表面展示gpi-ny-eso-1融合蛋白的细胞膜脂质及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种表面展示GPI-NY-ESO-1融合蛋白的细胞膜脂质及其应用。本发明首先保护表面展示GPI-NY-ESO-1融合蛋白的细胞膜脂质；所述GPI-NY-ESO-1融合蛋白自上游至下游依次包括如下元件：NY-ESO-1多肽和GPI片段；NY-ESO-1多肽如序列5自N末端第2-26位氨基酸残基所示；GPI片段如序列5自N末端第445-478位氨基酸残基所示。本发明还保护具有氧化型甘露聚糖修饰的表面展示GPI-NY-ESO-1融合蛋白的细胞膜脂质。“表面展示GPI-NY-ESO-1融合蛋白的细胞膜脂质”或“具有氧化型甘露聚糖修饰的GPI-NY-ESO-1融合蛋白的细胞膜脂质”与DC细胞共同作用，可以显著提高人T淋巴细胞的增殖能力。本发明对于肿瘤治疗具有重大价值。
【专利说明】表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质及其应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤已成为21世纪严重威胁人类健康的重大疾病，患者免疫系统对肿瘤的耐受 是肿瘤发生、发展的重要原因。树突状细胞（dendrtic cell DC)是人体内功能最强大的抗 原提呈细胞（APC)，它能够调节机体免疫反应，启动细胞毒性T细胞对肿瘤细胞的特异性杀 伤作用。由于DC细胞自身具有免疫刺激能力，是目前发现的惟一能激活未致敏初始型T细 胞的APC，DC不仅能够以抗原特异的形式启动T细胞，识别和杀伤肿瘤细胞，而且还可以激 发免疫记忆保护，在宿主再次受到肿瘤细胞攻击时发挥保护作用。DC与肿瘤的发生、发展有 密切关系，自20世纪90年代首次报道DC疫苗用于治疗B细胞淋巴瘤以来，多向临床试验 结果显示DC细胞在肿瘤的治疗中已取得显著疗效，能有效逆转肿瘤病人的免疫耐受状态， 诱导肿瘤特异性免疫反应。
[0003] 虽然DC有如此强大的免疫监视功能，但由于肿瘤细胞相关的一些因素致使DC不 能有效提呈肿瘤细胞，故肿瘤细胞逃避免疫系统的监控。肿瘤免疫逃逸的机制有：①肿瘤细 胞的免疫原性弱；②肿瘤细胞的漏逸；③肿瘤细胞MHC I类分子表达低下或缺失，缺乏协同 刺激分子；④肿瘤细胞分泌免疫抑制因子。根据肿瘤细胞免疫逃逸机制，研究者提出用肿瘤 细胞抗原致敏DC，再将致敏的DC回输，以此免疫荷瘤宿主，诱导出特异性抗肿瘤免疫应答， 这是继化疗、放疗之后，治疗肿瘤的又一突破性的方法。基于DC在细胞免疫中的重要地位， 以DC为基础的肿瘤疫苗成为当今肿瘤生物治疗领域研究的热点。随着免疫学、分子生物学 的发展及实验方法与技术的改进，DC疫苗必定在肿瘤治疗方面起到中流砥柱的作用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质及其应 用。
[0005] 本发明首先保护表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质；所述 GPI-NY-ES0-1融合蛋白自上游至下游依次包括如下元件：NY-ES0-1多肽和GPI片段；所述 NY-ES0-1多肽如序列表的序列5自N末端第2-26位氨基酸残基所示；所述GPI片段如序 列表的序列5自N末端第445-478位氨基酸残基所示。
[0006] 所述GPI-NY-ES0-1融合蛋白自上游至下游依次包括如下元件：所述NY-ES0-1多 肽、IgGFc片段和所述GPI片段；所述IgGFc片段如序列表的序列5自N末端第29-444位 氨基酸残基所示。所述GPI-NY-ES0-1融合蛋白优选为序列表的序列5所示的蛋白质。
[0007] 所述"表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质"为表达所述GPI-NY-ES0-1 融合蛋白的细胞的细胞膜脂质。所述"表达所述GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞"为SW480 细胞或SGC-7901细胞。
[0008] 所述"表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质"的制备方法包括如下步 骤：（1)将含有所述GPI-NY-ES0-1融合蛋白的编码基因的重组质粒导入离体的哺乳动物细 胞，得到重组细胞；（2)提取所述重组细胞的细胞膜脂质。
[0009] 所述步骤（1)中，所述重组质粒为在质粒pCI-neo的EcoRV和Notl酶切位点之间 插入了序列表的序列4所示的双链DNA分子得到的重组质粒。所述步骤（1)中，所述离体 的哺乳动物细胞具体可为SW480细胞或SGC-7901细胞。
