专利名称：一种猪链球菌2型表面细胞壁蛋白、其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌蛋白，具体地说涉及一种猪链球菌的表面细胞壁蛋 白，还涉及该蛋白质的制备方法以及用途。
背景技术：
猪链球菌(S^^tococcws^^),属于兰氏分类法的R群，有35个血清型， 以猪链球菌2型流行最广，致病性最强。自丹麦在1968年最早报道人感染猪链 球菌病后，20世纪70年代以来，欧美部分国家和香港地区均报道过猪链球菌 病例，主要以脑膜炎为主，中毒性休克综合征(TSS)少见，未见暴发流行。 我国于1998年和2005年两次在江苏和四川暴发人感染猪链球菌2型疫情，不同 于国外人感染病例以脑膜炎为主的特点，临床表现为休克型和脑膜炎型。多 数病例死于中毒性休克综合征(TSS)，病理改变主要表现为全身多器官受损， 败血症伴弥漫性血管内凝血(DIC)。人猪链球菌病已成为严重威胁我国人民 健康的一种新的人畜共患病，如何有效地预防和控制猪链球菌感染已成为科 学家们面临的重要研究难题。
由于对毒力因子和保护性抗原了解甚少，同一血清型的菌株在不同的地 区毒力也不尽相同，高致病性猪链球菌感染缺乏有效的诊断耙标对该类病 原的分离鉴定主要依靠传统的分离培养和生化鉴定，然后用猪链球菌高免血清进行凝集试验分型。但家畜广泛携带链球菌，许多菌株毒力低，因此仅仅 靠生化反应检测猪链球菌是远远不够的，必须建立针对特异毒力因子的检测 手段，以区分弱毒株和强毒株。以上情况都阻碍了有效的猪链球菌病疫苗的 研制及对感染的及时诊断与控制。
纵观国外猪链球菌病疫苗的研制情况，主要经历了全菌免疫和抗原蛋白
免疫两个阶段。上世纪90年代，有研究者以福尔马林灭活的猪链球菌进行静 脉注射能剌激被免疫猪产生调理化的抗体[HoltME， EnrightMR， Alexander TJ. (1990 ) Immunisation of pigs with killed cultures of 5if，tococcws type 2. feit^48:23-7]。也有研究者通过筛选无毒力的猪链球菌突变体，如温度 敏感性突变体、链霉素依赖性突变体等来获得具有保护性的全菌疫苗[Kebede M， Chengappa MM, Stuart JG. ( 1990 ) Isolation and characterization of temperature-sensitive mutants of浙取ococcws sw&: efficacy trial of the mutant vaccine in mice.版M/cra6fo/. 22:249-57. Foster N， Staats JJ， Chengappa MM.
(1994 ) Isolation, characterization and protection studies in mice of a streptomycin-dependent mutant of Sfre; tococcws细's type 1/2. Cowi腦w. 18:155-63.]，但是灭活的全菌免疫常会引起免疫综合征等副作用。后续有研究 者利用猪链球菌相关毒力因子溶菌酶释放蛋白(MRP)、胞外因子(EF)结 合油包水型乳剂(WO)和氢氧化铝佐剂(AH)作为疫苗，对其保护性和毒副作用 作了评价，发现用MRP+EF/WO免疫的猪与用全菌/WO免疫的猪具有同等有 效的抗-MRP和抗-EF滴度，而且在免疫后的存活猪中，没有观察到明显的 临床表征[WisselinkHJ， VechtU， Stockhofe-Zurwieden N， Smith HE. (2001) Protection of pigs against challenge with virulent微》serotype 2 strains by a muramidase曙released protein and extracellular factor vaccine. Vet Rec.148:473-7.]。也有人用纯化的溶血素(SLY)作为疫苗免疫小鼠，发现能对小 鼠产生完全保护作用，免受毒力株的伤害[Jacobs AA， Loeffen PL， van den Berg AJ， Storm PK. (1994) Identification, purification, and characterization of a thiol-activated hemolysin (suilysin) of Sfreptococcws Infect Immun.
