专利名称：一种猪链球菌2型表面脂蛋白、其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌表面蛋白，具体地说涉及一种猪链球菌2型的表面 蛋白，还涉及该蛋白质的制备方法以及用途。
背景技术：
猪链球菌(&^ptococcws"&)，属于兰氏分类法的R群，有35个血清型， 以猪链球菌2型流行最广，致病性最强。自丹麦在1968年最早报道人感染猪链 球菌病后，20世纪70年代以来，欧美部分国家和香港地区均报道过猪链球菌 病例，主要以脑膜炎为主，中毒性休克综合征(TSS)少见，未见暴发流行。 我国于1998年和2005年两次在江苏和四川暴发人感染猪链球菌2型疫情，不同 于国外人感染病例以脑膜炎为主的特点，临床表现为休克型和脑膜炎型。多 数病例死于中毒性休克综合征(TSS)，病理改变主要表现为全身多器官受损, 败血症伴弥漫性血管内凝血(DIC)。人猪链球菌病已成为严重威胁我国人民 健康的一种新的人畜共患病，如何有效地预防和控制猪链球菌感染已成为科 学家们面临的重要研究难题。
由于对毒力因子和保护性抗原了解甚少，同一血清型的菌株在不同的地 区毒力也不尽相同，高致病性猪链球菌感染缺乏有效的诊断靶标对该类病 原的分离鉴定主要依靠传统的分离培养和生化鉴定，然后用猪链球菌高免血清进行凝集试验分型。但家畜广泛携带链球菌，许多菌株毒力低，因此仅仅
告 罪
生化反应检测猪链球菌是远远不够的，必须建立针对特异毒力因子的检测
手段，以区分弱毒株和强毒株。以上情况都阻碍了有效的猪链球菌病疫苗的 研制及对感染的及时诊断与控制。
纵观国外猪链球菌病疫苗的研制情况，主要经历了全菌免疫和抗原蛋白
免疫两个阶段。上世纪90年代，有研究者以福尔马林灭活的猪链球菌进行静 脉注射能刺激被免疫猪产生调理化的抗体[HoltME， EnrightMR, Alexander TJ. (1990 ) Immunisation of pigs with killed cultures of浙e/ tococci^柳i type 2.
48:23-71。也有研究者通过筛选无毒力的猪链球菌突变体，如温度 敏感性突变体、链霉素依赖性突变体等来获得具有保护性的全菌疫苗[Kebede M, Chengappa MM, Stuart JG. ( 1990 ) Isolation and characterization of temperature-sensitive mutants of浙e/ tococcws efficacy trial of the mutant vaccine in mice.附MifcraWo/. 22:249-57. Foster N， Staats JJ， Chengappa MM.
(1994 ) Isolation, characterization and protection studies in mice of a streptomycin-dependent mutant of S^^ptococcus sw/s type 1/2. 及&s Com附w". 18:155-63.]，但是灭活的全菌免疫常会引起免疫综合征等副作用。后续有研究 者利用猪链球菌相关毒力因子溶菌酶释放蛋白(MRP)、胞外因子(EF)结 合油包水型乳剂(WO )和氢氧化铝佐剂(AH)作为疫苗，对其保护性和毒副作 用作了评价，发现用MRP+EF/WO免疫的猪与用全菌/WO免疫的猪具有同等 有效的抗-MRP和抗-EF滴度，而且在免疫后的存活猪中，没有观察到明显 的临床表征[Wisselink HJ， Vecht U， Stockhofe-Zurwieden N， Smith HE. (2001) Protection of pigs against challenge with virulent浙eptococc"s serotype 2strains by a muramidase-released protein and extracellular factor vaccine. Vet Rec. 148:473-7.]