专利名称：棉花纤维的类β微管蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及棉花纤维的类β微管蛋白及其编码基因与应用。
1992年，John和Crow克隆并分析了第一个纤维特异表达基因E6，掀起了克隆纤维特异基因的热潮。E6转录子在纤维发育的整个过程中都能检测到。E6的mRNA和蛋白浓度在初生壁合成晚期和次生壁合成早期最高，未发现与E6基因同源的已知原核或真核基因。然而，将反义基因转入棉花中[John，1996]，未发现纤维的发育和品质有明显的表型变化，表明E6基因对于纤维的正常发育和结构完整不是至关重要的。
1995年，Delmer等克隆到棉纤维特异的GTP结合蛋白基因Rac13，在发育的纤维中高效表达，在由伸长期向次生细胞壁合成转换期表达量最高，此时细胞骨架正进行重新组织。因此Rac13可能在细胞骨架组织的信号传递中发挥作用。
1995年，John 克隆到一纤维高表达基因B6，长1.2kb，它在初生壁和次生壁合成阶段都有表达，蛋白有一个疏水N末端和两个富含Pro的区域。并获得了上游2.3kb启动子区，能引导GUS的瞬时表达。但该基因的功能不详。
1995年，John和Keller 克隆到纤维特异表达的基因H6，蛋白中富含Pro，存在17个五氨基基元(motif)Ala(Ser)-Thr(Ser)-Pro-Pro-Pro。其mRNA在初生壁形成早期聚集，但其蛋白在初生壁形成晚期即次生壁合成期开始时聚集，表明H6可能存在翻译水平的调节并在次生壁装配中发挥作用。从它的氨基酸组成和可溶性推测它可能属于阿拉伯半乳糖蛋白(AGP)，作为细胞膜嵌入成分参与棉花纤维次生壁的发育和构架。
1995年，Ma等克隆到GH3，它编码一脂转移蛋白(LTP)，可能定位于纤维细胞外膜。GH3基因受发育调控，在伸长期表达量最高，可能参与跨膜转运几丁质单体，促进几丁质合成。
1996年，Reinhart等克隆到棉纤维特异表达的基因FbL2A。它的表达受发育调控，在初生壁合成晚期和次生壁合成早期被激活。该基因编码一个43.4KD的蛋白，除N端疏水外高度亲水，62％由重复基元组成，有一个55氨基酸的区域重复4次之多。该蛋白在纤维细胞中的功能不详。
1997年，Ma等克隆到脂转移蛋白Ltp6基因，与GH3的氨基酸同源性为64％。Ltp6也在纤维细胞中伸长期表达量最高，只是表达水平低些。1999年，Hsu等分离到Ltp6的启动子，Ltp6启动子具有组织表达特异性。
1997年，Oxford和Timmis克隆到脂转移蛋白FS6(LTP)和一富含Pro蛋白(PRP)FS17，两者都在纤维发育早期高表达。存在的信号肽序列表明，LTP和PRP都定位于纤维的胞外基质中。FS6与以前发现的棉花LTP GH3[Ma et al.，1995]氨基酸同源性为88％，但两者疏水性差别很大。FS17可能有强化细胞壁的功能，它与细胞壁复杂的结构相连接，快速伸长的纤维细胞中富含FS17，可能与这种生长需要持续供应壁物质有关，存在典型的PRP重复基元(motif)PPVYK，与以前报道的富含Pro蛋白H6[John and Keller，1995]无显著相似性。另一纤维特异未知功能的蛋白B6[John，1995]，有两个富含Pro的区域，但这两个区域都与FS17中的重复序列不相似。
1997年，Song和Allen克隆到棉纤维特异表达的基因酰基载体蛋白(ACP)。Northern blot表明该基因在纤维伸长期高效表达，Southern blot分析发现单拷贝的ACP可能在棉花A和D基因组中都存在，在进化过程中，ACP基因家族的一员特异表达成为纤维，可能为迅速伸长的纤维合成膜脂。
1998年，Kawai等克隆到GhCAP(adenyl cyclase-associated)基因。GhCAP编码471aa的读码框。Northern blot表明GhCAP主要在纤维伸长期表达。GhCAP在微丝组织中起作用，可能在细胞骨架重组中起信号传递作用。
1998年，Oxford和Timmis克隆到pGhEX1。它编码expansin。该基因只在棉纤维中表达，在伸长期受发育调控，即16DPA时最高，之后下降。研究表明它可能与植物细胞膨压驱动的生长有关，同时也发现棉纤维细胞基因表达在转录水平上受到调控。
