专利名称：一种猪链球菌2型表面蛋白、其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌表面蛋白，具体地说涉及一种猪链球菌2型的表面 蛋白，还涉及该蛋白质的制备方法以及用途。
背景技术：
猪链球菌(5^e; tococcw^^)，属于兰氏分类法的R群，有35个血清型， 以猪链球菌2型流行最广，致病性最强。自丹麦在1968年最早报道人感染猪链 球菌病后，20世纪70年代以来，欧美部分国家和香港地区均报道过猪链球菌 病例，主要以脑膜炎为主，中毒性休克综合征(TSS)少见，未见暴发流行。 我国于1998年和2005年两次在江苏和四〗11暴发人感染猪链球菌2型疫情，不同 于国外人感染病例以脑膜炎为主的特点，临床表现为休克型和脑膜炎型。多 数病例死于中毒性休克综合征(TSS)，病理改变主要表现为全身多器官受损, 败血症伴弥漫性血管内凝血(DIC)。人猪链球菌病已成为严重威胁我国人民 健康的一种新的人畜共患病，如何有效地预防和控制猪链球菌感染己成为科 学家们面临的重要研究难题。
由于对毒力因子和保护性抗原了解甚少，同一血清型的菌株在不同的地 区毒力也不尽相同，高致病性猪链球菌感染缺乏有效的诊断耙标对该类病 原的分离鉴定主要依靠传统的分离培养和生化鉴定，然后用猪链球菌高免血 清进行凝集试验分型。但家畜广泛携带链球菌，许多菌株毒力低，因此仅仅 靠生化反应检测猪链球菌是远远不够的，必须建立针对特异毒力因子的检测手段，以区分弱毒株和强毒株。以上情况都阻碍了有效的猪链球菌病疫苗的 研制及对感染的及时诊断与控制。
纵观国外猪链球菌病疫苗的研制情况，主要经历了全菌免疫和抗原蛋白
免疫两个阶段。上世纪90年代，有研究者以福尔马林灭活的猪链球菌进行静 脉注射能刺激被免疫猪产生调理化的抗体[HoltME， EnrightMR， Alexander TJ. (1990) Immunisation of pigs with killed cultures of S^ptococciw柳\ type 2. ^L^m48:23-7]。也有研究者通过筛选无毒力的猪链球菌突变体，如温度 敏感性突变体、链霉素依赖性突变体等来获得具有保护性的全菌疫苗[Kebede M, Chengappa MM, Stuart JG ( 1990 ) Isolation and characterization of temperature-sensitive mutants of 5Vrepfococci^ ■sm/s: efficacy trial of the mutant vaccine in mice. Pfef M,cra6w/. 22:249-57. Foster N， Staats JJ， Chengappa MM.
(1994 ) Isolation, characterization and protection studies in mice of a streptomycin-dependent mutant of /S^e/^ococcws sm/s type 1/2. 及as Com附ww. 18:155-63.]，但是灭活的全菌免疫常会引起免疫综合征等副作用。后续有研究 者利用猪链球菌相关毒力因子溶菌酶释放蛋白(MRP)、胞外因子(EF)结 合油包水型乳剂(WO)和氢氧化铝佐剂(AH)作为疫苗，对其保护性和毒副作用 作了评价，发现用MRP+EF/WO免疫的猪与用全菌/WO免疫的猪具有同等有 効
临床表征[WisselinkHJ， VechtU， Stockhofe-Zurwieden N， Smith HE. (2001) Protection of pigs against challenge with virulent浙eptococcws sw/s serotype 2 strains by a muramidase-released protein and extracellular factor vaccine. Vet Rec. 148:473-7.]。也有人用纯化的溶血素(SLY)作为疫苗免疫小鼠，发现能对小 鼠产生完全保护作用，免受毒力株的伤害[Jacobs AA， Loeffen PL， van den Berg
效的抗-MRP和抗-EF滴度，而且在免疫后的存活猪中，没有观察到明显的AJ， Storm PK. (1994) Identification, purification, and characterization of a thiol-activated hemolysin (suilysin) of 浙e/ tococcw stw's. Infect Immun.