。也有人用纯化的溶血素(SLY)作为疫苗免疫小鼠，发现能对小 鼠产生完全保护作用，免受毒力株的伤害[Jacobs AA， Loeffen PL， van den Berg AJ， Storm PK. (1994) Identification, purification, and characterization of a thiol-activated hemolysin (suilysin) of 5^re/7tococcws sw/s. Infect Immun. 62:1742-8.]。但猪链球菌的毒力因子较常时间以来就呈现出时空上的相对多样 性，虽然MRP、 EF与毒力高度相关，但与欧洲致病株不同的是多数加拿大 致病株不表达MRP和EF，且MRP和EF的2-型猪链球菌缺失突变体与野生 型一样同样具备毒力[Gottshalk M， Lebrun A， Wisselink HJ， Dubreuil JD, Smith HE, Vecht U. (1998) Production of virulence-related proteins by Canadian strains of Sfreptococcws capsular type 2. Can J Vet Res 62:75-79.]。我国流行株和非 流行株都表达MRP，且动物实验显示流行株培养分泌的上清并不引起病变， 单靠现了解的MRP、 EF、 SLY等毒力因子不足以解释我国2-型猪链球菌的致 病机理，使用MRP作为人免疫疫苗产生抗体中和MRP可能难以达到理想的 效果。而在国内，猪链球菌疫苗的研制还处于起步状态，即灭活的全菌疫苗[王 卓,舒秀伟,王文成.猪链球菌病二价灭活疫苗候选株培养条件的优化及其安 全性试验.(2004)中国药兽杂志.38: 34-36.]。因此有必要根据我国实际情况， 研制适合我国的2-型猪链球菌的新型疫苗，发掘新的具有免疫原性的毒力因 子是寻找新型疫苗的重要途径。 一般来说，表面暴露蛋白和细胞壁附着蛋白 常被作为疫苗的候选靶标和血清学诊断试剂。近10年来，也有研究者试图寻 找有免疫原性的猪链球菌表面细胞壁蛋白作为疫苗的候选分子，1996年 Haataja S等分离并鉴定出一种半乳糖抑制型黏附素，在23种血清型的猪链球菌中，用免疫印迹的方法均能检测到这种黏附素的存在，发现具有很强的免
疫原性和调理功能，适合作为疫苗候选分子[HaatajaS， TikkanenK， Hytonen J， Finne J. (1996) The Gal alpha 1-4 Gal-binding adhesin of浙eptococcws a gram-positive meningitis-associated bacterium. Adv Exp Med Biol. 408:25-34.]。 2005年Okwumabua O等人通过对2-型猪链球菌的全基因组进行筛选，发现一 种分子量为38kDa蛋白，具有很好的免疫原性和保护性，认为这种蛋白是较好 的疫苗候选分子并且适合用作诊断试剂的开发，这种蛋白的生物学功能以及 与致病机理的关系正在进一步研究中[Okwumabua O， Chinnapapakkagari S.
(2005) Identification of the gene encoding a 38-kilodalton immunogenic and protective antigen of浙取ococcws ，》.Clin Diagn Lab Immunol. 12:484-90]。