1999年，Loguercio等克隆到几个可能与棉花纤维分化及发育相关的myb类基因。研究了6个属于R2R3-MYB家族的棉花myb类基因(GhMYB)在异源四倍体陆地棉中的表达特性。在反式调节区内发现了可能调节GhMYB活性的几个结构域和基元。一个是存在于5个GhMYB中的恰好位于DNA结合结构域(DBD)下游的40个氨基酸的碱性区域(TRR1)。并且，存在于一类植物MYB中的保守基元GIDxxH也存在于GhMYB1和GhMYB6TRR1结构域的同一位置。至少两个GhMYBs(GhMYB4和GhMYB5)在5’前导序列(5’-uORFs)有未定性的读码框，可能在翻译水平调节这些GhMYB蛋白的合成。多个DNA结合结构域(DBD)的存在表明GhMYB与苯丙酸合成相关的植物R2R3-MYB有结构相似性。GhMYB5是与棉花R2R3-MYB关系最远的，与干旱诱导的AtMYBG11同处于一个孤立的基因簇。除了保守的基元外，序列分析并未发现GhMYB、MIXTA(AmMYBMx)和G11(AtMYBG11)在DBD和TRR有其他相似性。然而进化树分析发现，GhMYB2、GhMYB3和GhMYB4属于包括GLABROUS1的基因簇，而GhMYB1和GhMYB6属于关系近的基因簇。半定量RT-PCR分析显示，GhMYB基因表达有两个不同的类型一型GhMYB(GhMYB-1，-2和-3)转录子在所有组织中都有，并且比二型丰度高；二型GhMYB(GhMYB-4，-5和-6)在纤维中高表达。GhMYB表达的发育调控与这些DNA结合因子在纤维分化和伸长中的功能一致。
1999年，Oxford等克隆到一全长cDNA克隆FS18，它是只编码71个氨基酸的蛋白，与LTP有一些相似性，功能不详。该基因在纤维中高表达，尤其突出的是它在次生壁合成开始和以后(18-24DPA)表达量最高。
2001年，Cui等克隆到新基因CFL1，该基因与FKS1酵母β-1，3-葡聚糖(胼胝质)合酶催化亚基同源。CFL1在纤维初生壁合成期高表达，它在幼根中表达量也较高。序列分析和CaM-gel overlay assay推测在它亲水性的N末端有一CaM结合位点。Product-entrapment assay显示，该蛋白能与体外合成的胼胝质沉淀结合。CFL1是酵母β-1，3-葡聚糖合酶催化亚基FKS1的植物同系物，可能在胼胝质合成中起作用。
2001年，Zhao等克隆到10个纤维特异cDNA。其中5个分别编码二磷酸核甘酸酶(bisphosphate nucleotidase)、α-tubulin、β半乳糖甘酶、膜连蛋白(annexin)和可逆糖基化多肽；另5个功能未定。这10个cDNA都在纤维细胞高效表达，绝大多数在纤维发育的早期累积，除了F14，它在纤维发育晚期表达量最高。
2001年，Tan等克隆了一个在棉花纤维和根尖组织中特异表达的基因ghprp1(proline-rich proteins)，该基因编码一个299个氨基残基的蛋白质，在该蛋白的N端有一疏水信号肽。该基因存在于棉花基因组的A1，A2，D1和D5染色体上。
2002年，Zhao等从棉花纤维中克隆到GhRGP1(reversibly glycosylated polypeptide)基因，该基因编码一个359个氨基酸残基的蛋白质，经实验证实该基因仅在棉花纤维中表达，并在伸长期和增厚期大量表达，该蛋白可能参与了细胞壁的非纤维多聚糖的生物合成。
虽然对棉花纤维发育和伸长方面已经作了大量深入细致的工作，由于棉花纤维发育和伸长调节方面的复杂性，仍有大量未知的领域有待研究。
本发明所提供的棉花纤维类β微管蛋白的名称为Gh-BtubL，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
序列表中序列2的蛋白质由444个氨基酸残基组成。
棉花纤维类β微管蛋白Gh-BtubL的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有85％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列1的基因由1580个碱基组成，该基因的读码框为自3’端第1到第1335位共1335个碱基。编码一个类β微管样蛋白Gh-BtubL，和棉花纤维伸长密切相关，具有使细胞伸长的功能，和细胞壁的径向伸长具有密切关系，在棉花纤维发育的启始期开始转录，并在伸长期大量转录。
棉花纤维的发育和伸长是一个复杂的代谢调控过程，由上百个基因参与，目前仅克隆到三十多个与之相关的基因，其中了解功能的基因有十几个。本发明所提供的Gh-BtubL基因，在棉花纤维中特异表达，具有促进真核细胞增长的功能。
本发明证实，带有正向Gh-BtubL基因的裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)表现出十分明显的生理特征，改变了酵母细胞的形态特征。正常情况下，在稳定期裂殖酵母细胞的长度约为10μm，然后开始二分分裂进行繁殖，而正向表达Gh-BtubL基因的酵母在诱导表达20小时后，其菌体长度可达到18μm左右，比野生型酵母的长度增加了约1.7倍。