[0010] 所述步骤（2)中，"提取所述重组细胞的细胞膜脂质"的方法包括如下步骤：①取 所述重组细胞，裂解细胞，1800-2200g (优选2000g)离心(离心时间具体可为lOmin)，取 上清液；②取步骤①得到的上清液，20000-24000g (优选22000g)离心(离心时间具体可 为30min)，取沉淀；③取步骤②得到的沉淀，先用溶液I洗涤，然后用溶液II溶解并振荡， 然后1800-2200g (优选2000g)离心（离心时间具体可为lOmin)，取上清液；溶液I :含 0· 1-0. 2mol/L (优选 0· 15mol/L) NaCl 和 5_15mmol/L (优选 10mmol/L) Tris 的水溶液， pH7-9 (优选 ρΗ8· 0);溶液 II :含 0· 1-0. 2mol/L (优选 0· 14mol/L) NaCl 和 l-3g/100mL (优 选 2g/100mL)l-S_0ctyl Beta-D-thioglucopyranoside 的 pH7_8(优选 ρΗ7· 4)、20_30mmol/ L (优选 25mmol/L)的 Tris-HCl 缓冲液。
[0011] 所述步骤（2)中，可包括如下步骤④：将步骤③得到的上清液装入透析袋进行透 析，然后取透析袋中的液相，即为含表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质的溶 液。进行所述透析采用的透析液为：含〇. 1-0. 2mol/L (优选0. 14mol/L)NaCl的pH7-8 (优 选 pH7. 4)、20-30mmol/L (优选 25mmol/L)的 Tris-HCl 缓冲液。
[0012] 所述步骤①中，裂解细胞的方法具体如下：在低渗溶液中2-6°C (优选4°C)、 200-300rpm (优选250rpm)振荡36-60h (优选48h)。所述低渗溶液的溶剂为pH7-8 (优选 pH7. 4)、20-30mmol/L (优选 25mmol/L)的 Tris-HCl 缓冲液，溶质及其浓度如下：0· 5-1. 5mM (优选 lmM)PMSF、0.5-1.5mM (优选 lmM)EDTA、4_6yg/ml (优选 5yg/ml)Aprotinin、 4_6μ g/ml (优选 5μ g/ml) Leupeptin、0· 5%_1· 5% (优选 1% ;体积比）Triton X-100， 0· 5-1. 5g/100mL(优选 lg/100mL)Sodium deoxycholate(脱氧胆酸纳)和 0· 05-0. 15g/100mL (优选 〇· lg/l〇〇mL) SDS。
[0013] 所述步骤③中，所述振荡的条件具体可为：2-6°C (优选4°C)、100_200 (优选 150rpm)、20-40min (优选 30min)。
[0014] 本发明还保护具有氧化型甘露聚糖修饰的表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细 胞膜脂质。
[0015] 所述"具有氧化型甘露聚糖修饰的表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂 质"的制备方法包括如下步骤：取以上任一所述的"含GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂 质"，与氧化型甘露聚糖反应，得到具有氧化型甘露聚糖修饰的表面展示GPI-NY-ES0-1融合 蛋白的细胞I吴脂质。
[0016] 所述"具有氧化型甘露聚糖修饰的表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂 质"的制备方法具体包括如下步骤：取lmL含表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂 质的溶液，加入〇. 5-1.5mL (优选lmL)含10-20mg/ml (优选14mg/ml)氧化型甘露聚糖的 口!17-8(优选口!17.4)、0.005-0.015111〇1/1(优选0.01111〇1/1)?85缓冲液，混合，15-251：(优 选20°C)、8000-12000rpm (优选lOOOOrpm)振荡8-16小时(优选12小时)，得到含具有氧化 型甘露聚糖修饰的表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质的溶液。
[0017] 所述氧化型甘露聚糖的制备方法包括如下步骤：（I )将甘露聚糖溶于含 0· 1-0. 2mol/L (优选 0· 15mol/L)氯化钠的 PH7-8 (优选 ρΗ7· 4)、0· 005-0. 015mol/L (优选 0· 01m〇l/L)PBS缓冲液，使甘露聚糖的浓度为10-18mg/ml (优选14mg/ml); (II)称取4-6mg (优选5mg)高碘酸钠，倒入2-3ml(优选2. 5ml)步骤（I )得到的溶液，室温反应50-70min (优 选6〇11^11);(111)完成步骤（11)后，加入2〇-3(^1(优选25以1)乙二醇，室温反应2〇-4〇1^11 (优选30min); (IV)完成步骤(III)后，将溶液上样于S印hadeX-G25葡聚糖凝胶柱(柱容量为 l〇ml，装有 5mlS印hadex-G25 葡聚糖凝胶)，用 pH7-8 (优选 ρΗ7· 4)、0· 005-0. 015mol/L (优 选0. Olmol/L) PBS缓冲液进行洗脱，收集保留体积为3-7. 5ml的过柱后溶液，冻干，即为氧 化型甘露聚糖。
[0018] 所述甘露聚糖具体可为分子量为80KD的甘露聚糖。
[0019] 本发明还保护一种促进T淋巴细胞分泌细胞因子和/或促进T淋巴细胞增殖的试 剂盒，包括以上任一所述的"表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质"或以上任一 所述的"具有氧化型甘露聚糖修饰的GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质"。所述试剂盒 还可包括离体的DC细胞。