62:1742-8.]。但猪链球菌的毒力因子较常时间以来就呈现出时空上的相对多样 性，虽然MRP、 EF与毒力高度相关，但与欧洲致病株不同的是多数加拿大 致病株不表达MRP和EF，且MRP和EF的2-型猪链球菌缺失突变体与野生 型一样同样具备毒力[Gottshalk M， Lebrun A， Wisselink HJ， Dubreuil JD， Smith HE, Vecht U. (1998) Production of virulence-related proteins by Canadian strains of 5^e/ tococcws sm's capsular type 2. Can J Vet Res 62:75-79.]。我国流行株禾口非 流行株都表达MRP，且动物实验显示流行株培养分泌的上清并不引起病变， 单靠现了解的MRP、 EF、 SLY等毒力因子不足以解释我国2-型猪链球菌的致 病机理，使用MRP作为人免疫疫苗产生抗体中和MRP可能难以达到理想的 效果。而在国内，猪链球菌疫苗的研制还处于起步状态，即灭活的全菌疫苗[王 卓，舒秀伟,王文成.猪链球菌病二价灭活疫苗候选株培养条件的优化及其安 全性试验.(2004)中国药兽杂志.38: 34-36.]。因此有必要根据我国实际情况， 研制适合我国的2-型猪链球菌的新型疫苗，发掘新的具有免疫原性的毒力因 子是寻找新型疫苗的重要途径。
一般来说，表面暴露蛋白和细胞壁附着蛋白常被作为疫苗的候选耙标和 血清学诊断试剂。近10年来，也有研究者试图寻找有免疫原性的猪链球菌表 面细胞壁蛋白作为疫苗的候选分子，1996年Haataja S等分离并鉴定出一种半 乳糖抑制型黏附素，在23种血清型的猪链球菌中，用免疫印迹的方法均能检 测到这种黏附素的存在，发现具有很强的免疫原性和调理功能，适合作为疫苗候选分子[HaatajaS, TikkanenK， HytonenJ， Finne J. (1996)The Gal alpha 1-4 Gal-binding adhesin of 5^ptococcus sm's， a gram-positive meningitis-associated bacterium. Adv Exp Med Biol. 408:25-34.] 。 2005年 Okwumabua O等人通过对2-型猪链球菌的全基因组进行筛选，发现一种分子 量为38kDa蛋白，具有很好的免疫原性和保护性,认为这种蛋白是较好的疫苗
候选分子并且适合用作诊断试剂的开发，这种蛋白的生物学功能以及与致病 机理的关系正在进一步研究中[OkwumabuaO， Chinnapapakkagari S. (2005) Identification of the gene encoding a 38-kilodalton immunogenic and protective antigen of 5^/ tococc^ Clin Diagn Lab Immunol. 12:484-90]。
目前在获得具有免疫原性的蛋白方面，还缺乏有力的手段，传统生物学 方法鉴定免疫原性蛋白是困难的，需要构建基因文库，然后用相应血清筛选， 该方法耗时较长，不能实现高通量筛选，并可能存在假阳性反应。免疫蛋白 质组是一种快速、高效筛选候选诊断靶标的方法，通过将2D电泳分辨率高 和质谱直接鉴定蛋白质的优势结合，直接选取2D电泳胶上有免疫反应的蛋 白点，以质谱方法进行鉴定，因此，借助免疫蛋白质组学手段则完全可能在 较短时间内快速高效的筛选并鉴定免疫原性蛋白，尤其对猪链球菌研究相对 较少的病原微生物来说，更有可能短时间内鉴定多个全新的免疫原性蛋白。
发明内容
本发明公开了一种猪链球菌2型新型表面细胞壁蛋白、其制备方法及用 途。本发明所公开的猪链球菌2型表面细胞壁蛋白具有序列表中序列1所示 的氨基酸序列，编码该表面细胞壁蛋白的基因具有序列表中序列2所示的核 苷酸序列。该蛋白命名为SSU98—0267，其genebank编号为gi| 146320114。编码该蛋白的基因在猪链球菌2型强致病力菌株中广泛存在。
该表面细胞壁蛋白是通过免疫蛋白质组鉴定的2型猪链球菌新的免疫原 性抗原分子，目前根据猪链球菌基因组注释的结果，仅有该基因开放阅读框 架的预测，尚未有该蛋白在猪链球菌中表达的报道，也未有该基因功能的线 索。
