一类突变的具有高耐碱特性的蛋白a及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于蛋白工程领域，涉及一类突变的具有高耐碱特性的蛋白A及其应用。本发明蛋白A能牢固结合到免疫球蛋白分子除互补决定区之外其他区域，可以作为偶联于固相载体的配体用于分离免疫球蛋白。这类蛋白A能在PH13‐14强碱环境中保持化学稳定性，作为层析配体从而可以耐受苛刻的原位清洗条件。本发明也涉及使用蛋白Ａ配体分离纯化免疫球蛋白和用碱再生的过程。
【专利说明】-类突变的具有高耐碱特性的蛋白A及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白工程领域，涉及一类突变的具有高耐碱特性的蛋白A及其应用。
【背景技术】
[0002] 生物技术是当今世界高技术发展最快的领域之一。作为生物【技术领域】之一的抗体 药物，近些年，在不断地提高患者健康水平和生活质量的同时，也取得了瞩目的市场业绩。 另外，新药研发不断增加投入的同时，创新药物却在明显减少，且目前众多小分子药物还面 临着专利悬崖的威胁。所以，为了寻求新的增长点，众多制药企业尤其是生物技术制药公 司，逐渐进入抗体药物研发领域。目前，抗体药物在基础生物医学研究、疾病（如癌症、器官 移植排斥、自身免疫性疾病等）的诊断和治疗方面已经被广泛应用。
[0003] 近年来随着治疗性药用抗体药物在医疗领域大量出现，其生产工艺也开始受到人 们的重视。对于用于药物和诊断试剂的抗体药物的大规模经济生产，一般而言，是通过细胞 培养在细胞内或通过分泌进入周围的培养基中生产目标抗体。由于培养细胞的过程需要在 培养基中加入糖，氨基酸，生长因子，因此必须将抗体从培养基和其他细胞组分中分离达到 足够的纯度，才可以用作人治疗剂。现在最普遍采用的抗体纯化方式是亲和层析，其优势在 于简单快速选择性强，早期先进行亲和纯化，可以明显减少后续纯化的步骤。在现代工业中 保持低的生产成本也是生产工艺中很重要的要求，如果生产中所需的纯化层析介质可以反 复使用，可以明显降低抗体的生产成本。但是，由于层析介质每次纯化抗体都会留下未洗脱 的蛋白，蛋白聚集体甚至残留对人体有害的物质，例如病毒，内毒素。所以介质在重新使用 时必须进行清洁，现在最有效的恢复层析介质的清洁方式是被称作原位清洁的碱性方法， 其标准流程包括用〇. 5M NaOH处理纯化介质，这种苛刻的方式可以有效地去除杂质，但是很 可能损害纯化介质。因此本发明涉及的耐碱的并可以结合免疫球蛋白的蛋白A分子可以作 为亲和介质上很好的配体，用于纯化抗体药物，其纯化介质也可以用原位清洁的碱性方法 对使用后的纯化介质进行再生。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一类突变的具有高耐碱特性的蛋 白A。
[0005] 本发明的另一目的是提供该蛋白A的应用。
[0006] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0007] -类基因突变的蛋白A，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1或SEQ ID N0. 2所示，或者 与SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列在与免疫球蛋白结合区域有99%以上同 源性的能够结合免疫球蛋白的所有氨基酸序列，其中，所述的与免疫球蛋白结合区域为第 7?第54个氨基酸残基。
[0008] 编码所述的蛋白A的核酸。