[0020] 糖基化磷脂酰肌醇（GPI)是对蛋白质进行翻译后修饰的一种脂性结构，蛋白质可 通过GPI结构锚定于细胞膜表面，而不跨越其磷脂膜双层结构。本发明采用糖基化磷脂酰 肌醇（GPI)修饰肿瘤抗原肽，以GPI锚定蛋白的形式表达于细胞膜表面，有利于在细胞膜形 成脂质体时，自发整合到脂质体中，使所得到的脂质体含有所需要的肿瘤抗原肽。本发明 提供的"表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质"或"具有氧化型甘露聚糖修饰的 GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质"与DC细胞共同作用，可以显著提高人T淋巴细胞 分泌细胞因子的能力。所述细胞因子为IFN-γ和/或TNF-α。本发明提供的"表面展示 GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质"或"具有氧化型甘露聚糖修饰的GPI-NY-ES0-1融合 蛋白的细胞膜脂质"与DC细胞共同作用，可以显著提高人T淋巴细胞的增殖能力。本发明 对于肿瘤治疗具有重大价值。
【具体实施方式】
[0021] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0022] 蛋白酶抑制剂：购自Roche公司，产品目录号为4693116001。Aprotinin :购 自 Sigma 公司，货号为 A1153。Leupeptin:购自 Sigma 公司，货号为 L-2884。l-S-Octyl Beta-D-thioglucopyranoside (辛基-beta-D-硫代批喃葡萄糖苷）：购自 ACROS ORGANICS 公司，产品目录号为315000025。质粒pCI-neo:Invitrogen公司。SW480细胞(人结肠癌细 胞株SW480):中国科学院上海细胞库。SGC-7901细胞（HLA-A2表型阴性的人胃癌细胞株）： 中国科学院上海细胞库。甘露聚糖(分子量为80KD):购自Sigma公司。S印hadex-G25葡聚 糖凝胶：购自Amersham公司。高碘酸钠：购自Sigma公司。⑶40抗体：购自美国Biolegend 公司。NY-ES0-1:购自上海吉尔生化有限公司。
[0023] NY-ES0-1为肿瘤抗原分子，为序列表的序列1自N末端第2至26位氨基酸残基 组成的多肽，其编码基因如序列表的序列2自5'末端第4至78位核苷酸所示。人外周血 树突状细胞(简称人DC细胞）：参考文献：人外周血树突状细胞MicroRNA表达谱的鉴定与 分析，细胞与分子免疫学杂志，2012, 28 (4):415-417.。人外周血T淋巴细胞（简称人T淋 巴细胞）：参考文献：人外周血T淋巴细胞表型改变与衰老相关性研究，中国病理生理杂志， 2003, 19 (8) :1025-1028.。
[0024] 实施例1、表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质的制备
[0025] 一、重组质粒和重组细胞的构建
[0026] 1、将序列表的序列3所示的双链DNA分子（IgGFc-GPI片段，1374bp)插入质粒 pCI-neo的Nhel和Notl酶切位点之间，得到重组质粒pCI-pr-GPI。
[0027] 2、将序列表的序列2所示的双链DNA分子插入重组质粒pCI-pr-GPI的EcoRV 和Nhel酶切位点之间，得到重组质粒pCI-pr-GPI/NY-ES〇-l。根据测序结果，对重组质粒 pCI-pr-GPI/NY-ES〇-l进行结构描述如下：在质粒pCI-neo的EcoRV和Notl酶切位点之间 插入了序列表的序列4所示的双链DNA分子。序列表的序列4所示的双链DNA分子编码序 列表的序列5所示的蛋白质。序列表的序列5所示的蛋白质即为GPI-NY-ES0-1融合蛋白。
[0028] 序列表的序列4中，自5'末端第1-3位核苷酸为起始密码子、第4-78位核苷酸编 码NY-ES0-1多肽、第85-1332位核苷酸编码IgGFc片段、第1333-1434位核苷酸编码GPI 片段、第1435-1437位核苷酸为终止密码子。
[0029] 序列表的序列5中，自N末端第2-26位氨基酸残基为NY-ES0-1多肽、第29-444 位氨基酸残基为IgGFc片段、第445-478位氨基酸残基为GPI片段。
[0030] 3、将重组质粒pCI-pr-GPI/NY-ES〇-l转染SW480细胞，得到重组细胞甲。
[0031] 4、将重组质粒pCI-pr-GPI/NY-ES〇-l转染SGC-7901细胞，得到重组细胞乙。
[0032] 二、表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质的制备
[0033] 1、取108个重组细胞(重组细胞甲或重组细胞乙)，在低渗溶液中4°C、250rpm振荡 48h以裂解细胞，然后2000g离心10min，取上清液。
[0034] 低渗溶液：溶剂为pH7. 4、25mmol/L的Tris-HCl缓冲液；溶质及其浓度如下：lmM PMSF、lmM EDTA、5yg/ml Aprotinin、5yg/ml Leupeptin、l% (体积 I：匕）Triton X-100， lg/lOOmL Sodium deoxycholate (脱氧胆酸钠）和 0.1g/100mL SDS。