本发明还公开了表达上述猪链球菌2型表面细胞壁蛋白的重组表达质 粒，其含有序列表中序列2的核苷酸序列。上述表达质粒可以为大肠杆菌表 达质粒，具体质粒可以是pET32a等。
本发明还公开了含有上述表达猪链球菌2型表面细胞壁蛋白的重组表达 质粒的菌株，该菌株为大肠杆菌，可以为BL21菌株。
本发明还公开了上述猪链球菌2型表面细胞壁蛋白的制备方法，该方法 包括如下步骤
首先克隆该表面细胞壁蛋白基因可通过PCR方法进行，首先设计合成 引物，在引物两端可添加酶切位点和保护性碱基，然后按照PCR方法，用猪 链球菌制备的模板，在一定条件下进行扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电 泳，并回收产物并进行酶切，确定表面细胞壁蛋白基因。然后是表达该表面 细胞壁蛋白基因的重组质粒制备将制备的表面细胞壁蛋白基因与大肠杆菌 表达载体相连接，表达载体可以为原核表达载体，可采用商业的原核表达载 体，如大肠杆菌表达载体pET32a，制备表达载体，并转化大肠杆菌，制备重 组菌，利用菌落PCR和限制性内切酶进行重组菌的筛选和鉴定；对重组菌进 行IPTG诱导表达；超声波破碎重组菌，收集上清，以GE镍亲和层析柱进行 纯化。
本发明还公开了上述表面细胞壁蛋白的用途。该蛋白可用作诊断靶标，在猪链球菌感染的动物和人血清中针对该蛋白的抗体明显上升，因而可用于 开发猪链球菌感染的诊断试剂，同时又是重要的保护性抗原，可用于制备疫
苗。本发明还公开了表面细胞壁蛋白在制备猪链球菌2型疫苗中的应用。该 蛋白制备的免疫血清调理的全血杀伤实验发现该蛋白具有相当的保护性，可 作为重点疫苗候选和诊断分子。
本发明首先将该表面细胞壁蛋白鉴定为猪链球菌2型新的免疫原性抗原 分子。己通过基因工程方法制备了该抗原并制备了相应抗体。通过抗体调理
的全血杀菌试验证实该蛋白制备的免疫血清可显著提高人全血的杀菌作用， 与猪链球菌全菌免疫血清的调理杀菌作用相当，是新的高效保护性抗原，可 作为重点疫苗候选分子。
图1为重组质粒酶切图谱。其中1为DNA分子量标准DL15000， 2为重 组质粒经EcoRI和Xhol酶双酶切。
图2为重组质粒表达图谱，其中l-5为诱导后，6为诱导前，7为低分子 量蛋白标准，从上至下依次为97.4 kDa， 66.2 kDa， 43.0 kDa， 31.0kDa， 20.0kDa。
图3针对SSU98—0267特异抗体的比较。病人和健康人的抗体水平比较 (A)，猪感染前后的抗体水平比较(B)。 ELISA实验用于评价针对SSU98—0267 特异的抗体反应，硫氧还蛋白(Trx)用作阴性对照。
具体实施例方式
实施例一 猪链球菌2型表面细胞壁 蛋白SSU98一0267的表达纯化及抗体制备1材料和方法 1.1菌株和质粒
猪链球菌2型98HAH12株[Chen C， Tang J， Dong W， Wang C， Feng Y， et al (2007) A Glimpse of Streptococcal Toxic Shock Syndrome from Comparative Genomics of S.suis 2 Chinese Isolates. PLoS ONE 2(3): e315]; BL21 ，均为国际 标准株；表达载体pET32a(+)为Novagen公司产品。 1.2酶和试剂
EcoRI和XhoI等限制性内切酶以及Taq酶、dNTPs 、 DL15000^ 量标准等 PCR所用试剂均为宝生物工程(大连)有限公司产品；DNA回收试剂盒为天 为公司产品；镍亲和层析柱为GE公司产品；质粒提取盒为V-gene公司产品； 弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂为Sigma公司产品；Amp为中诺药业产品。
1.3 PCR引物设计及SSU98J)267核酸序列，蛋白序列
根据所要扩增的片段,设计一对引物,引物两端分别添加EcoRI和XhoI酶切 位点和保护性碱基，引物P1和P2可扩增猪链球菌2型SSU98—0267基因开放 阅读框(ORF)全长片断。引物序列分别为
上游弓I物P1: 5'國tagaattcagcaagcag咖gttgtgtc誦3，见序歹據中序歹lj3; 下游引物P2: 5，-gcctcgagttcttcttttttgtttttgaatag -3，见序列表中序列4。 核酸序列> SSU98—0267 见序列表中序列2。 蛋白序列>SSU98_0267 见序列表中序列l。