[0009] 本发明涉及的蛋白A，实质上是一类可以结合免疫球蛋白的分子，这类分子可以 牢固结合免疫球蛋白上互补决定区之外其他区域，同时可以耐受PH13 -14的强碱环境。这 类蛋白A的结合免疫球蛋白的区域的蛋白构象主要是有3股α螺旋组成，并折叠成一种三 螺旋束结构。其能通过α螺旋1和2表面氨基酸残基结免疫球蛋白的Fc区域，或通过α 螺旋2和3表面残基结合免疫球蛋白Fab上的非互补决定区。同时α螺旋1，2, 3表面疏水 性残基会在螺旋束的中心形成一个疏水核心，可以将α螺旋1，2, 3紧密的结合在一起，维 持蛋白稳定的结构。与其他不耐碱蛋白不同的是当这类蛋白Α被放置于ΡΗ13 -14的碱性环 境中，虽然维持蛋白稳定结构的氢键消失，α螺旋1、2、3会舒展伸张，但是强的疏水力仍能 使α螺旋1、2、3紧密结合并保证其相对位置没有显著变化。当这类蛋白Α重新被放置于 PH7 - 8中性环境中，α螺旋1、2、3间氢键恢复，因此整体构象可以恢复至放置于碱性环境 之前，而其他不耐碱蛋白由于缺乏维持蛋白结构稳定的疏水核心，在被放置于ΡΗ13 - 14的 碱性环境中后，蛋白结构会被彻底破坏，当重新被放置于ΡΗ7 -8中性环境中，蛋白整体构象 无法恢复至放置于碱性环境之前。将这种有耐碱特质的蛋白Α及其多聚体偶联到固相载体 上可以用来分离纯化免疫球蛋白分子或者将他们偶联上标记物可以用来检测免疫球蛋白 分子，同时如果将其作为层析介质的配体，可以用原位碱清洁的方式对层析介质实现再生。
[0010] 本发明蛋白A单聚体分子量在6KD左右，由58个氨基酸组成，可以通过多肽化学 合成或是细胞表达的方式获得。如果采用细胞表达的方式，必须首先构建携带有编码蛋白 氨基酸序列的基因的细胞株。因此需要按照以下的流程进行：首先通过基因合成的方式获 取编码蛋白A氨基酸序列的基因，下一步，将编码蛋白A氨基酸序列的基因重组到表达载 体中，此时可以根据需要在载体中添加纯化标签筛选标签或是指示性标签，紧接着将表达 载体稳定地转入合适的细胞中，完成整个可以生产这类蛋白A的表达系统。所需要的具有 结合免疫球蛋白分子的蛋白A (包括单聚体或多聚体)可以从培养基或者细胞中得到。必须 注意的是蛋白A在细胞中的表达需要受到紧密的控制，因此选择用于表达蛋白A的载体非 常重要，应该具有以下几个特性：1.表达载体含有启动子或初始转录位点，2表达载体含有 操纵子用来开关基因的表达，3.表达载体含有核糖体结合位点，4.表达载体含有转录和翻 译的终止位点，可以提高转录和翻译产物的稳定性。因此可以推荐表达蛋白A的载体有PE T (Novagen)，PQE30 (Qiagen)，PGS21a (genscript)，pGAPZ a A (Invitrogen)等，对应的宿主 细胞的选择有大肠杆菌基因工程菌和毕赤巴斯德酵母，可以在宿主的细胞内，细胞外或细 胞膜上生成这类蛋白A。
[0011] 这类蛋白A可以根据需要，通过利用其物理性质，化学性质等的各种分离操作进 行分离纯化。具体而言，例如通常的蛋白沉淀剂处理(盐析法)，离心分离，渗透压破碎法，超 声波破碎，超滤，凝胶过滤，以及吸附色谱，离子交换色谱，亲和色谱，高速液相色谱等各种 液相色谱，透析法及这些方法的组合等。此外，通过表达这类蛋白与亲和标记融合的蛋白 质，利用该标记可以进行亲和纯化。此处所述的亲和标记，例如多聚组氨酸标记及FLAG标 记。利用这些标记可以进行这类蛋白A的纯化。
[0012] 这类蛋白A结合免疫球蛋白的活性可以通过ELISA实验测定。例如将这类蛋白A 固定在固相载体上，然后加入酶标记的免疫球蛋白使其吸附在蛋白A上，用洗涤的方法使 固相载体上形成的免疫球蛋白和蛋白A的复合体与液体中其他物质分开，这样固相载体上 的蛋白A与免疫球蛋白形成的复合体的量与酶的量呈一比一的比例。加入酶的反应底物 后，底物被酶催化成为有色产物，这样蛋白A结合的免疫球蛋白的量可以根据呈色的深浅 进行定性和定量分析。