[0035] 2、取步骤1得到的上清液，22000g离心30min，取沉淀。
[0036] 3、取步骤2得到的沉淀，先用溶液I (含0. 15mol/L NaCl和10mmol/L Tris的 水溶液，PH8.0)洗涤两次，然后用溶液II (含0· 14mol/L NaCl和2g/100mLl-S-0ctyl Beta-D-thioglucopyranoside 的 ρΗ7· 4、25mmol/L 的 Tris-HCl 缓冲液)溶解并 4°C、150rpm 振荡30min，2000g离心10min，取上清液。
[0037] 4、取步骤3得到的上清液，装入透析袋，置于透析液(含0. 14mol/L NaCl的pH7. 4、 25mmol/L的Tris-HCL缓冲液）中透析12小时，每3小时更换新的透析液，然后收集透析袋 中的液相，即为含表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质的溶液。
[0038] 将重组细胞甲进行上述步骤得到的含表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜 脂质的溶液命名为溶液甲-I。
[0039] 将重组细胞乙进行上述步骤得到的含表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜 脂质的溶液命名为溶液乙-I。
[0040] 三、具有氧化型甘露聚糖修饰的表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质 的制备
[0041] 1、制备氧化型甘露聚糖
[0042] (1)将甘露聚糖溶于含0· 15mol/L氯化钠的ρΗ7· 4、0· 01mol/L PBS缓冲液，使甘露 聚糖的浓度为14mg/ml。
[0043] (2)称取5mg高碘酸钠于烧杯中，迅速倒入2. 5ml步骤（1)得到的溶液，室温反应 60min〇
[0044] (3)完成步骤（2)后，加入25 μ 1乙二醇，室温反应30min。
[0045] (4)完成步骤（3)后，将溶液上样于S印hadex-G25葡聚糖凝胶柱(柱容量为10ml， 装有5mlS印hadex-G25葡聚糖凝胶)，用ρΗ7· 4、0· Olmol/L PBS缓冲液进行洗脱，收集保留 体积为3-7. 5ml的过柱后溶液，冻干，即为氧化型甘露聚糖。
[0046] 2、具有氧化型甘露聚糖修饰的表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质的 制备
[0047] (1)取lmL溶液甲-1，加入lmL含14mg/ml氧化型甘露聚糖的pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液，混合，20°C、lOOOOrpm振荡12小时，得到溶液甲-II。
[0048] (2)取lmL溶液乙-1，加入lmL含14mg/ml氧化型甘露聚糖的ρΗ7· 4、0· 01mol/L PBS缓冲液，混合，20°C、lOOOOrpm振荡12小时，得到溶液乙-II。
[0049] 实施例2、表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质和具有氧化型甘露聚糖 修饰的表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质的应用
[0050] 培养基甲-I :含30% (体积比）溶液甲-I的无血清RPMI-1640培养液。
[0051] 培养基甲-II :含30% (体积比）溶液甲-II的无血清RPMI-1640培养液。
[0052] 培养基乙-I :含30% (体积比）溶液乙-I的无血清RPMI-1640培养液。
[0053] 培养基乙-II :含30% (体积比）溶液乙-II的无血清RPMI-1640培养液。
[0054] 培养基丙(对照培养基）：无血清RPMI-1640培养液。
[0055] 培养基丁 (对照培养基）：含50 μ g/ml NY-ES0-1多肽和5 μ Ι/ml脂质体2000 (Invitrogen公司，产品货号11668-019)的无血清RPMI-1640培养液。
[0056] -、含GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质与DC细胞促进人T淋巴细胞分泌细 胞因子
[0057] 1、取若干24孔板，每孔加入0. 5ml人T淋巴细胞的细胞悬液(用含10%体积比FBS 的RPMI-1640培养液悬浮，含1 X 104个人淋巴细胞)，置于37°C、5%C02细胞培养箱中静置培 养24小时。
[0058] 2、完成步骤1后，取24孔板，将孔分成若干组，每组6个孔，分别处理如下：
[0059] 第一组：每孔加入0.5ml人DC细胞的细胞悬液(用培养基甲-I悬浮，含IX 105个 人DC细胞）；
[0060] 第二组：每孔加入0. 5ml人DC细胞的细胞悬液(用培养基甲-II悬浮，含IX 105个 人DC细胞）；
[0061] 第三组：每孔加入0.5ml人DC细胞的细胞悬液(用培养基乙-I悬浮，含1X105个 人DC细胞）；