1.4 PCR扩增
按下列顺序和条件依次加入各反应物并进行PCR扩增。猪链球菌2型模 板DNA 2pL， lOXbuffer 5|tiL,2.5 mmol/L dNTPs 3 P L，引物P1和P2 ( 5 y mol/L ) 各l[iL, ddH20 37pL， LA-7b《酶(5U/uL) lpL。扩增的条件为；94 °C 7min;94°C lmin， 55°C lmin， 72°C 2min， 30个循环;72 °C 7min。 1.5PCR产物的回收和酶切
PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳，后以DNA回收试剂盒回收目的片段， 并以EcoRI和XhoI 37"C酶切3h。 1.6重组质粒的构建和鉴定
在含有100ug/mLAmp的LB肉汤中接种携带pET32a空质粒的DH5 a 大肠杆菌单菌落，37T:摇振培养12 16h后，P/。转接入100ug/mLAmp的 新鲜LB肉汤37匸摇振培养6h,以质粒抽提试剂盒抽提质粒。EcoRI和XhoI双 酶切后，以DNA回收试剂盒回收酶切产物。将PCR双酶切回收产物与空质 粒双酶切回收产物进行连接，并转化感受态的DH5ci宿主菌。感受态细菌的 制备、转化均按常规方法进行，禾'」用菌落PCR和限制性内切酶酶切进行重组 菌的筛选和鉴定。 1.7重组质粒的测序和序列分析
重组质粒的序列测定采用Sanger双脱氧末端终止法，由北京三博远志生 物技术有限公司完成，以验证其阅读框架，并以BLAST软件进行同源性分析。 1.8重组质粒在大肠杆菌中的表达和纯化
将重组质粒按常规方法转化感受态的大肠杆菌BL21 ，利用Amp抗性筛选 重组菌，挑单菌落接种LB肉汤中(含100ug/mLAmp)， 3(TC剧烈摇振培养2 4h，当菌液浓度OD6oo达0.5 0.6时，加IPTG至终浓度lmmol/L， 3(TC继续 剧烈摇振培养2 4h。 6000r/min离心10min ，沉淀以蒸馏水重悬，加等体积 的2X电泳上样缓冲液煮沸10min， SDS-PAGE检测。含空pET32a(+)的大肠杆 菌BL21亦同样经IPTG诱导处理后，SDS-PAGE检测表达情况。以超声波破碎 诱导的重组菌，收集上清，以GE镍亲和层析柱进行亲和层析，具体步骤按使用说明书进行。
1.9重组蛋白动物免疫试验
将收集的蛋白以PH7.2 10mmol/L的PBS稀释至0.1mg/ml，加入等量的弗氏 完全佐剂，皮下免疫Wistar大鼠(购自军事医学科学院试验动物中心)，0.5m1/ 只；以后3 — 5周，分别以0.2， 0.4， 0.8， 1.6mg/ml加弗氏不完全佐剂加强免疫， 第7周断尾取血ELISA法测抗体效价。同时设立全菌免疫对照组和空白对照组 (pET32a空质粒转化BL21，诱导表达Trx蛋白，以此蛋白免疫大鼠为空白对 照)。以硫酸铵沉淀法制备抗血清。 2.结果
2.1PCR结果PCR产物经电泳后，出现一条2298bp的条带，大小与预期一 致。
2.2重组质粒的鉴定
SSU98—0267基因片段经回收，以EcoR I和Xho I酶切位点定向克隆至 pET-32a中，获得重组质粒，命名为SSU98—0267-pET-32a。重组质粒转化感受 态的DH5a宿主菌，经Amp抗性筛选得到重组菌。提取重组质粒，经EcoR I 和XhoI双酶切，可切出约3000bp左右的片断，说明SSU98一0267片段已成功 克隆，见图l。 2.3重组质粒的表达
重组BL21转化菌经IPTG诱导后，菌体SDS-PAGE显示有一条100kD的蛋 白带，而含诱导前的菌在该处无特异条带，见图2。经镍柱纯化获得纯化的 SSU98J)267蛋白。 2.4测序结果和序列分析
克隆的序列长度经测序为2298bp，如序列表中序列2所示，翻译后为765个氨基酸残基，见序列表中序列l。
实施例二猪链球菌2型表面细胞壁蛋白 SSU98一0267的免疫原性及抗体介导的调理吞噬试验 1.1重组猪链球菌2型表面细胞壁蛋白SSU98一0267和多抗的制备见实施例
1.2 SSU98一0267抗体介导的调理吞噬