62:1742-8.]。但猪链球菌的毒力因子较常时间以来就呈现出时空上的相对多样 性，虽然MRP、 EF与毒力高度相关，但与欧洲致病株不同的是多数加拿大 致病株不表达MRP和EF，且MRP和EF的2-型猪链球菌缺失突变体与野生 型一样同样具备毒力[Gottshalk M, Lebrun A， Wisselink HJ， Dubreuil JD, Smith HE, Vecht U. (1998) Production of virulence-related proteins by Canadian strains
capsular type 2. Can J Vet Res 62:75-79.]。我国流行株和非 流行株都表达MRP，且动物实验显示流行株培养分泌的上清并不引起病变， 单靠现了解的MRP、 EF、 SLY等毒力因子不足以解释我国2-型猪链球菌的致 病机理，使用MRP作为人免疫疫苗产生抗体中和MRP可能难以达到理想的 效果。而在国内，猪链球菌疫苗的研制还处于起步状态，即灭活的全菌疫苗[王 卓，舒秀伟，王文成.猪链球菌病二价灭活疫苗候选株培养条件的优化及其安 全性试验.(2004)中国药兽杂志.38: 34-36.]。因此有必要根据我国实际情况， 研制适合我国的2-型猪链球菌的新型疫苗，发掘新的具有免疫原性的毒力因 子是寻找新型疫苗的重要途径。
一般来说，表面暴露蛋白和细胞壁附着蛋白常被作为疫苗的候选靶标和 血清学诊断试剂。近10年来，也有研究者试图寻找有免疫原性的猪链球菌表 面细胞壁蛋白作为疫苗的候选分子，1996年Haataja S等分离并鉴定出一种半 乳糖抑制型黏附素，在23种血清型的猪链球菌中，用免疫印迹的方法均能检 测到这种黏附素的存在，发现具有很强的免疫原性和调理功能，适合作为疫 苗候选分子[HaatajaS， TikkanenK， HytonenJ， Finne J.( 1996)The Gal alpha 1-4Gal-bindingadhesinof 浙e/ tococcMssw&，a gram-positivemeningitis-associated bacterium. Adv Exp Med Biol. 408:25-34.] 。 2005年 Okwumabua O等人通过对2-型猪链球菌的全基因组进行筛选，发现一种分子 量为38kDa蛋白，具有很好的免疫原性和保护性,认为这种蛋白是较好的疫苗 候选分子并且适合用作诊断试剂的开发，这种蛋白的生物学功能以及与致病 机理的关系正在进一步研究中[OkwumabuaO， Chinnapapakkagari S, (2005) Identification of the gene encoding a 38-kilodalton immunogenic and protective antigen of 5yre/ tococcws Clin Diagn Lab Immunol. 12:484-90]。
发明内容