根据β-tubulin基因的正常功能推断，Gh-BtubL是微管的一种组成蛋白，在细胞的许多生命活动中发挥重要功能，例如在植物细胞中，微管参与细胞分裂、胞内物质运输和细胞壁的形成等生物过程，所以如果将本发明的Gh-BtubL全长基因或其功能性融合基因按正向模式连接到如纤维特异性表达启动子、酵母/大肠杆菌的穿梭质粒pREP5N的nmt1启动子或35S启动子那样能在各种植物组织和器官中高效表达的启动子的下游，构建成植物转化中间载体，然后用农杆菌法、基因枪法或花粉管通道法将该基因导入叶类经济作物基因组中、并筛选在整个生长期高效表达的转基因植株，Gh-BtubL基因所介导的持续而旺盛的细胞伸长和分裂可能会大幅度提高转基因植物的单位面积绿色营养组织的产量，显著提高叶菜类经济作物的经济效益。如果将构建的植物转化中间载体用农杆菌法、基因枪法或花粉管通道法导入竹子等草本植物基因组中，并筛选在整个生长期高效表达的转基因植株，Gh-BtubL基因所介导的持续而旺盛的细胞伸长和分裂可能会大幅度提高转基因植物的生长速度和植株高度，显著提高竹子等草本类植物的经济价值和效益。如果将构建的植物转化中间载体用农杆菌法、基因枪法或花粉管通道法导入麻等纤维植物基因组中，并筛选在整个生长期高效表达的转基因植株，Gh-BtubL基因所介导的持续而旺盛的细胞伸长和分裂可能会大幅度提高转基因植物的纤维生长速度和长度，显著提高麻等纤维植物的经济价值和效益。本发明的Gh-BtubL基因具有重要的学术和经济价值。为实现人为控制植物细胞伸长奠定了坚实的基础。
图2为Gh-BtubL mRNA表达水平及其与纤维伸长关系的分析。
图3为Gh-BtubL在陆地棉和fls突变体胚珠横切面上的原位杂交结果。
图4为裂殖酵母表达载体的图谱。
用cDNA差式分析法进行棉花纤维特异基因克隆的基本步骤为1、提取野生株和fls突变株细胞内的总RNA，反转录成cDNA以后用四碱基切割酶消化，以降低整个cDNA群体的复杂性；2、分别将上述两组cNDA加上不同的接头序列后按1∶100(野生株∶突变株)的比例混合，95℃高温处理使DNA变性为单链，再缓慢降温到68℃并维持12小时，使体系中的DNA重新成为双链；3、PCR扩增。由于突变株和野生株细胞中的绝大部分mRNA是相同的，根据反应动力学原理，野生株样品中绝大部分cDNA将与突变株样品形成杂合双链，只有在棉花纤维中特异表达的基因，因为无法在突变株的样品中找到互补的cDNA链，无法形成杂合双链的样品，绝大部分cDNA只能按线性形式扩增(因为只有一条链上带有与引物相匹配的接头序列，另一条链来自突变株的样品，不能与所用的引物相互补)。由于棉花纤维特异表达基因的两条链上都有与引物相匹配的接头序列，它们能被按指数形式扩增，经过20-15个循环，棉花特异表达基因被富集数十万至上百万倍，而非特异性表达的仅仅增加20-25倍。经过重复性杂交和PCR扩增，反应体系中几乎百分之百都是棉花纤维中特异表达的基因片段；4、克隆这些片段后用Northern杂交法验证其表达特性并以其中一个片段为探针，筛选棉花纤维cDNA减法文库，获得棉花纤维特异性表达基因Gh-BtubL。
5、通过RT-PCR和机械手点样杂交。根据操作手册用S.N.A.P.TMTotal RNAisolation Kit(Invitrogen，USA)从野生棉花的纤维、根、茎、叶和无纤维棉花种子突变体(fls)的胚珠中分别提取总RNA，以5μg总RNA为模板根据操作手册用SUPERSCRIPTTM第一条链合成系统合成cDNA第一条链，然后以此为模板进行PCR扩增，用棉花泛素(Ubiquitin)作阳性对照。扩增产物通过Biomek2000 LaboratoryAutomation workstation(Beckman Coulter Inc.，USA)将PCR产物点在尼龙膜上，用33P标记DNA探针，杂交后，用磷屏(Molecular Dyanmics，USA)暴光，数据使用ArrayVision 6.0(Imaging Research Inc.，USA)软件分析，结果如图2所示，其中陆地棉纤维(UF)用0-20DPA(开花后天数)衡量，从图中可以看出本发明基因表达的变化趋势，即该基因在棉花纤维发育的启始期开始转录，并在伸长期大量转录。
6、原位杂交。根据Ruan和Chourey的程序将原位杂交的样品用石蜡包埋切片。棉花胚珠样品采集后立即用FAA(Formalin-Acetic Acid)固定液固定，然后用系列叔丁醇脱水，最后用石蜡包埋，切片。用DIG标记的DNA探针和切片杂交，结果如图3所示。其中，A是与利用Gh-BtubL cDNA合成的反义RNA探针杂交的陆地棉胚珠横切面，蓝色信号表示Gh-BtubL mRNA的存在；B是与上述探针杂交的fls突变体的胚珠的横切面；C是与利用Gh-BtubL cDNA合成的正义RNA探针杂交的陆地棉胚珠横切面。D是与利用棉花泛素(ubiquitin)cDNA合成的反义RNA探针杂交的陆地棉胚珠横切面，图中F是纤维细胞；oi是外珠被(outer integument)；ii是内珠被(innerintegumen)。从图中可以看出，在棉花野生株胚珠外珠被成纤维泡状细胞中出现很强的杂交信号，而在其它外珠被表皮细胞和fls突变体细胞中检测不到杂交信号，显示本发明基因的表达具纤维特异性。