血平板刮取猪链球菌2型单菌落，接入THB培养基，37°C， C02孵箱培养 8h后转接新鲜THB培养基培养8h至对数生长期。取lml菌液(约l X 108CFU/ml) 13，000rpm， lmin集菌，PBS洗菌并重悬，调整至l(^CFU/ml，涂血平板，记 为初始菌量。取50pl (^106CFU/ml)菌液加入10(Hd抗体，37。Cl5min后冰上 15min;加入350pl健康人全血37。C ， 3h;加入551 % saponin,冰上20min; 反复吹打后稀释涂血平板，16h后血平板记数单克隆。 1.3感染猪与人中SSU98—0267蛋白特异抗体测定
采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定病人和感染动物中针对该蛋白的 特异抗体，采用健康人的血清和感染前的动物血清作为对照。采用5pg/ml的 重组蛋白包被酶联板，包被缓冲液为0.05 M NaHC03 (PH 9.6) ， 4。C包被过 夜，然后采用3% BSA 37 °C封闭3 h。病人和健康人血清样品1:500稀释， 感染前后猪血清均1:200稀释，反应信号通过辣根过氧化物酶(HRP)标记 的二抗进行检测。 2.结果
2.1重组蛋白抗体介导的调理吞噬作用
经GE镍亲和层析柱层析获得纯化的重组蛋白SSU98J)267，分别加弗氏完全和不完全佐剂免疫后，制备抗血清，进行间接杀菌试验。杀菌率计算
(CFUrTrx—CFUr98—0267) /CFUrTrx。 Trx为从含pET32a (+)空载体的大肠杆 菌BL21镍柱纯化的硫氧还蛋白。
抗体介导的调理吞噬试验分别用SSU98J)267重组蛋白；MRP重组蛋白 免疫大鼠后的大鼠血清调理健康人血，进行人全血对猪链球菌2型活菌的杀伤 试验。SSU98—0267重组蛋白的抗血清调理人全血对猪链球菌2型的杀伤率为 50%左右，但略低于MRP蛋白的抗血清，同样条件下MRP蛋白的抗血清调理 人全血对猪链球菌2型的杀伤率为90%左右。 2.2感染的人和猪血清中SSU98—0267特异抗体检测
我们检测了 6名猪链球菌2型感染的病人和5名健康人血清中 SSU98—0267特异抗体的存在状况，结果发现与健康人相比，病人SSU98—0267 特异抗体水平明显升高，见图3A。我们检测了猪链球菌2型感染猪前后血清 中SSU98—0267特异抗体的存在状况，结果发现与感染前相比，感染后血清 中SSU98—0267特异抗体水平显著升高，见图3B。上述实验结果表明 SSU98 0267可作为诊断耙标用于猪链球菌2型感染的血清学诊断。<110〉
<120〉
<130>
<160〉
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<210〉 <211> <212〉 <213〉
<400〉
猪链表面细胞壁蛋白0267. SEQ 序歹U 表
中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种猪链球菌2型表面细胞壁蛋白、其制备方法及用途
4
Patentln version 3.2 1
765 PRT
1
Met Ser Lys Gin Lys Val Val Ser Ser Leu Leu Leu Ser Thr Val Val
1 5
10
15
Leu Gly Gly Leu Ala Phe Tyr Ser Thr Thr Thr Val Lys Ala Glu Ser 20 25 30
Leu Glu Pro Asp Val Thr Ser Val Asn Ala Ser Asp Ala Thr Asn Lys
35 40
45
Pro Val Val Pro Asn Glu Glu Gly Gly Asp Phe Leu Ala Glu Glu Glu
50 55
60
Leu Glu Asp Asp Asp Thr Leu Glu Glu Glu Leu Asn Glu Lys Ala Glu 65 70 75 80
Glu Val Thr Glu Pro Ser Ser Pro Glu Ala Leu Leu Gin Pro Arg Ala 85 90 95
Met Met Ser Asp Ser Glu Thr Ser Gly Met Glu Glu lie Pro Met Asn 100 105 110