为了寻找具有免疫原性的毒力因子，研发猪链球菌新型疫苗，本发明提 供了一种猪链球菌2型新型表面蛋白，还公开了该表面蛋白的制备方法及其 用途。本发明所公开的猪链球菌2型表面蛋白具有序列表中序列1所示的氨 基酸序列，编码该表面蛋白的基因具有序列表中序列2所示的核苷酸序列， 编码该蛋白的基因在猪链球菌2型菌株中广泛存在。该蛋白命名为 SSU98—1675， genebank编号为gi|146321522。
本发明还公开了表达上述猪链球菌2型表面细胞壁蛋白的重组表达质 粒，其含有序列表中序列2的核苷酸序列。上述表达质粒可以为大肠杆菌表 达质粒，具体质粒可以是pET32a等。
本发明还公开了含有上述表达猪链球菌2型表面细胞壁蛋白的重组表达 质粒的菌株，该菌株为大肠杆菌，可以为BL21菌株。
本发明还公开了上述表面蛋白的制备方法，该方法包括如下步骤
首先克隆该表面蛋白基因可通过PCR方法进行，首先设计合成引物， 在引物两端可添加酶切位点和保护性碱基，然后按照PCR方法，用猪链球菌制备的模板，在一定条件下进行扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并 回收产物并进行酶切，确定表面蛋白基因。然后是表达该表面蛋白基因的重 组质粒制备将制备的表面蛋白基因与大肠杆菌表达载体相连接，表达载体 可以为原核表达载体，可采用商业的原核表达载体，如大肠杆菌表达载体 pET32a，制备表达载体，并转化大肠杆菌，制备重组菌，利用菌落PCR和限 制性内切酶进行重组菌的筛选和鉴定；对重组菌进行IPTG诱导表达；超声 波破碎重组菌，收集上清，以GE镍亲和层析柱进行纯化。
本发明还公开了上述表面蛋白的用途。本发明的表面蛋白是通过免疫蛋 白质组鉴定的2型猪链球菌新的免疫原性抗原分子，目前根据猪链球菌基因 组注释的结果，仅有该基因开放阅读框架的预测，尚未有该蛋白在猪链球菌 中表达的报道，也未有该基因功能的线索。
本发明通过实验证明，该蛋白可用作诊断靶标，在猪链球菌感染的动物 和人血清中针对该蛋白的抗体明显上升，因而可用于开发猪链球菌感染的诊 断试剂。本发明还公开了表面蛋白在制备猪链球菌2型疫苗中的应用。通过 该蛋白制备的免疫血清调理的全血杀伤实验发现该蛋白具有一定的保护性， 是新的高效保护性抗原，可用于制备疫苗，作为重点疫苗候选和诊断分子。
本发明首次将该表面蛋白鉴定为猪链球菌2型新的免疫原性抗原分子， 并通过基因工程方法制备了该表面蛋白并制备了相应抗体。并公开了该表面 蛋白可以用于制备猪链球菌的诊断试剂和疫苗，在有效预防和控制猪链球菌 感染方面具有良好的应用价值和广阔的巿场前景。
图1为猪链球菌2型表面蛋白SSU98—1675的纯化蛋白电泳图，其中3为低分子量蛋白标准，从上至下依次为97.4 kDa， 66.2 kDa,43.0 kDa， 31.0kDa， 20.0kDa; 1为上样前蛋白诱导物原液，2为上样后蛋白诱导物穿透液，4-5为 50mmol/L浓度咪唑的洗脱液(不含目的蛋白)，6-8为150mmol/L浓度咪唑 的洗脱液(含目的蛋白)。
图2针对SSU98一1675特异抗体的比较。病人和健康人的抗体水平比较 (A)，猪感染前后的抗体水平比较(B) 。ELISA实验用于评价针对SSU98一1675 特异的抗体反应，硫氧还蛋白(Trx)用作阴性对照。.