[0062] 第四组：每孔加入0. 5ml人DC细胞的细胞悬液(用培养基乙-II悬浮，含1 X 105个 人DC细胞）；
[0063] 第五组：每孔加入0.5ml人DC细胞的细胞悬液(用培养基丙悬浮，含IX 105个人 DC细胞）；
[0064] 第六组：每孔加入0.5ml人DC细胞的细胞悬液(用培养基丁悬浮，含IX 105个人 DC细胞）；
[0065] 将24孔板置于37°C、5%C02细胞培养箱中静置培养。培养48小时时收集上清液，采 用ELISA试剂盒检测IFN- γ的浓度和TNF- α的浓度（即T淋巴细胞分泌IFN- γ和TNF- α 的能力）。用于检测IFN-γ的试剂盒为人IFN-gamma ELISA试剂盒，购自美国PeproTech 公司，产品目录号为900-K27。用于检测TNF-α的试剂盒为人TNF-a ELISA试剂盒，购自美 国P印roTech公司，产品目录号为900-K25。
[0066] 培养48小时时，各组培养上清液中的IFN-Y浓度依次如下(浓度单位为pg/ ml):第一组为11.9±1.97、第二组为121.06±6. 27、第三组为12. 3±2. 6、第四组为 118. 69±5. 31、第五组为 5. 64±0. 58、第六组为 10. 8±1. 58。
[0067] 培养48小时时，各组培养上清液中的TNF-α浓度依次如下(浓度单位为pg/ ml):第一组为9. 31 ±2. 09、第二组为94. 31 ±20. 1、第三组为8. 56±1. 23、第四组为 96. 35±15. 3、第五组为 6. 21±1. 14、第六组为 9. 25±1. 89。
[0068] 二、表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质和具有氧化型甘露聚糖修饰 的表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质与DC细胞促进人T淋巴细胞增殖
[0069] 1、取若干96孔板，每孔加入100μ 1人T淋巴细胞的细胞悬液(用含10%体积比 FBS的RPMI-1640培养液悬浮，含5Χ 105个人淋巴细胞)，置于37°C、5%C02细胞培养箱中静 置培养4小时。
[0070] 2、完成步骤1后，取96孔板，将孔分成若干组，每组6个孔，分别处理如下：
[0071] 第一组：每孔加入0.5ml人DC细胞的细胞悬液(用培养基甲-I悬浮，含IX 104个 人DC细胞）；
[0072] 第二组：每孔加入0. 5ml人DC细胞的细胞悬液(用培养基甲-II悬浮，含IX 104个 人DC细胞）；
[0073] 第三组：每孔加入0.5ml人DC细胞的细胞悬液(用培养基乙-I悬浮，含1X104个 人DC细胞）；
[0074] 第四组：每孔加入0. 5ml人DC细胞的细胞悬液(用培养基乙-II悬浮，含1 X 104个 人DC细胞）；
[0075] 第五组：每孔加入0. 5ml人DC细胞的细胞悬液(用培养基丙悬浮，含1 X 104个人 DC细胞）；
[0076] 第六组：每孔加入0. 5ml人DC细胞的细胞悬液(用培养基丁悬浮，含1 X 104个人 DC细胞）；
[0077] 空白对照组：每孔加入0. 5ml无血清RPMI-1640培养液；
[0078] 置于37°C、5%C02细胞培养箱中静置培养48小时。
[0079] 3、完成步骤2后，每孔加入10 μ 1 CCK-8溶液，室温静置3小时，然后检测0D值 (A450nm吸光度）。
[0080] 刺激指数（stimulation index, SI)=实验组0D值/空白对照组0D值。
[0081] 第一组的刺激指数为1. 32±0. 08、第二组的刺激指数为2. 79±0. 21、第三组 的刺激指数为1.26±0. 12、第四组的刺激指数为2.85±0. 18、第五组的刺激指数为 1. 12±0. 15、第六组的刺激指数为1. 28±0. 15。
[0082] 结果表明，将表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质或具有氧化型甘露 聚糖修饰的表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质与DC细胞联合使用，可以有效 的活化T淋巴细胞，从而应用于肿瘤患者的治疗。
[0001] 序列表 <110〉卢戌 <120〉表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质及其应用 <130> CGGNAY142176 <160〉 5 <210〉 1 <211> 26 <212> PRT 〈213>人工序列 <220> <223〉 <400〉 1 Met Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu 15 10 15 Ala Glu Leu Ala Arg Arg Ser Leu Ala Gin 20 25 <210〉 2 <211〉 78 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉
