/氯仿(C)10/40,0/50,氯仿(C)/甲醇(M)49.5/0.5,49/1,48.5/1.5,v/v进行梯度洗脱，得到组分C1-C17；以组份B8-B9(保留时间70-90min的馏分)以石油醚(P)/氯仿(C)10/40,0/50,氯仿(C)/甲醇(M)49.5/0.5,49/1,48.5/1.5,v/v进行梯度洗脱，得到组分D1-17。组分C12-13(C/M 98/2v/v洗脱的馏分)在MeCN/H₂O/HAc(95/5/0.1)at 2.5mL/min 323nm的条件下做SP-HPLC制备，分别在保留时间Rt 12.2min时得到化合物1 30.5mg。组份D9-12(C/M 99/1,98/2v/v洗脱的馏分)在MeCN/H₂O/HAc(95/5/0.1)at 2.5mL/min 323nm的条件下做SP-HPLC制备，在保留时间Rt 14.3min时得到化合物2 7.5mg。在反相ODS中压MPLC MeCN/H₂O/HAc(85/15/0.1)2.5mL/min 323nm的条件下从B5(保留时间40-50min的馏分)中得到保留时间为8.7min的化合物3。

二、化合物1、化合物2和化合物3的结构鉴定

对化合物1、化合物2和化合物3进行结构分析测试。对已知化合物3(+)HRESIMS m/z[M+H]⁺435.1441,cacld for C₂₅H₂₂O₇,435.1438,从而确定其分子式为C₂₅H₂₂O₇。根据其¹H和¹³C NMR的谱图数据(如表1)与文献(Phytochem.Lett.2012,5,(3),651-656)中天然产物dehydroxyaquayamycin对比而确定。

化合物1和化合物2的理化性质及波谱数据如下：

化合物1:棕褐色无定型粉末；35.0(c 0.37,CHCl₃)；UV(CHCl₃)λ_max(logε)239(4.39),323(4.31),437(3.87)nm；IR(ATR)ν_max 3418,2928,2878,1631,1269,1049cm^-1；¹H和¹³C NMR波谱数据如表1；(-)-ESIMS m/z[M-H]^-547.42,and(+)-HRESIMS m/z[M+Na]⁺571.1946,calcd for C₃₁H₃₂NaO₉,571.1939.

化合物2:棕褐色无定型粉末；30.5(c 0.19,CHCl₃)；UV(CHCl₃)λ_max(logε)239(4.15),323(4.03),436(3.58)nm；IR(ATR)ν_max 2922,2852,1730,1635,1254,1109,1069cm^-1；¹H和¹³C NMR波谱数据如表1；(+)-HRESIMS m/z[M+H]⁺545.1796calcd for C₃₁H₂₉O₉,545.1806；[M+Na]⁺567.1620,cacld for C₃₁H₂₈NaO₉,567.1626.

化合物1和化合物2的2D NMR相关信息如图1和图2：

表1化合物1-3的¹H(500MHz)和¹³C NMR(125HMz)数据化合物1和2的溶剂为CDCl₃，化合物3的溶剂为CDCl₃/CD₃OD约9/1

根据以上理化数据分析可知，化合物1、化合物2和化合物3的具体结构如式(Ⅱ)所示。

实施例2：

对实施例1的萘醌倍半萜类化合物-化合物1、化合物2和化合物3的抗肿瘤细胞的实验

采用国际通用的肿瘤细胞株，肺癌细胞株(A549)、鼻咽癌细胞株(CNE2)、乳腺癌细胞株(MCF-7)、人肝癌细胞(HepG-2)。试验方法为国际通用的SRB法，以顺铂为阳性对照，以正常肝细胞(HL7702)做参照，每株细胞系做三个平行实验，实验结果见表2：

表2化合物1、2和3对肿瘤细胞株的抑制作用(IC₅₀,μM)

上述实验结果表明，化合物2对所测试四株肿瘤细胞株具有显著的抑制活性、其对测试肿瘤细胞株的抑制活性值比阳性对照药物顺铂药强一个数量级，对正常肝细胞HL7702的抑制活性比对肿瘤细胞的抑制活性也强近一个数量级。

实施例3：

对实施例1的角环素类化合物-化合物1、化合物2和化合物3的抑菌实验。

以大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 25922)，金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus ATCC29213)，粪链球菌(Enterococcus faecalis ATCC29212)，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MREA)和耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE shhs-E1)为测试细菌，参照CLSI的微孔板法对化合物1-3进行100μl体系测试活性。具体为：

1)细菌培养。以Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基培养实验菌，当其生长8-12h至约0.5个Mcfarland浓度(1×10⁸CFU)时备用。并配置好一定浓度的样品溶液。配置样品、阳性对照浓度，阳性对照选用氨苄西林、卡那霉素两种(水溶)。

2)配置样品与稀释菌液。将样品配置成3200μg/mL，均以DMSO溶解。将菌液合理稀释，保证最终测试浓度约为5×10⁴CFU。

3)加MH肉汤。用排枪往96孔板中加MH肉汤，第1列加92μl、第12列加100μl无菌MH肉汤，其余各列加入50μl无菌MH肉汤，第11列和第12列分别作为阳性和阴性对照。

4)加样品(药品)。吸取8μl事先配好的样品或阳性对照药物，加入第1列。将排枪体积设置为50μl，将第1列的测试药物小心上下吸取4-5次，以混合均匀，期间要防止用力过猛溅出。

5)混匀样品(药品)。用排枪从第一列中吸取50μl，加入到对应的第二列中，上下吸取小心4-5次，混匀后再吸取50μl加入第三排。依次类推，直到稀释至第10列，从第10列中取出50μl弃掉。

6)活性测试。向1-11列每孔加入50μl稀释的实验菌液。此时，第1列至第10列药物浓度分别为128，64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。盖上盖子，轻微震荡，置于37℃培养箱培养12-18小时，第11列做阳性对照，第12列做空白对照，确定出每个样品的MIC值。

11.每个样品做3个平行。

结果发现，化合物1-3对大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 25922)，金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus ATCC 29213)，粪链球菌(Enterococcus faecalis ATCC29212)，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MREA)在初始浓度为64μg/mL表现出抑制活性，而化合物3对耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE shhs-E1)具有选择性抑制活性，其MIC值为16μg/mL。

综上，本发明为研制新的抗肿瘤或抗菌药物提供了新的或新功能的先导化合物，对开发中国海洋药物资源具有重要的意义。