具体实施例方式
实施例一 猪链球菌2型表面蛋白SSU98一1675的表达纯化及抗体制备 1.材料和方法 1.1菌株和质粒
猪链球菌2型98HAH12株[Chen C， Tang J， Dong W， Wang C， Feng Y， et al (2007) A Glimpse of Streptococcal Toxic Shock Syndrome from Comparative Genomics of S.suis 2 Chinese Isolates, PLoS ONE 2(3): e315];大肠杆菌DH5a， BL21，均为国际标准株；表达载体pET32a(+)为Novagen公司产品。 1.2酶和试剂
EcoRI和XhoI等限制性内切酶以及Taq酶、dNTPs 、 DL15000^^St示准等 PCR所用试剂均为宝生物工程(大连)有限公司产品；DNA回收试剂盒为天 为公司产品；镍亲和层析柱为GE公司产品；质粒提取盒为V-gene公司产品； 弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂为Sigma公司产品；Amp为中诺药业产品。 1.3 PCR引物设计及SSU98—1675核酸序列，蛋白序列根据所要扩增的片段，设计一对引物，引物两端分别添加EcoRI和XhoI 酶切位点和保护性碱基，引物P1和P2可扩增猪链球菌2型SSU98—1675基因 开放阅读框(ORF)全长片断。引物序列分别为
上游引物P1: 5 '-gcggatccaatagcaagattttttcgttgag-3，见序列表中序列3;
下游引物P2: 5 、gcctcgagctcactttctgttatctttttc-3，见序列表中序列4。
核酸序列>SSU98J675见序列表中序列2，氨基酸序列〉SSU98—1675 见序列表中序列l。
1.4 PCR扩增
按下列顺序和条件依次加入各反应物并进行PCR扩增。猪链球菌2型模 板DNA2pL， 10Xbuffer5uL， 2,5 mmol/L dNTPs 3 P L，弓l物Pl禾口P2(5u mol/L)各luL，ddH20 37uL，LA-7^酶(5U/uL)luL 。扩增的条件为:94 。C7min; 94。Clmin， 55。Clmin， 72。C2min， 30个循环;72 。C7min。
1.5 PCR产物的回收和酶切
PCR产物在1°/。琼脂糖凝胶电泳，后以DNA回收试剂盒回收目的片段， 并以BamHI和XhoI 37t酶切3h。 1.6重组质粒的构建和鉴定
在含有100ug/mLAmp的LB肉汤中接种携带pET32a空质粒的DH5 a 大肠杆菌单菌落，37'C摇振培养12 16h后，P/。转接入100ug/mLAmp的 新鲜LB肉汤37"C摇振培养6h，以质粒抽提试剂盒抽提质粒。BamHI和XhoI 双酶切后，以DNA回收试剂盒回收酶切产物。将PCR双酶切回收产物与空质 粒双酶切回收产物进行连接，并转化感受态的DH5a宿主菌。感受态细菌的 制备、转化均按常规方法进行，利用菌落PCR和限制性内切酶酶切进行重组 菌的筛选和鉴定。1.7重组质粒的测序和序列分析
重组质粒的序列测定采用Sanger双脱氧末端终止法，由北京三博远志生 物技术有限公司完成，以验证其阅读框架，并以BLAST软件进行同源性分析。 1.8重组质粒在大肠杆菌中的表达和纯化
将重组质粒按常规方法转化感受态的大肠杆菌BL21，利用Amp抗性筛 选重组菌，挑单菌落接种LB肉汤中(含100ug/mLAmp)， 3(TC剧烈摇振培养 2 4h，当菌液浓度OD6oo达0.5 0.6时，加IPTG至终浓度lmmol/L， 30'C继 续剧烈摇振培养2 4h。 6000r/min离心10min ，沉淀以蒸馏水重悬，加等体 积的2X电泳上样缓冲液煮沸10min， SDS-PAGE检测。含空pET32a(+)的大肠 杆菌BL21亦同样经IPTG诱导处理后，SDS-PAGE检测表达情况。以超声波破 碎诱导的重组菌，收集上清，以GE镍亲和层析柱进行亲和层析，具体步骤按 使用说明书进行。 1.9重组蛋白动物免疫试验
将收集的蛋白以PH7.2 10mmol/L的PBS稀释至0.1mg/ml，加入等量的弗氏 完全佐剂，皮下免疫Wistar大鼠(购自军事医学科学院试验动物中心)，0.5m1/ 只；以后3 — 5周，分别以0.2， 0.4， 0.8， 1.6mg/ml加弗氏不完全佐剂加强免疫， 第7周断尾取血ELISA法测抗体效价。同时设立全菌免疫对照组和空白对照组 (pET32a空质粒转化BL21，诱导表达Trx蛋白，以此蛋白免疫大鼠为空白对 照)。以硫酸铵沉淀法制备抗血清。 2.结果 2.1 PCR结果