目前在获得具有免疫原性的蛋白方面，还缺乏有力的手段，传统生物学 方法鉴定免疫原性蛋白是困难的，需要构建基因文库，然后用相应血清筛选， 该方法耗时较长，不能实现高通量筛选，并可能存在假阳性反应。免疫蛋白 质组是一种快速、高效筛选候选诊断靶标的方法，通过将2D电泳分辨率高 和质谱直接鉴定蛋白质的优势结合，直接选取2D电泳胶上有免疫反应的蛋 白点，以质谱方法进行鉴定，因此，借助免疫蛋白质组学手段则完全可能在 较短时间内快速高效的筛选并鉴定免疫原性蛋白，尤其对猪链球菌研究相对 较少的病原微生物来说，更有可能短时间内鉴定多个全新的免疫原性蛋白。
发明内容
为了寻找具有免疫原性的毒力因子，研发猪链球菌新型疫苗，本发明提 供了一种猪链球菌2型新型表面蛋白，还公开了该表面蛋白的制备方法及其用途。本发明所公开的猪链球菌2型表面蛋白具有序列表中序列1所示的氨 基酸序列，编码该表面蛋白的基因具有序列表中序列2所示的核苷酸序列， 编码该蛋白的基因在猪链球菌2型菌株中广泛存在。该蛋白命名为 SSU98—1094， genebank编号为gi| 146320941 。
本发明还公开了上述表面蛋白的制备方法，该方法包括如下步骤
首先克隆该表面蛋白基因可通过PCR方法进行，首先设计合成引物， 在引物两端可添加酶切位点和保护性碱基，然后按照PCR方法，用猪链球菌 制备的模板，在一定条件下进行扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并 回收产物并进行酶切，确定表面蛋白基因。然后是表达该表面蛋白基因的重 组质粒制备将制备的表面蛋白基因与大肠杆菌表达载体相连接，表达载体 可以为原核表达载体，可采用商业的原核表达载体，如大肠杆菌表达载体 pET32a,制备表达载体，并转化大肠杆菌，制备重组菌，利用菌落PCR和限 制性内切酶进行重组菌的筛选和鉴定；对重组菌进行IPTG诱导表达；超声 波破碎重组菌，收集上清，以GE镍亲和层析柱进行纯化。
本发明还公开了上述表面蛋白的用途。本发明的表面蛋白是通过免疫蛋 白质组鉴定的2型猪链球菌新的免疫原性抗原分子，目前根据猪链球菌基因 组注释的结果，仅有该基因开放阅读框架的预测，尚未有该蛋白在猪链球菌 中表达的报道，也未有该基因功能的线索。
本发明通过实验证明，该蛋白可用作诊断靶标，在猪链球菌感染的动物 和人血清中针对该蛋白的抗体明显上升，因而可用于开发猪链球菌感染的诊 断试剂。本发明还公开了表面蛋白在制备猪链球菌2型疫苗中的应用。动物 实验显示，该蛋白对猪链球菌致死具有很好的保护作用。通过该蛋白制备的免疫血清调理的全血杀伤实验发现该蛋白具有与全菌免疫相当的保护性，是 新的高效保护性抗原，可用于制备疫苗，作为重点疫苗候选和诊断分子。
本发明首次将该表面蛋白鉴定为猪链球菌2型新的免疫原性抗原分子， 并通过基因工程方法制备了该表面蛋白并制备了相应抗体。公开了该表面蛋 白可以用于制备猪链球菌的诊断试剂和疫苗，在有效预防和控制猪链球菌感 染方面具有良好的应用价值和广阔的市场前景。
图1为重组质粒酶切图谱。其中1为DNA分子量标准DL15000， 2为 重组质粒经EcoRI和Xhol酶双酶切。
图2为重组质粒表达图谱，其中l-5为诱导后，6为诱导前，7为低分子 量蛋白标准，从上至下依次为97.4 kDa， 66.2 kDa， 43.0 kDa， 31.0kDa， 20.0kDa。
图3为猪链球菌2型表面蛋白SSU98一1094的纯化蛋白电泳图，其中1 为低分子量蛋白标准，从上至下依次为97.4 kDa，66.2 kDa，43.0 kDa，31.0kDa， 20.0kDa。 2为上样前蛋白诱导物原液，3为上样后蛋白诱导物穿透液，4-5为 125mmol/L浓度咪唑的洗脱液(不含目的蛋白)，6-8为250mmol/L浓度咪唑 的洗脱液(含目的蛋白)。
图4针对SSU98—1094特异抗体的比较。病人和健康人的抗体水平比较 (A)，猪感染前后的抗体水平比较(B) 。ELISA实验用于评价针对SSU98—1094 特异的抗体反应，硫氧还蛋白(Trx)用作阴性对照。.