[0002] <223〉 <400〉 2 atgcttctag aattctacct ggccatgcca ttcgctacgc ctatggaggc agaactggcg 60 cgccggtcgc ttgcacaa 78 <210〉 3 <211〉 1353 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉 <400〉 3 gttggtgaga gctcagcgct cctgcctgga cgcatcccgg ctatgcagcc ccagtccagg 60 gcagcaaggc aggccccgtc tgcctcttca cccggaggcc tctgcccgcc ccactcatgc 120 tcagggagag ggtcttctgg ctttttcccc aggctctggg caggcacagg cgtgccccta 180 acccaggccc tgcacacaaa ggggcaggtg ctgggctcag acctgccaag agccatatcc 240 gggaggaccc tgcccctgac cgcccacccc aaaggccaaa ctctccactc cctcagctcg 300 gacaccttct ctcctcccag attccagctc ccaatcttct ctctccagag cccaaatctt 360 gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc caggtaagcc agcccaggcc tcgccctcca 420 gctcaaggcg ggacaggtgc cctagggcct gcatccaggg acaggcccca gccgggtgct 480 gacacgtcca cctccatctc ttcctcagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 540 ctcttccccc caaaacccaa ggacar.cctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 600 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 660 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 720 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 780 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggt 840 gggacccgtg gggtgcgagg gccacatgga cagaggccgg ctcggcccac cctctgccct 900
[0003] gagagtgacc gctgtaccaa cctctgtccc tacagggcag ccccgagaac cacaggtgta 960 caccctgccc ccatcccggg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa 1020 aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa 1080 ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct 1140 caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcaggc 1200 tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccttaagt ccgggaaagg cagcggcacc 1260 accagcggca ccacccgcct cctgagcggc atgacctgct tcaccctgac cggcctgctg 1320 ggcaccctgg tgaccatggg cctgctgacc taa 1353 <210> 4 <211〉 1437 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220〉 <223〉 <400〉 4 atgcttctag aattctacct ggccatgcca ttcgctacgc ctatggaggc agaactggcg 60 cgccggtcgc ttgcacaagc tagcgttggt gagagctcag cgctcctgcc tggacgcatc 120 ccggctatgc agccccagtc cagggcagca aggcaggccc cgtctgcctc ttcacccgga 180 ggcctctgcc cgccccactc atgctcaggg agagggtctt ctggcttttt ccccaggctc 240 tgggcaggca caggcgtgcc cctaacccag gccctgcaca caaaggggca ggtgctgggc 300 tcagacctgc caagagccat atccgggagg accctgcccc tgaccgccca ccccaaaggc 360 caaactctcc actccctcag ctcggacacc ttctctcctc ccagattcca gctcccaatc 420 ttctctctcc agagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccaggta 480 agccagccca ggcctcgccc tccagctcaa ggcgggacag gtgccctagg gcctgcatcc 540 agggacaggc cccagccggg tgctgacacg tccacctcca tctcttcctc agcacctgaa 600 ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcalgatc 660 tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 720