[0013] 这类蛋白A的碱化学稳定性也可以被本领域的技术人员很容易的证实。例如将这 类蛋白A先浸泡在0. 5M浓度的NaOH中持续60小时，按照以上所述的ELISA实验测定其结 合免疫球蛋白的活性，如何仍然可以很好的保持结合免疫球蛋白的活性，那么则证明这类 蛋白A在强碱环境中是稳定的。再例如利用存在于这类蛋白A中的氨基或羧基基团，通过 双环氧化物，表氯醇，溴化氰，N -羟基琥珀酰胺等偶联剂，将这类蛋白A偶联到固相载体上 (sepharose4B)并制成层析柱，然后过量加载免疫球蛋白分子，接着用PH8. 0的磷酸盐缓冲 液洗涤，然后用PH. 3. 0的甘氨酸缓冲液洗脱，之后测定洗脱的免疫球蛋白的量来测定柱的 总容量。在每一个循环之间，用0.5M NaOH组成的原位清洁的碱性方法处理来处理柱，在 1〇〇个循环之后，如果柱的总容量没有降低，那么则证明这类蛋白A在强碱环境下的化学性 质非常稳定，非常适合作为免疫球蛋白亲和纯化的配体。
[0014] 一种包含所述的蛋白A的多聚体，包含两个或两个以上重复单元。
[0015] 上述论述的蛋白A都是单聚体，然而这种蛋白可以结合为多聚体蛋白，诸如二聚 体，三聚体，四聚体等等。因此一个属于本发明的蛋白A与自身或与本发明中其他蛋白A形 成的多聚体，同样属于本发明的另一个方面。本发明的多聚体包括优选4- 10个氨基酸的 一段氨基酸序列连接的单体单元。这种连接不破坏蛋白A的空间构象，此外在碱性环境中 同样充分稳定，不损害蛋白A的特性。在目前的实施方案中，多聚体是蛋白A的二聚体，其 中连接蛋白A的长度为4个氨基酸（ADGK)。
[0016] 本发明涉及编码上述蛋白A或其多聚体的核酸序列。该核酸序列经过密码子优 化，优化后的核酸序列避免了稀有密码子的产生和二级结构的形成，并通过引物搭桥人工 基因合成的方式合成出来。
[0017] 本发明涉及这类蛋白A经N端或C端或侧链基团进行化学修饰所得到的所有能牢 固结合免疫球蛋白的蛋白衍生物。如N端氨基被乙酰化后得到N -乙酰多肽，被脂肪酸酰化 后得到N -脂肪酸酰化多肽。又比如C -端羧基转化为酰胺可以得到多肽酰胺，转化为酯得 到多肽酯，转化为硫酯得到多肽硫酯。衍生化修饰对调节原有蛋白的酸碱性，稳定性，溶解 性，反应活性及生物活性具有重要作用。如果在蛋白A的C末端提供一个半胱氨酸残基，蛋 白A可以通过硫醚键与载体相偶联，而且这种偶联方法技术人员利用标准技术和设备很容 易进行。
[0018] 本发明所述的蛋白A、多聚体或蛋白A衍生物在分离、纯化和/或检测免疫球蛋 白中的应用。
[0019] 编码本发明所述的蛋白A、多聚体或蛋白A衍生物的基因在分离、纯化和/或检 测免疫球蛋白中的应用。
[0020] 本发明涉及这类蛋白A的商业化应用，包括免疫球蛋白的纯化和免疫球蛋白的检 测。免疫球蛋白纯化方面的应用包含一种层亲和析分离的方法，其中通过吸附于如上所述 蛋白A或多聚体来从复杂基质中分离至少一种靶化合物，是一种广泛使用的分离技术。具 体步骤包括让含有免疫球蛋白的样品溶液流经蛋白A层析介质。在此步骤中，溶液中的其 他组分将基本不受阻碍地通过，而免疫球蛋白被吸附到层析介质上。然后洗涤介质，例如用 磷酸盐缓冲液，来除去残留的非特异性结合的杂质，正如以上所讨论的，也可以通过利用碱 性试剂的洗涤步骤。下一步骤中，让洗脱液流经层析介质从而将吸附的免疫球蛋白洗脱下 来，洗脱通常是通过改变PH，离子强度或是添加竞争性的物质来实现的。免疫球蛋白的检测 方面的应用包含一种检测免疫球蛋白的方法，其中包括首先在蛋白A上进行酶标记，化学 发光标记或是同位素标记，然后通过蛋白A吸附到免疫球蛋白上，能够实现免疫球蛋白可 视化分析。