具体实施方式
实施例一 猪链球菌2型表面蛋白SSU98一1094的表达纯化及抗体制备 1.材料和方法 1.1菌株和质粒
猪链球菌2型98HAH12株[Chen C， Tang J, Dong W， Wang C， Feng Y, et al (2007) A Glimpse of Streptococcal Toxic Shock Syndrome from Comparative Genomics of S.suis 2 Chinese Isolates. PLoS ONE 2(3): e315];大肠杆菌DH5a， BL21，均为国际标准株；表达载体pET32a(+)为Novagen公司产品。 1.2酶和试剂
EcoRI和XhoI等限制性内切酶以及Taq酶、dNTPs 、 DL15000^^量标准 等PCR所用试剂均为宝生物工程(大连)有限公司产品;DNA回收试剂盒为 天为公司产品；镍亲和层析柱为GE公司产品；质粒提取盒为V-gene公司产品； 弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂为Sigma公司产品；Amp为中诺药业产品。
1.3 PCR引物设计及SSU98一1094核酸序列，蛋白序列 根据所要扩增的片段，设计一对引物，引物两端分别添加EcoRI和XhoI
酶切位点和保护性碱基，引物P1和P2可扩增猪链球菌2型SSU98一1094基因 开放阅读框(ORF)全长片断。引物序列分别为
上游引物P1: 5 、gcgaattcaacaagaaacttgttggactg腸3，见序列表中序歹U3;
下游引物P2: 5 '-atctcgagaggtttttcaggaacttctac-3，见序列表中序列4。
核酸序列>SSU98—1094见序列表中序列2，氨基酸序列>SSU98—1094
见序列表中序列l。
1.4 PCR扩增
按下列顺序和条件依次加入各反应物并进行PCR扩增。猪链球菌2型模板DNA2pL， 10Xbuffer5"L， 2.5 mmol/L dNTPs 3 y L，弓I物P1和P2 ( 5 y mol/L)各luL，ddH20 37uL，LA-7^酶(5U/yL)luL 。扩增的条件为:94 。C7min; 94。Clmin， 55。Clmin， 72。C2min， 30个循环;72。C7min。
1.5 PCR产物的回收和酶切
PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳，后以DNA回收试剂盒回收目的片段， 并以EcoRI和XhoI 37'C酶切3h。
1.6重组质粒的构建和鉴定
在含有100ug/mLAmp的LB肉汤中接种携带pET32a空质粒的DH5 a 大肠杆菌单菌落，37"C摇振培养12 16h后，1。/。转接入100ug/mLAmp的 新鲜LB肉汤37。C摇振培养6h，以质粒抽提试剂盒抽提质粒。EcoRl和XhoI 双酶切后，以DNA回收试剂盒回收酶切产物。将PCR双酶切回收产物与空质 粒双酶切回收产物进行连接，并转化感受态的DH5ci宿主菌。感受态细菌的 制备、转化均按常规方法进行，利用菌落PCR和限制性内切酶酶切进行重组 菌的筛选和鉴定。
1.7重组质粒的测序和序列分析
重组质粒的序列测定采用Sanger双脱氧末端终止法，由北京三博远志生 物技术有限公司完成，以验证其阅读框架，并以BLAST软件进行同源性分析。
1.8重组质粒在大肠杆菌中的表达和纯化
将重组质粒按常规方法转化感受态的大肠杆菌BL21 ，利用Amp抗性筛选 重组菌，挑单菌落接种LB肉汤中(含100ug/mLAmp)， 30'C剧烈摇振培养2 4h ，当菌液浓度OD6o。达0.5 0.6时，加IPTG至终浓度lmmol/L， 3(TC继续 剧烈摇振培养2 4h。 6000r/min离心10min，沉淀以蒸馏水重悬，加等体积的2X电泳上样缓冲液煮沸10min， SDS-PAGE检测。含空pET32a(+)的大肠杆菌 BL21亦同样经IPTG诱导处理后，SDS-PAGE检测表达情况。以超声波破碎诱 导的重组菌，收集上清，以GE镍亲和层析柱进行亲和层析，具体步骤按使用 说明书进行。
1.9重组蛋白动物免疫试验
将收集的蛋白以pH7.2 10mmol/L的PBS稀释至0.1mg/ml，加入等量的弗氏 完全佐剂，皮下免疫Wistar大鼠(购自军事医学科学院试验动物中心)，0.5m1/ 只；以后3—5周，分别以0.2， 0.4， 0.8， 1.6mg/ml加弗氏不完全佐剂加强免疫， 第7周断尾取血ELISA法测抗体效价。同时设立全菌免疫对照组和空白对照组