PCR产物经电泳后，出现一条约2178bp的条带，大小与预期一致。 2.2重组质粒的鉴定SSU98—1675基因片段经回收，以BamHI和Xho I酶切位点定向克隆至 pET-32a中，获得重组质粒，命名为SSU98一1675-pET-32a。重组质粒转化感受 态的DH5a宿主菌，经Amp抗性筛选得到重组菌。提取重组质粒，经EcoR I和XhoI双酶切，可切出约2178bp左右的片断，说明SSU98—1675片段己成
功克隆。
2.3重组质粒的表达
重组BL21转化菌经IPTG诱导后，菌体SDS-PAGE显示有一条97kD的 蛋白带，而含诱导前的菌在该处无特异条带。经镍柱纯化获得纯化的 SSU98J675蛋白。见图l。 2.4测序结果和序列分析
克隆的序列长度经测序为2178bp，如序列表中序列2所示，翻译后为725 个氨基酸残基，见序列表中序列l。
实施例二猪链球菌2型表面蛋白SSU98一1675的免疫原性 及抗体介导的调理吞噬试验 1.材料方法材料同实施例一。
1.1重组猪链球菌2型表面蛋白SSU98J675和多抗的制备见实施例一。 1.2 SSU98一1675抗体介导的调理吞噬
血平板刮取猪链球菌2型单菌落，接入THB培养基，37°C， C02孵箱培养 8h后转接新鲜THB培养基培养8h至对数生长期。取lml菌液(约l X 108CFU/ml) 13，000rpm， lmin集菌，PBS洗菌并重悬，调整至l()6CFU/ml，涂血平板，记 为初始菌量。取50[xl (&106CFU/ml)菌液加入10(Hil抗体，37。Cl5min后冰上 15min;加入350jxl健康人全血37。C ， 3h;加入55pl 1 % saponin,冰上20min;反复吹打后稀释涂血平板，16h后血平板记数单克隆。 1.3感染猪与人中SSU98一1675蛋白特异抗体测定
采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定病人和感染动物中针对该蛋白的 特异抗体，采用健康人的血清和感染前的动物血清作为对照。采用5pg/ml的 重组蛋白包被酶联板，包被缓冲液为0.05 M NaHC03 (PH 9.6) , 4°C包被过 夜，然后采用3% BSA 37 。C封闭3 h。病人和健康人血清样品1:500稀释， 感染前后猪血清均1:200稀释，反应信号通过辣根过氧化物酶(HRP)标记 的二抗进行检测。 2.结果
2.1重组蛋白抗体介导的调理吞噬作用
经GE镍亲和层析柱层析获得纯化的重组蛋白SSU98—1675,分别加弗氏完 全和不完全佐剂免疫后，制备抗血清，进行间接杀菌试验。杀菌率计算
(CFUrTrx—CFUr98—1675) /CFUrTrx。 Trx为从含pET32a (+)空载体的大肠杆 菌BL21镍柱纯化的硫氧还蛋白。
抗体介导的调理吞噬试验分别用SSU98一1675重组蛋白；MRP重组蛋白 免疫大鼠后的大鼠血清调理健康人血，进行人全血对猪链球菌2型活菌的杀伤 试验。SSU98J675重组蛋白的抗血清调理人全血对猪链球菌2型的杀伤率为 50%左右，但略低于MRP蛋白的抗血清，MRP蛋白的抗血清调理人全血对猪 链球菌2型的杀伤率为90%。
2.2感染的人和猪血清中SSU98J675特异抗体检测
本发明检测了 6名猪链球菌2型感染的病人和5名健康人血清中 SSU98—1675特异抗体的存在状况，结果发现与健康人相比，病人SSU98—1675 特异抗体水平明显升高，见图.2A。我们检测了猪链球菌2型感染猪前后血清中SSU98一1675特异抗体的存在状况，结果发现与感染前相比，感染后血清 中SSU98_1675特异抗体水平显著升高，见图2B。上述实验结果表明 SSU98—1675可作为诊断耙标用于猪链球菌2型感染的血清学诊断。<110>
<120>
<130>
<160>
<170>
<210〉 <211〉 <212〉 <213>
猪链2型表面蛋白1675.SEQ 序歹U 表
中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种猪链球菌2型表面蛋白、其制备方法及用途
4
Patentln version 3. 2 1
725 PRT
<400> 1
Met Asn Ser Lys lie Phe Ser Leu Arg Lys Ser Lys Met Gly Leu Val 15 10 15
Ser Val Ala lie Ala Phe Leu Trp lie Gly Thr Gly Met Asn Met Glu 20 25 30
Thr Ala Met Ala Glu Glu Thr Asp Ala Thr Ala Uu Glu Thr Gin Leu 35 40 45
Glu Ser Thr Glu Ser Ser Leu Thr Asn Thr Val Ser Glu Asn Ala Glu 50 55 60