Asp Glu Pro Ser Asp Asn Thr Glu Glu Lys Val Glu Lys Gin Gin Ser
115 120
125
Pro Leu lie Gin Thr Ser Asn Ala Asp Tyr Lys Ser Gly Lys Asp Gin
130 135
140
Glu Lys Leu Arg Thr Ser Val Ser lie Asn Leu Leu Lys Ala Glu Glu
145 150
155
160
Gly Gin lie Gin Trp Lys Val Thr Phe Asp Thr Ser Glu Trp Ser Phe 165 170 175
Asn Val Lys His Gly Gly Val Tyr Phe lie Leu Pro Asn Gly Leu Asp 180 185 190
Leu Thr Lys lie Val Asp Asn Asn Gin His Asp lie Thr Ala Ser Phe195
200
猪链表面细胞壁蛋白0267. SEQ 205
Pro Thr Asp lie Asn Asp Tyr Arg Asn Ser Gly Gin Glu Lys Tyr Arg 210 215 220
Phe Phe Ser Ser Lys Gin Gly Leu Asp Asn Glu Asn Gly Phe Asn Ser
225
230 235
240
Gin Trp Asn Trp Ser Ala Gly Gin Ala Asn Pro Ser Glu Thr Val Asn
245 250
255
Ser Trp Lys Ser Gly Asn Arg Leu Ser Lys lie Tyr Phe lie Asn Gin
260 265
270
lie Thr Asp Thr Thr Glu Leu Thr Tyr Thr Leu Thr Ala Lys Val Thr 275 280 285
Glu Pro Asn Gin Gin Ser Phe Pro Leu Leu Ala Val Met Lys Ser Phe 290 295 300
Thr Tyr Thr Asn Ser Lys Ser Thr Glu Val Thr Ser Leu Gly Ala Arg
305
310 315
320
Glu lie Thr Leu Glu Lys Glu Lys Thr Leu Pro Pro Lys Glu Asn Pro
325 330
335
Lys Pro Glu Pro Glu Ala Pro Lys Pro Asp Ala Pro Gin Ala Pro Ser
340 345
350
Ala Pro Glu Ser Pro Thr Glu Glu Pro Lys Lys Glu Asp Ala Pro Gin 355 360 365
Thr Pro Gin Ala Pro Ser Thr Pro Glu Lys Gin Pro Glu Val Pro Glu 370 375 380
Ser Pro Asn Pro Glu Thr Pro Asp Ala Pro Ser Thr Pro Lys Asp Glu 385 390 395 400
Pro Gin Ala Pro Ser lie Pro Glu Glu Lys Pro Gin Val Pro Glu Glu
405 410
415
Pro Lys Gin Glu Ala Pro Ser Ala Pro Ser Thr Pro Glu Lys Gin Pro
420 425
430
Glu Ala Pro Glu Ser Pro Thr Glu Glu Pro Lys Lys Glu Asp Ala Pro 435 440 445
Ala Pro Ser Thr Pro Glu Lys Gin Pro Glu Val Pro Glu Ser Pro Asn 450 455 460
Pro Glu Thr Pro Asp Ala Pro Ser Thr Pro Lys Asp Glu Pro Gin Val猪链表面细胞壁蛋白0267. SEQ 465 470 475 480
Pro Ser lie Pro Glu Glu Gin Pro Lys Glu Thr Pro Ala Pro Glu Glu 485 490 495