(pET32a空质粒转化BL21，诱导表达Trx蛋白，以此蛋白免疫大鼠为空白对 照)。以硫酸铵沉淀法制备抗血清。
2.结果
2.1 PCR结果
PCR产物经电泳后，出现一条1068bp的条带，大小与预期一致。 2.2重组质粒的鉴定
SSU98J094基因片段经回收，以EcoR I和Xho I酶切位点定向克隆至 pET-32a中，获得重组质粒，命名为SSU98—1094-pET-32a。重组质粒转化感受 态的DH5a宿主菌，经Amp抗性筛选得到重组菌。提取重组质粒，经EcoR I 和XhoI双酶切，可切出约1000bp左右的片断，说明SSU98一1094片段已成功 克隆，见图l。 2.3重组质粒的表达
重组BL21转化菌经IPTG诱导后，菌体SDS-PAGE显示有一条52kD的蛋白带，而含诱导前的菌在该处无特异条带。见图2。经镍柱纯化获得纯化的 SSU98—1094蛋白。见图3。 2.4测序结果和序列分析
克隆的序列长度经测序为1068bp，如序列表中序列2所示，翻译后为355 个氨基酸残基，见序列表中序列l。
实施例二猪链球菌2型表面蛋白SSU98一1094的免疫原性 及抗体介导的调理吞噬试验 1.材料方法材料同实施例一。
1.1重组猪链球菌2型表面蛋白SSU98一1094和多抗的制备见实施例一。 1.2 SSU98—1094抗体介导的调理吞噬
血平板刮取猪链球菌2型单菌落，接入THB培养基，37°C， C02孵箱培养 8h后转接新鲜THB培养基培养8h至对数生长期。取lml菌液(约l X 108CFU/ml) 13,000rpm， l.Omin集菌，PBS洗菌并重悬，调整至l()6CFU/ml，涂血平板，记 为初始菌量。取50pl ("106CFU/ml)菌液加入100ul抗体，37。C15min后冰 上15min;加入350(il健康人全血37。C ， 3h;加入55pl 1 % saponin,冰上20min; 反复吹打后稀释涂血平板，16h后血平板记数单克隆。 2.3小鼠的免疫和攻毒
6周雌性Balb/C小鼠每次用20u g与弗氏佐剂混合的SSU98一1094纯化蛋 白皮下免疫，共免疫2次，间隔2周，第l次免疫采用弗氏完全佐剂，第2次采 用弗氏不完全佐剂，以同等条件下免疫的硫氧还蛋白(Trx)为对照。第二次 免疫一周后攻毒，每只小鼠腹腔接种悬浮于lml THB培养基(Todd-Hewitt broth)猪链球菌5xl()SCFU，攻毒后观察7天记录发病率和死亡率。 2.4感染猪与人中SSU98一1094蛋白特异抗体测定
采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定病人和感染动物中针对该蛋白的 特异抗体，采用健康人的血清和感染前的动物血清作为对照。采用5pg/ml的 重组蛋白包被酶联板包被缓冲液为0.05MNaHCO3(pH9.6) ， 4。C包被过夜， 然后采用3。/。BSA 37。C封闭3h 。病人和健康人血清样品1:500稀释，感 染前后猪血清均1:200稀释，反应信号通过辣根过氧化物酶(HRP)标记的 二抗进行检测。 2.结果
2.1重组蛋白抗体介导的调理吞噬作用
经GE镍亲和层析柱层析获得纯化的重组蛋白SSU98—1094，分别加弗氏完 全和不完全佐剂免疫后，制备抗血清，进行间接杀菌试验。杀菌率计算 (CFUrTrx—CFUr98—1094) /CFUrTrx。 Trx为从含pET32a (+)空载体的大肠杆 菌BL21镍柱纯化的硫氧还蛋白。
抗体介导的调理吞噬试验分别用SSU98—1094重组蛋白；MRP重组蛋白 免疫大鼠后的大鼠血清调理健康人血，进行人全血对猪链球菌2型活菌的杀伤 试验。SSU98—1094重组蛋白的抗血清调理人全血对猪链球菌2型的杀伤率为 60%左右，但略低于MRP蛋白的抗血清。 2.2重组蛋白对小鼠攻毒的保护作用
接种细菌10个小时后，对照组表现出临床症状，如发烧和对刺激反应缓 慢，48小时内对照组死亡率为100% (10/10)，而SSU98—1094重组蛋白免疫 组的动物临床症状轻微，持续时间短，死亡率仅为20% (2/10) 。 48小时后各组小鼠不再死亡。
2.3感染的人和猪血清中SSU98一1094特异抗体检测
本发明检测了 6个猪链球菌2型感染的病人和5个健康人血清中 SSU98—1094特异抗体的存在状况，结果发现与健康人相比，病人SSU98—1094 特异抗体水平明显升高，见图4。我们检测了猪链球菌2型感染猪前后血清 中SSU98—1094特异抗体的存在状况，结果发现与感染前相比，感染后血清 中SSU98—1094特异抗体水平显著升高，见图4。上述实验结果表明 SSU98 1094可作为诊断耙标用于猪链球菌2型感染的血清学诊断。<110>