Ala Glu Glu Val Ala Asp Glu Val Pro Ser Glu Glu Lys Lys Ser Glu 65 70 75 80
Glu Met Glu Asp Met Glu Glu Glu Leu Ser Phe lie Glu Asn His Leu 85 90 95
Glu Val Ala Pro lie Gin Ala Gly Asp Gin Thr lie Ser Gly Asn Thr 100 105 110
Thr Pro Gly Gly Tyr Val Ala lie Thr lie Asp Gly Glu Ala lie Thr 115 120 125
Ser lie Glu Asn lie Leu Glu Ala Asp Asp Lys Gly Asp Phe Ser Tyr 130 135 140
Arg Leu Ser Pro Leu Ala His Ser Gin Thr Val Glu lie Ser Ala 145 150 155 160
Leu Pro Lys Gin Phe Trp Thr Leu Glu Ala Asp Ser Glu Glu Arg Lys 165 170 175
Val Val Val Arg Thr Asn Arg His Pro Glu Ala Tyr Glu lie Pro Ala 180 185 190
Lys Arg Leu Glu Lys Thr Ser Asn Gly Met His Gin Val Phe lie Glu猪链2型表面蛋白1675.SEQ
195
200 205
Pro Val Phe Glu His Thr Ser Lys Val lie Gly His Thr Ser Val Lys
210
215 220
Gly Ser Val Tyr Leu Ser lie Asn Gly Ser Phe Val Ser Asp Lys Thr
225 230
235 240
Leu lie Asp Pro Lys Asp Gly Arg Phe Glu Val Thr Phe Ser Glu Ser
245
250 255
Leu Ala Gly Ser Lys Phe Lys Ala Asp Asp Arg Leu Val Leu Ser Phe
260
265 270
Val Ser Glu Asp Gly Gin Pro Val lie Thr Asn Thr lie Val Lys Pro
275
280 285
Leu Val Lys Glu Lys Val Ser Ser Gin Met Thr Val Lys Pro Leu Ser
290
295 300
Ser Ala Thr Ser Val Leu Glu Gly Thr Thr Phe Pro Leu Gly Arg Val
305 310
315 320
His Leu Tyr Asn Ala Asp Thr Ser Glu Phe lie Met Glu Ala lie Ala
325
330 335
Asp Glu Thr Gly His Tyr Lys lie Ala Leu Pro Ala Leu Gin Ser Glu
340
345 350
Asp Lys Tyr Tyr Arg Leu Thr His Asn Gin Gin Glu Asp Leu Val Ser
355
360 365
Val His Leu Asp Thr Val Asp Gly Ser Ser lie Leu Leu Asp Lys Ser
370
375 380
Val Met Ala Ser Leu Ala Thr Tyr Leu Gin Asp Ala Asp Met Asp Glu 385 390 395 400
Ala Thr Asp Glu Asp Pro lie lie Val Pro Lys Leu His Asn Lys Lys 405 410 415
Asp Tyr lie Val Gly Arg Thr lie His Leu Asn Ala Tyr Val Arg Met 420 425 430
Val Ser Ser lie Lys Gly Lys Gin Tyr Pro Pro Val Gin Val Asp Glu 435 440 445
Leu Gly Phe Phe Gly Phe Gin lie Gin Asp Leu Gin Uu Pro Phe Glu
450
455 460
Lys Gly Glu Arg lie Arg Phe Glu lie lie Asp Pro Val Thr Asn Asn465
470
猪链2型表面蛋白1675.SEQ 475 480
lie lie Ala Ser Lys Glu Glu Val Val Gly Gin Tyr Leu Glu Asp Glu