实施例2、本发明基因在裂殖酵母中的表达将用实施例1方法所克隆的Gh-BtubL基因按正方向插入酵母和大肠杆菌穿梭质粒pREP5N，构建载体pREP-Btub1(+)(其图谱如图4所示)，转化裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，用限制性培养基筛选阳性克隆子。
该实施例中所用的培养基及试剂包括1、培养基(对S.P.Q-01，补加腺嘌呤和尿嘧啶)酵母浸提物(Yeast Extract) 5g葡萄糖(Glucose) 30g腺嘌呤(Adenine 50×)20ml尿嘧啶(Uracil 50×)20ml加水定容至1L，固体培养基加琼脂至终浓度为20g/L。
2、限制性(MM)培养基(对S.P.Q-01，补加腺嘌呤和尿嘧啶)组分 添加量 最终浓度邻苯二钾酸氢钾(KH Phthlate) 3g 14.7mMNa2HPO4 2.2g 15.5mM谷氨酸钠(Glutamate monosodium) 5g 5g/L葡萄糖(Glucose) 20g111mM盐类母液(Salts Stock 50×) 20ml 1×矿质母液(Mineral Stock 10,000×) 0.1ml 1×维生素母液(Vitamins Stock 1,000×) 1ml1×腺嘌呤(Adenine 50×) 20ml 1×尿嘧啶(Uracil 50×) 20ml 1×加水定容至1升，固体培养基加琼脂至终浓度为20g/L，10Psi/15-20min灭菌。
3、盐类母液(Salts Stock 50×)组分 添加量(g) 最终浓度(mM)MgCl2-6H2O 53.35.2CaCl2-2H2O 0.735 0.1
KCl 50 13.4Na2SO42 0.28用50ml水分别溶解各组分，混合后定容至1L，冻存或分装成小体积4℃保存。
4、矿物质母液(Mineral Stock 10,000×)组分 添加量(g)最终浓度(μM)H3BO30.5 8.1MnSO40.4 2.37ZnS04-7H2O 0.4 1.39FeCl3-6H2O 0.2 0.74MoO4-2H2O 0.16 0.25KI 0.1 0.6CuS04-5H2O 0.04 0.16柠檬酸(Citric Acid)14.76用5ml水分别溶解各组分，混合后定容至100ml，过滤除菌，冻存或4℃保存。
5、维生素母液(Vitamins Stock 1,000×)组分 添加量(g)最终浓度(μM)烟酸(Nicotinic acid) 181.2肌醇(Inositol)155.5生物素(Biotin)1mg 40.8泛酸(Pantothenic acid)100mg4.2各用10ml水分别溶解各组分，混合后定容至100ml，过滤除菌，冻存或4℃保存。
6、其它成分(Supplements)组分 添加量(g/100ml) 最终浓度(×)精氨酸-HCl(Arginine-HCl) 0.75 100亮氨酸1(Leucine1) 0.75 100赖氨酸-HCl(Lysine-HCl) 0.75 100
谷氨酸钠2(Glutamic monosodium2) 0.75100组氨酸-HCl(Histidine-HCl) 0.75100腺嘌呤(Adenine)0.375 50尿嘧啶(Uracil) 0.375 50在本培养基中，当1是对Leu 1-32时，浓度加至250mg/L。当2是谷氨酸缺陷型时，浓度为75mg/L；glu2.5g/L代替NH4Cl。
本实验的具体操作步骤为1、裂殖酵母在YE液体培养基中，29℃，300rpm摇床中培养至1×107cell/ml，3000rpm离心收集；2、冰冷的1.2M山梨醇(Sorbitol)洗三次后，以1×109cell/ml浓度重悬于1.2M Sorbitol中；3、0.2ml细胞中加入1ng-1μg DNA，迅速转入冰冷的电击杯中；4、设定电击指数2.25kv，200Ω，25μF，电击，通过电击法将载体pREP-Btub1(+)导入裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)S.P.Q-01(Leul-32h-)；5、电击后，迅速加入0.5ml冰冷的1.2M Sorbitol；6、用冰冷的1.2M Sorbitol稀释后(勿超过5倍)，取0.5ml涂到很干的选择性MM培养基平板上，通过MM培养基的选择作用，筛选表达Gh-β-tubulin蛋白的酵母细胞；7、30℃培养4-6天出现菌落。