[0004] aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 780 gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 840 ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 900 aaaaccatct ccaaagccaa aggtgggacc cgtggggtgc gagggccaca tggacagagg 960 ccggctcggc ccaccctctg ccctgagagt gaccgctgta ccaacctctg tccctacagg 1020 gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggagctga ccaagaacca 1080 ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga 1140 gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg 1200 ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt 1260 cttctcatgc tccgtgatgc aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctcctt 1320 aagtccggga aaggcagcgg caccaccagc ggcaccaccc gcctcctgag cggcatgacc 1380 tgcttcaccc tgaccggcct gctgggcacc ctggtgacca tgggcctgct gacctaa 1437 <210> 5 <211〉 478 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223> <400> 5 Met Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu 1 5 10 15 Ala Glu Leu Ala Arg Arg Ser Leu Ala Gin Ala Ser Val Gly Glu Ser 20 25 30 Ser Ala Leu Leu Pro Gly Arg ile Rro Ala Met Gin Pro Gin Ser Arg 35 40 45
[0005] Ala Ala Arg Gin Ala Pro Ser Ala Ser Ser Pro Gly Gly Leu Cys Pro -SO 55 60 Pro His Ser Cys Ser Gly Arg Gly Ser Ser Gly Phe Phe Pro Arg Leu 65 70 75 80 Trp Ala Gly Thr Gly Val Pro Leu Thr Gin Ala Leu His Thr Lys Gly 85 90 95 Gin Val Leu Gly Ser Asp Leu Pro Arg Ala lie Ser Gly Arg Thr Leu loo 105 no Pro Leu Thr Ala His Pro Lys Gly Gin Thr Leu His Ser Leu Ser Ser 115 120 125 Asp Thr Phe Ser Pro Pro Arg Phe Gin Leu Pro lie Phe Ser Leu Gin 130 135 140 Ser Pro Asn Leu Val Thr Lys Leu Thr His Ala His Arg Ala Gin Val 145 150 155 160 Ser Gin Pro Arg Pro Arg Pro Pro Ala Gin Gly Gly Thr Gly Ala Leu 165 170 175 Gly Pro Ala Ser Arg Asp Arg Pro Gin Pro Gly Ala Asp Thr Ser Thr 180 185 190 Ser lie Ser Ser Ser Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 195 200 205 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro 210 215 220 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 225 230 235 240 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 245 250 255 Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 260 265 270 Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 275 280 285