<120>
<130>
<160>
<170>
<210> <211> <212> <213〉
猪链表面蛋白.SEQ 序歹U 表
中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种猪链球菌2型表面脂蛋白、其制备方法及用途
4
Patentln version 3.2 1
355 PRT
<400〉 1
Met Asn Lys Lys Leu Val Gly Leu Gly Leu Ala Ala
5
10
Ala Ala Ala Val 15
Ser Leu Ala Ala Cys Gly Asn Arg Ala Ser Lys Ser Ser Ser Ser Glu 20 25 30
Ala Ser Ser Ser Ala Asp Thr Ser Val Lys Ala Ala lie Val Thr Asp 35 40 45
lie Gly Gly Val Asp Asp Arg Ser Phe Asn Gin Ser Ala Trp Glu Gly 50 55 60
Leu Gin Glu Trp Gly Lys Ala Ala Ser Leu Ser Lys Gly Asn Gly Tyr
65
70
75
80
Asp Tyr Phe Gin Ser Ala Ser Glu Ser Asp Tyr lie Thr Asn Leu Asp 85 90 95
Ser Ala Val Ala Gly Gly Tyr Asn Leu Val Phe Gly lie Gly Phe Ala 100 105 110
Leu Glu Ser Ala lie Ala Glu Val Ala Pro Asn Asn Pro Asn Thr His 115 120 125
Tyr Val lie Val Asp Ser Val Val Pro Asp Gin Asp Asn Val Val Ser 130 135 140
Val Gly Phe Ala Asp His Glu Ala Ser Tyr Leu Ala Gly Val Ala Ala
145
150
155
160
Ala Lys Ser Thr Lys Thr Asn His Val Gly Phe lie Gly Gly Met Glu 165 170 175
Gly Val lie lie Asp Arg Phe Glu Ala Gly Phe Val Ala Gly Ala Lys 180 185 190
Ser Val Asn Lys Asp lie Lys lie Thr Val Asp Tyr Ala Gly Ser Phe195 200
猪链表面蛋白.SEQ 205
Gly Asp Ala Ala Lys Gly Gin Thr Leu Ala Ala Ala Gin Tyr Ala Ala
210 215
220
Gly Ala Asp Val lie Phe His Ala Ser Gly Gly Thr Gly Asn Gly Val
225 230
235
240
Phe Ala Ala Ala Lys Ala Glu Asn Glu Thr Arg Asn Glu Ala Asp Lys 245 250 255
Val Trp Val lie Gly Val Asp Arg Asp Gin Ser Ala Glu Gly Thr Tyr
260 265
270
Thr Ser Lys Asp Gly Lys Ser Ser Asn Phe Val Leu Ala Ser Thr Leu
275 280
285
Lys Gin Val Gly Thr Ser Val Lys Asp lie Ala Thr Lys Ala Ala Ala
290 295
300
Gly Asp Phe Pro Gly Gly Gin Val Leu Gin Phe Ser Leu Lys Asp Lys
305 310
315
320
Gly Val Glu Leu Ala Glu Thr Asn Leu Ser Glu Asp Ala Ser Lys Ala 325 330 335
Val Ala Asp Ala Lys Gin Ala lie Uu Asp Gly Lys Val Glu Val Pro
340 345
350
Glu Lys Pro 355
<210> 2 <211〉 1068 <212〉 DNA <213〉
〈400〉 2 atgaacaaga犯cttgttgg actgggtctagcagctgctgcggctgtatctttggctgca60