挑取单克隆，提取质粒进一步鉴定是否为转化子；8、接种单菌落(pREP+GhFas和pREP)于5ml含2μM VB1的MM液体培养基(+VB1)中，29℃，300rpm摇床中培养20小时至O.D600＜1.0(0.8最好)；9、均分成两份，室温下，3000rpm离心5分钟；10、用20ml无菌水洗3次，另一份不变；11、洗过的那份转入50mlMM液体培养基；未洗的那份转接入等量的MM液体培养基(+VB1)；12、29℃，300rpm摇床中培养20小时，取20μl对数晚期的培养物放于载玻片上，盖上盖玻片，显微镜高倍镜下观察。
结果如
图1所示，图中A、B、E、D为利用普通明视野显微镜拍摄的照片，F、G、I、J为利用荧光显微镜拍摄的DAPI染色后的细胞照片，其中，A和F含有pREP-BtubL(+)的酵母细胞，非诱导型；B和G含有pREP-BtubL(+)的酵母细胞，非诱导型；E和I含有pREP5N载体的酵母细胞，诱导型；D和I未转化酵母细胞，诱导型，从图中可以看出，正向表达的Gh-β-tubulin基因，能显著地增加酵母细胞的径向长度，表明，Gh-BtubL有刺激酵母细胞伸长的作用，可提高酵母的产量。
序列表<160>2<210>1<211>1580<2 12>DNA<213>棉属陆地棉(Gossypium hirsutum L.)<400>1atgagagaaa tcctccatgt tcaagccggt cagtgtggta atcaaattgg tggcaagttt 60tgggaagtag tatgtgatga acatgggata gatgccactg gtaactatgt cggcacttcg 120cctgttcagc ttgaaaggct taatgtttac tataatgaag ccagtggtgg cagatatgtg 180cctagagctg tgttaatgga tcttgagcca ggaactatgg acagtttacg aacaggtcct 240tatggaaaat tgtttagacc agataacttt gtgttcggcc aaaatggagc tggcaataac 300tgggctaagg gacattatac tgaaggagct gaattgattg attcagttct tgatgttgtt 360cgtaaagagg ctgagaattg tgattgttta caaggttttc aggtttgcca ttcactggga 420ggtggaacag ggtcagggat ggggacattg ttgatatcaa agatcaggga agaataccct 480gaccggatga tgctaacgtt ctcggtgttt ccatcaccta aagtatcgga tactgtggtt 540gaaccctata atgcgaccct gtcagtgcac cagcttgtgg aaaatgctga tgaatgcatg 600gtccttgaca atgaagctct ttatgatatc tgcttcagaa ctcttaagct cacaaatccc 660agctttggtg acttgaacca tttgatttca acaaccatga gtggagtcac atgctgcctt 720cgcttccctg gccaactcaa ttccgatctt cgaaaactag cagtaaactt gatcccattc 780ccacgcctcc attttttcat ggttggtttt gcacctttaa catcccgggg ttcacaacaa 840taccgagctt taacgatccc cgagctaact caacaaatgt gggattccaa aaacatgatg 900tgcgcggctg atcctcgtca tggaaggtac ttaacagcct cggcaatgtt tcgaggcaaa 960atgagcacca aggaagttga tgaacaaatg atcaatgtcc aaaacaagaa ctcttcgtac 1020tttgtggagt ggattccgaa cgatgttaaa tcaagtgttt gcgacatccc accaactggg 1080ttgacgatgt catcgacgtt tatggggaac tcgacatcga tacaagagat gtttcgacgt 1140gtttcggaac agttcacagt gatgtttagg aggaaagcat ttttgcattg gtatacaggg 1200gaagggatgg