[0006]
【权利要求】
1. 表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质；所述GPI-NY-ES0-1融合蛋白自上 游至下游依次包括如下元件：NY-ES0-1多肽和GPI片段；所述NY-ES0-1多肽如序列表的 序列5自N末端第2-26位氨基酸残基所示；所述GPI片段如序列表的序列5自N末端第 445-478位氨基酸残基所示。
2. 如权利要求1所述的"表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质"，其特征在 于：所述GPI-NY-ES0-1融合蛋白自上游至下游依次包括如下元件：所述NY-ES0-1多肽、 IgGFc片段和所述GPI片段；所述IgGFc片段如序列表的序列5自N末端第29-444位氨基 酸残基所示；所述GPI-NY-ES0-1融合蛋白优选为序列表的序列5所示的蛋白质。
3. 如权利要求1或2所述的"表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质"，其特 征在于：所述"表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质"为表达所述GPI-NY-ES0-1 融合蛋白的细胞的细胞膜脂质。
4. 如权利要求3所述的"表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质"，其特征在 于：所述"表达所述GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞"为SW480细胞或SGC-7901细胞。
5. 如权利要求1或2所述的"表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质"，其特 征在于：所述"表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质"的制备方法包括如下步骤： (1) 将含有所述GPI-NY-ES0-1融合蛋白的编码基因的重组质粒导入离体的哺乳动物 细胞，得到重组细胞； (2) 提取所述重组细胞的细胞膜脂质。
6. 如权利要求5所述的"表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质"，其特征在 于：所述步骤（2)中，"提取所述重组细胞的细胞膜脂质"的方法包括如下步骤： ① 取所述重组细胞，裂解细胞，1800-2200g离心，取上清液； ② 取步骤①得到的上清液，20000-24000g离心，取沉淀； ③ 取步骤②得到的沉淀，先用溶液I洗涤，然后用溶液II溶解并振荡，然后1800-2200g 离心，取上清液； 溶液 I :含 〇· 1-0. 2mol/L NaCl 和 5-15mmol/L Tris 的水溶液，pH7-9 ;溶液 II :含 0· 1-0. 2mol/L NaCl 和 l-3g/100mLl-S_0ctyl Beta-D-thioglucopyranoside 的 pH7_8、 20-30mmol/L 的 Tris-HCl 缓冲液。
7. 具有氧化型甘露聚糖修饰的表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质。
8. 如权利要求7所述的"具有氧化型甘露聚糖修饰的表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋 白的细胞膜脂质"，其特征在于：所述"具有氧化型甘露聚糖修饰的表面展示GPI-NY-ES0-1 融合蛋白的细胞膜脂质"的制备方法包括如下步骤：取权利要求1至6中任一所述的"含 GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质"，与氧化型甘露聚糖反应，得到具有氧化型甘露聚糖 修饰的表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质。
9. 一种促进T淋巴细胞分泌细胞因子和/或促进T淋巴细胞增殖的试剂盒，包括权利 要求1至6中任一所述的"表面展示GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质"或权利要求7 至8中任一所述的"具有氧化型甘露聚糖修饰的GPI-NY-ES0-1融合蛋白的细胞膜脂质"。
10. 如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括离体的DC细胞。
【文档编号】A61K47/48GK104119449SQ201410055971
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年2月19日 优先权日:2014年2月19日
【发明者】卢戌 申请人:卢戌