485
490 495
Asp Val Met Asp Leu Pro Phe Gin Val Glu Lys Val Thr Thr Asp His 500 505 510
Gly Tyr lie Ser Gly Lys Thr Ala Pro Asp Val Met lie Glu Leu Val 515 520 525
Ser Thr Gin Asn Gly Glu Glu lie lie Gly Lys Thr Ser Thr Asp Ser 530 535 540
Thr Gly Arg Phe Glu Phe Asp Leu Gly Ser Arg Val Leu Lys Asn Gly 545 550 555 560
Glu Thr Leu Ser Phe Arg Ala Phe Asp Lys Glu Gly Glu Gin Val Ala
565
570 575
Trp Glu Val Val Thr Val Gin Lys Gly Asn Gly His Arg lie Asn Lys 580 585 590
Pro Asp Lys I>ys Asp Glu Lys Glu Glu Gin Pro Ser Lys Glu lie Thr 595 600 605
Lys Asn lie Glu Gin Ser Asn Thr Leu Glu Gin Thr Thr Leu Pro Pro 610 615 620
Val Arg Gin Thr Leu Thr Asp Lys Lys Val Glu Gin Asn Ala Glu Pro
625
630
635 640
Ser Lys Glu Glu Thr Val Ser lie Phe Asp Asp Ser Lys Lys Asp Met
645
650 655
Pro Thr Lys Gin Glu Lys Met Ala Arg Thr Val Arg Asp Lys Gly Thr 660 665 670
Lys Gly Asn Val Ser Val His Asp Ser Gly Glu Asn Thr Gin Val Gin 675 680 685
Ser Leu Pro Lys Thr Gly Glu Lys Thr Ser Leu Val Ala Asn lie Met 690 695 700
Leu Ser lie lie Leu Phe Leu Phe Ala Leu Phe lie Gly Lys Lys Lys 705 710 715 720
lie Thr Glu Ser Glu 725
<210〉 2猪链2型表面蛋白1675.SEQ
<211> 2178 <212> 腿 <213〉
<400> 2
atg犯tagcaagattttttcagta卿tgggtttagtttcggtggcaatt60
gcttttctatggattggtacagggatgaatatggaaaccgcaatggctgagg柳ctgeic120
gctacagctcttgaaactcaattagaaagcacggaatcatcgcttaccaatacagtttcg180
gaaaatgctg卿ctgaggaagtggctgatgaggtaccgagtgaagaaaaaaeL3tcgg犯240
g卿tggaggagaactttcatttattgaaaaccatctagaggttgctccg300
attcaagctggagatcaaaccatctcagggaataccactcctggtggatatgtagcgatt360
acgatagatgggg卿c犯ttacttctatttg3t犯ggga420
gatttttcttatcggttgagtaaaccacttgctcacagccaaactgtggaaattagtgct■
ttgccgaaacagttttggactctagaggcagattctgaagagcgtaaggtagtagtgagg540
actaatcgacatccagaggcttatgaaattcc8gcaa犯agattagaaaaaacatctaat600
gg犯tgcatcaagtgttcatcgaaccagtttttgaacatacgagcaaagttattggtcat660
acctctgtcaaaggttcagtctatctatcaataaatggtagttttgtctctgataagaca720
ctaattgatcctaaagatggacggtttgaggttactttttccgagagtttagcaggttca780
cagatgatagattggttttgtcttttgtatc卿agatggtcagccggtg840
attactaatactattgtaaaaccattggtaa犯gaaaaagtatcttcacaaatgacagta900