Pro Lys Lys Glu Asp Thr Pro Gin Thr Pro Gin Ala Pro Ser Thr Pro 500 505 510
Lys Glu Glu Ala Pro Lys Glu Glu Val Pro Thr Pro Pro Ala Pro Ser 515 520 525
Val Pro Glu Glu Gin Pro Lys Glu Thr Pro Thr Pro Glu Val Pro Lys 530 535 540
Gin Glu Asp Val Gin Pro Glu Ala Pro Lys Ser Asp Lys Val Glu Ser 545 550 555 560
Asp Lys Gin Met Pro Glu Thr Lys Lys Pro Asp Met Lys Gin Pro Lys 565 570 575
Ala Asp Asp Met Pro Lys Glu Gin Lys Pro Lys Ala Asp Glu Pro Lys 580 585 590
Ala Glu Gin Pro Gin Met Asp Lys Pro Gin Met Glu Ala Pro Lys Lys 595 600 605
Asp Ser Glu Ala Pro Lys Ser Asp Lys Val Glu Thr Asp Lys Gin Leu 610 615 620
Pro Glu Thr Lys Gin Pro Asp Met Lys Gin Pro Lys Ala Asp Asp Met 625 630 635 640
Pro Lys Glu Gin Lys Pro Lys Ala Asp Glu Pro Lys Ala Glu Gin Pro 645 650 655
Gin Met Asp Lys Pro Gin Met Glu Ala Pro Lys Lys Asp Ser Glu Ala 660 665 670
Pro Lys Ser Asp Lys Val Glu Thr Asp Lys Pro Met Pro Glu Thr Lys 675 680 685
Gin Pro Asp Met Lys Gin Pro Lys Ala Asp Lys Pro Glu Ala Glu Lys 690 695 700
Ala Gin Met Pro Arg Thr Glu Gly Met Lys Pro Glu Ser Lys Ala Ser 705 710 715 720
Met Met Pro Lys Ala Glu Ala Pro Lys Ala Thr Leu Pro Asn Thr Gly 725 730 735
Glu Ala Ser Ser Ala lie Gly Trp Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Leu猪链表面细胞壁蛋白0267. SEQ 740 745 750
Ala Thr Gly Leu Tyr Leu Phe Lys Asn Lys Lys Glu Glu 755 760 765
<210> 2
<211> 2298
<212〉 腿 <213>
<400> 2
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gccttttattc犯cg3caacggttaaagcagaatcgctagaaccagatgttacatcagtt120
aatgcaagcgatgctactaagtaccaaatg犯g鄉g鄉cgacttttta180
gctgaagagg3gCttg犯g3tgatgacactttggaagaagaattaaatgagaaagccgaa240
gaggttactgagccatcttcacctgaagcacttctccaacctcgtgcgatgatgagtgat300
tctgaaactagtggtatggaaga犯ttccgaaccttcagataatacggaa360
g,aggtagagaagcaacagtcgccattaattcaaacctcaaatgcagattat幼aagt420