tgtggtaaccgtgcttcaaa aagcagtagctcagaagcatcttcatcagcggacacatct120
gtga犯gctgctatcgttac tgacattggtggtgttgatgaccgttcatttaacc犯tct180
gcttgggaaggtcttca卿gtggggteiaagcagctagtctttccaaaggtaatggctac240
gattacttccaatcagctag tgaatcagattatatcacaaaccttgattcagctgttgct300
ggtggttacaatcttgtgtt cggtattggttttgccttgg柳gtgcgattgctgaggtt360
gC3cc3aat8atcctaatac acactatgtaatcgtggatagtgttgttccagatcaagac420
肌tgt3gttagcgtaggttt cgcagaccatgaagcatcatatcttgctggtgttgctgca480
ctaaaaca犯tcacgtaggtttcattggtggtatgg犯ggtgttatcatc540
gatcgctttgaagctggtU cgttgctggtgctaagtctgta幼c犯agacatcaagatt600猪链表面蛋白.SEQ
acagttgactatgcgggttcatttggtgatgctgctaaaggtcaaactcttgcagctgct660
caatatgctgcaggtgc柳tgttattttccacgcttctggtggtactggtaacggtgta720
tttgcagctgctaaagcagaaaaicgaaactcgt犯tgaagcagata犯gtttgggtaatc780
ggtgttgaccgtgaccaatcagcag卿gtaceitacacttctaaagatggtaaatcttct840
aactttgtattggcttcaac3ttgaaacaagttggtacttcggtta犯ga tattgcaact900
aaggcagctgcaggtgatttccctggcggtcaagtacttcaattctcattgaaag3t犯a960
tggcagaaactaatctttcagaagatgctttgcagatgct1020
ttttggatggcaaagtagaagttcctgaaaaaccttaa1068
<210〉 3 〈211〉 29 <212> DNA <213〉
<400> 3 gcgaattcaacaagaaaicttgttggactg29
<210〉 4 <211> 29 〈212〉 DNA <213>
〈400〉 4 atctcgagaggtttttcaggaacttctac29
权利要求
1.一种猪链球菌2型表面蛋白，其特征在于具有序列表中序列1的氨基酸序列。
2. 根据权利要求l的猪链球菌2型表面蛋白，其编码基因具有序列表中 序列2的核苷酸序列。
3. 含有权利要求1或2的表面蛋白编码基因的重组质粒或工程菌株。
4. 根据权利要求3的重组质粒，其中所述重组质粒采用pET32a或 pET28a。
5. 权利要求1或2所述猪链球菌2型表面蛋白的制备方法，包括如下步骤(1) 克隆该表面蛋白基因；(2) 将基因与大肠杆菌表达质粒相连接，转化大肠杆菌；(3) 诱导表达；(4) 对表达产物进行分离纯化。
6. 根据权利要求3所述方法，其中大肠杆菌表达质粒为pET32a，大肠杆 菌为co"BL21。
7. 权利要求1或2所述的猪链球菌2型表面蛋白在制备猪链球菌2型感 染诊断试剂中的应用。
8. 权利要求1所述的猪链球菌2型表面蛋白在制备猪链球菌2型疫苗中 的应用。
全文摘要
本发明公开了一种猪链球菌2型表面蛋白，还公开了该蛋白质的制备方法及用途。本发明的猪链球菌2型表面蛋白在genebank中的编号为gi|146320941，其制备方法包括克隆该表面蛋白基因；将基因与大肠杆菌表达质粒相连接，转化大肠杆菌；诱导表达；对表达产物进行分离纯化等步骤。本发明的表面蛋白可用作诊断靶标，在猪链球菌感染的动物和人可检测到该蛋白特异的抗体，同时又是重要的保护性抗原，可用于制备疫苗。
文档编号C07K14/315GK101613398SQ200810115509
公开日2009年12月30日 申请日期2008年6月25日 优先权日2008年6月25日
发明者姜永强, 炜 张, 李文君, 华 江, 耿红冉, 媛 袁, 郑玉玲 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所