[0021] 有益效果：
[0022] 本发明提供的蛋白A及其多聚体和衍生物能牢固结合到免疫球蛋白分子除互补 决定区之外其他区域，可以作为偶联于固相载体的配体用于分离免疫球蛋白。这类蛋白A 能在PH13 -14强碱环境中保持化学稳定性，作为层析配体从而可以耐受苛刻的原位清洗条 件。本发明蛋白A及其多聚体和衍生物能够在纯化和/或检测免疫球蛋白中应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1SDS - PAGE检测蛋白A在大肠杆菌中的表达，其中泳道Μ为Protein Marker(Genscript94KD，66kD，36KD，25KD，14KD)，泳道1?4分别为检测蛋白A在不同大肠 杆菌转换子中的表达。
[0024] 图2SDS - PAGE检测蛋白A二聚体在大肠杆菌中的表达，其中泳道Μ为Protein Marker (Genscript94KD，66kD，36KD，25KD，14KD)，泳道 1 ?5 分别为检测蛋白 A 二聚体在不 同大肠杆菌转换子中的表达。
[0025] 图3SDS - PAGE用NI柱纯化蛋白 A，其中泳道1为Protein Marker (Genscript94KD，66kD，36KD，25KD，14KD)，泳道2为用洗脱缓冲液洗脱蛋白A时流出 的样品。
[0026] 图4SDS - PAGE用NI柱纯化蛋白A二聚体，其中泳道1为Protein Marker (Genscript94KD，66kD，36KD，25KD，14KD)，泳道2为细胞破碎液上清上Ni柱前的上 样样品，泳道3为细胞破碎液上清经过Ni柱后的流出样品，泳道4为用平衡缓冲液洗杂时 流出的样品，泳道5为用洗脱缓冲液洗脱蛋白A二聚体时流出的样品。
[0027] 图5SDS - PAGE蛋白A作为亲和层析介质的配体纯化免疫球蛋白，其中泳道1为 Protein Marker (Genscript94KD，66kD，36KD，25KD，14KD)，泳道 2 为人的血清，泳道 3 为用 以蛋白A作为亲和层析介质的配体从人的血清中纯化出的免疫球蛋白。
[0028] 图6SDS -PAGE蛋白A二聚体作为亲和层析介质的配体纯化免疫球蛋白，其中泳道 1 为 Protein Marker (Genscript220KD，150KD，100KD，75KD，50KD，35kD，25kD，15KD)，泳道 2 为人的血清，泳道3为用磷酸盐缓冲液洗杂时流出的样品，泳道4为以蛋白A二聚体作为亲 和层析介质的配体从人的血清中纯化出的免疫球蛋白。
[0029] 图7蛋白A二聚体作为亲和层析介质的配体的耐碱性测试。
【具体实施方式】
[0030] 实施例1含有N末端融合6个组氨酸残基的蛋白A的编码基因的载体的构建
[0031] 根据大肠杆菌密码子的偏好性以及避免mRNA编码区形成二级结构的倾向设计出 编码N端融合6个组氨酸残基蛋白A的基因序列，分别如SEQ ID N0. 4和SEQ ID N0. 6所 示；其对应的氨基酸序列分别如SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 5所示，前者以下称为蛋白Al， 后者称为蛋白A2。运用基因设计软件将蛋白A1和A2的编码基因序列分解成多条相互搭 桥且退火温度相差不大的基因小片段，根据上述小片段的基因序列合成引物，分别如引物 4 - 1 ?