aaacctttatcaagtgcgacttcagttttggaaggaactacatttcctttaggtcgtgtg960
catctatacaatgctgatacttcagagtttatcatggaagctattgctgatgagacaggt1020
cactataagattgctttgcctgccctacaatccgaggataagtactacagattgactcac1080
aatcaacaagaggacttggtatctgtccatcttgatacagttgatggttcaagtatatta1140
ttggataaatctgttatggcatctttagcaacttatttacaagatgcagatatggatgaa1200
gcgac卿tgaagatcctatcattgtacctaaactgcatattatattgtc1260
ggtcgaacgatacatcttaatgcctacgttcgcatggtttcgtcaatcaaaggaaaacag1320
tatcctccagttcaagtggacgaattaggattttttggtttccaaattcaag3tttac肪1380
ttgccttttgaaaaaggtgagagaattcgctttggiaatcattgacccggttacaaataat1440
atcatcgctagt卿ga卿agttgtagggcaatatttgg幼gatgaagacgtgatggat1500
ttaccatttcagtcactacagatcatggttacatcagtggcaaaacagct1560
ccagatgtaatga/ttgaactagtatcaactcagaatggcgaggagateiEittggtaaaact1620
tcaactgattcaacaggtcgattcgaatttgatttgggtagtcgtgttttaaaaaatgga1680
gaaaccttatcgtttagagcgtttgataaag卿gtg肌caggtagcttgggaagtcgta1740
acggttcaaaaagga^3tggtcaccgcattaataaaccagataaaaaggacgagaaggaa1800
gagcaacctagc幼agaaatt ac c aaaaatatcgaacaatc aaac ac ac ttgageaaact1860
actttgccacctgtacgccaaacgctgacttagagcaaaatgeagageca1920猪链2型表面蛋白1675.SEQ
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权利要求
1.一种猪链球菌2型表面蛋白，其特征在于具有序列表中序列1的氨基酸序列。
2. 根据权利要求l的猪链球菌2型表面蛋白，其编码基因具有序列表中 序列2的核苷酸序列。
3. —种表达猪链球菌2型表面蛋白的重组表达质粒，其特征在于含有序列表中序列2的核苷酸序列。
4. 根据权利要求3所述的重组表达质粒，其中表达质粒为大肠杆菌表达 质粒pET32a。
5. —种表达猪链球菌2型表面蛋白的菌株，其特征在于含有权利要求3 所述重组表达质粒。
6. 根据权利要求5所述菌株，其中表达菌株为大肠杆菌BL21。
7. 权利要求1或2所述猪链球菌2型表面蛋白的制备方法，包括如下步骤(1) 克隆该表面蛋白基因；(2) 将基因与大肠杆菌表达质粒相连接，转化大肠杆菌；(3) 诱导表达；(4) 对表达产物进行分离纯化。
8. 根据权利要求7所述方法，其中大肠杆菌表达质粒为pET32a，大肠杆 菌为co//BL21。
9. 权利要求1或2所述的猪链球菌2型表面蛋白在制备猪链球菌2型感 染诊断试剂中的应用。
10. 权利要求1或2所述的猪链球菌2型表面蛋白在制备猪链球菌2型疫 苗中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种猪链球菌2型表面蛋白，还公开了该蛋白质的制备方法及用途。本发明的猪链球菌2型表面蛋白在genebank中的编号为gi|146321522，其制备方法包括克隆该表面蛋白基因；将基因与大肠杆菌表达质粒相连接，转化大肠杆菌；诱导表达；对表达产物进行分离纯化等步骤。本发明的表面蛋白可用作诊断靶标，在猪链球菌感染的动物和人可检测到该蛋白特异的抗体，同时又是重要的保护性抗原，可用于制备疫苗。
文档编号C07K14/315GK101613399SQ200810115510
公开日2009年12月30日 申请日期2008年6月25日 优先权日2008年6月25日
发明者姜永强, 研 尉, 炜 张, 李文君, 华 江, 耿红冉, 媛 袁, 郑玉玲 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所