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ggtcagattcagtggaaagtaacttttgatacaagcgaatggtcttttaatgttaaacat540
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gtttctttagtagtaaacaaggtcttgacaacgaaaatggttttaattct720
caatggaactggtctgctggtcaagctaatcctagtgaaacagtaaacagttggaaatca780
ggcaatcgtttgtctaagatttatttcataaat c aaat aacagatactaccgaattgacc840
tatactttaactgctaaggtaactgaaccaaatcagcaatcattccctcttctggcagtg900
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gagattacccttgagaaagaaaaaac t c t accacctaaggag犯tccaaaaccagagcca1020
gaagctccaaaaccagacgctccacaagcgccatcagcaccggaatctccaacggaagaa1080
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gaagtaccggaatcaccaaacccagagacaccagacgcgccatcgactccaaaagatgaa1200
ccgcaggctccatcaattccccacaagtaccggaagagccaaaacaagag1260
gctccatcagctccgtcaactccggaaaaacaaccagaagcaccggaatctccaacggaa1320
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gaagttcca_￡iaacaagaagatgttcaaccggaagcgccaaaatctgataaetgtagaatct1680猪链表面细胞壁蛋白0267.SEQ
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<210〉 4 <211> 32 <212> 腿 <213>
<400> 4 gcctcgagttcttcttttttgtttttgaat3权利要求
1.一种猪链球菌2型表面细胞壁蛋白，其特征在于具有序列表中序列1的氨基酸序列。
2. 根据权利要求1的表面细胞壁蛋白，其编码基因具有序列表中序列2 的核苷酸序列。
3. —种表达猪链球菌2型表面细胞壁蛋白的重组表达质粒，其特征在于 含有序列表中序列2的核苷酸序列。
4. 根据权利要求3所述的重组表达质粒，其中表达质粒为大肠杆菌表达 质粒pET32a。
5. —种表达猪链球菌2型表面细胞壁蛋白的菌株，其特征在于含有权利 要求3所述重组表达质粒。
6. 根据权利要求5所述菌株，其中表达菌株为大肠杆菌BL21。
7. 权利要求1或2所述表面细胞壁蛋白的制备方法，包括如下步骤-(1) 克隆该表面细胞壁蛋白基因；(2) 将基因与大肠杆菌表达质粒相连接，转化大肠杆菌；(3) 诱导表达；(4) 对表达产物进行分离纯化。
8. 根据权利要求7所述方法，其中大肠杆菌表达质粒为pET32a，大肠杆 菌为￡. co//BL21。
9. 权利要求1或2所述的表面细胞壁蛋白在制备猪链球菌2型感染诊断 试剂中的应用。
10. 权利要求1或2所述的表面细胞壁蛋白在制备猪链球菌2型疫苗中的 应用。
全文摘要
本发明公开了一种猪链球菌2型表面细胞壁蛋白，其genebank编号为gi|146320114，还公开了该蛋白质的制备方法及用途。该蛋白质可用作诊断靶标，在猪链球菌感染的病人可检测到该蛋白特异的抗体。同时又是重要的保护性抗原，可用于制备疫苗。
文档编号C07K14/195GK101613400SQ20081011551
公开日2009年12月30日 申请日期2008年6月25日 优先权日2008年6月25日
发明者姜永强, 炜 张, 李文君, 耿红冉, 媛 袁, 郑玉玲 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所