弓|物 4 - 8 (SEQIDNO. 4 - 1 ?4 - 8)和弓|物 6 - 1 ?弓|物 6 - 8 (SEQIDNO. 6 - 1 ? 6 - 8)，以引物4 - 1?引物4 - 8和引物6 - 1?引物6 - 8的混合物为模版和引物，使用PBO 聚合酶（genscript)，米用 2720thermal cycler (Applied Biosysytems 公司），反应循环为 95°C 20s，55°C 20s，72°C 20s，共进行25个循环，最后于72°C保温3分钟，得到PCR反应液； 以此次反应液为模板，添加上述根据首尾小片段基因序列设计的引物4 -1和引物4 -8或引 物6 - 1和引物6 - 8作为引物，于同样的条件进行1次PCR，得到的PCR产物用加入溴乙锭 的1%琼脂糖凝胶进行电泳，通过在紫外线下观察该凝胶研究DNA条带。从凝胶中切出扩增 的片段，使用Quick Gel Extraction Kit (Genscript)按照产品说明书进行纯化。纯化后的 DNA使用 Applied Biosystems 公司制的 DNA测序仪（3730x196 -capillary DNA analyzer) 以及 ABI PRISM Bigdye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit,并按照产 品说明书进行测序。
[0032] 表1PCR扩增蛋白A1和蛋白A2的引物
[0033]
【权利要求】
1. 一类基因突变的蛋白A，其特征在于其具有如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示氨 基酸序列，或者与SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列在与免疫球蛋白结合区 域有99%以上同源性的能够结合免疫球蛋白的所有氨基酸序列，其中，所述的与免疫球蛋 白结合区域为第7?第54个氨基酸残基。
2. -种编码权利要求1所述的蛋白A的基因。
3. -种包含权利要求1所述的蛋白A的多聚体，其特征在于所述的多聚体为两个或两 个以上权利要求1所述的蛋白A形成的多聚体或者为权利要求1所述的蛋白A与其他蛋白 形成的多聚体。
4. 一种编码权利要求3所述的多聚体的基因。
5. 对权利要求1或3中任一项所述的蛋白A或蛋白A的多聚体的N端或C端或侧链基 团进行化学修饰所得到的所有能牢固结合免疫球蛋白的蛋白A衍生物。
6. 根据权利要求5所述的蛋白A衍生物，其特征在于所述的衍生物是在权利要求1或 3中任一项所述的蛋白A分子的N端修饰6个组氨酸残基所得。
7. 权利要求1所述的蛋白A、权利要求3所述的多聚体或权利要求5所述的蛋白A衍 生物在分离、纯化和/或检测免疫球蛋白中的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于包括将所述的蛋白A、所述的多聚体或所 述的蛋白A衍生物用于亲和层析介质中的配体或用于免疫球蛋白检测中的分子标记物。
9. 权利要求2、权利要求4或权利要求8所述的基因在分离、纯化和/或检测免疫球蛋 白中的应用。
【文档编号】G01N33/68GK104059133SQ201310087284
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2013年3月18日 优先权日:2013年3月18日
【发明者】钱红, 白涛, 花榕, 方利, 杨永坤, 姜伟明 申请人:南京金斯瑞生物科技有限公司