atgaaatgga gtttactgag gctgaaagta atatgaatga tttggtttct 1260gaatatcaac aatatcaaga tgctgtggtt gatgaagatg gtgaagggta tgaagatgaa 1320gctgaggaaa attgacggaa ttcttttcaa ctttctatag taatggccta ggaaaaaaaa 1380atcaaatatg gtgctcattt tgatggttct aaataaggag gccatgtttt ttcatttgtg 1440ctgggatttt tagtaatgtg aattgtgaat ttgtatattt atatcaaatg tgaattgtga 1500tttaatgaat ttggagtgta aatttatgta atgaatttgg aatcacaagt ttcaaaattt 1560caagacaaaa aaaaaaaaaa 1580<210>2<211>444<212>PRT<213>棉属陆地棉(Gossypium hirsutum L.)<400>2Met Arg Glu Ile Leu His Val Gln Ala Gly Gln Cys Gly Asn Gln1 5 10 15Ile Gly Gly Lys Phe Trp Glu Val Val Cys Asp Glu His Gly Ile20 25 30Asp Ala Thr Gly Asn Tyr Val Gly Thr Ser Pro Val Gln Leu Glu35 40 45Arg Leu Asn Val Tyr Tyr Asn Glu Ala Ser Gly Gly Arg Tyr Val50 55 60Pro Arg Ala Val Leu Met Asp Leu Glu Pro Gly Thr Met Asp Ser65 70 75Leu Arg Thr Gly Pro Tyr Gly Lys Leu Phe Arg Pro Asp Asn Phe80 85 90Val Phe Gly Gln Asn Gly Ala Gly Asn Asn Trp Ala Lys Gly His95 100 105Tyr Thr Glu Gly Ala Glu Leu lle Asp Ser Val Leu Asp Val Val110 115 120Arg Lys Glu Ala Glu Asn Cys Asp Cys Leu Gln Gly Phe Gln Val125 130 135Cys His Ser Leu Gly Gly Gly Thr Gly Ser Gly Met Gly Thr Leu140 145 150Leu Ile Ser Lys Ile Arg Glu Glu Tyr Pro Asp Arg Met Met Leu155 160 165Thr Phe Ser Val Phe Pro Ser Pro Lys Val Ser Asp Thr Val Val170 175 180Glu Pro Tyr Asn Ala Thr Leu Ser Val His Gln Leu Val Glu Asn185 190 195Ala Asp Glu Cys Met Val Leu Asp Asn Glu Ala Leu Tyr Asp Ile200 205 210Cys Phe Arg Thr Leu Lys Leu Thr Asn Pro Ser Phe Gly Asp Leu215 220 225Asn His Leu Ile Ser Thr Thr Met Ser Gly Val Thr Cys Cys Leu230 235 240Arg Phe Pro Gly Gln Leu Asn Ser Asp Leu Arg Lys Leu Ala Val245 250 255Asn Leu Ile Pro Phe Pro Arg Leu His Phe Phe Met Val Gly Phe260 265 270Ala Pro Leu Thr Ser Arg Gly Ser Gln Gln Tyr Arg Ala Leu Thr275 280 285Ile Pro Glu Leu Thr Gln Gln Met Trp Asp Ser Lys Asn Met Met290 295 300Cys Ala Ala Asp Pro Arg His Gly Arg Tyr Leu Thr Ala Ser Ala305 310 315Met Phe Arg Gly Lys Met Ser Thr Lys Glu Val Asp Glu Gln Met320 325 330Ile Asn Val Gln Asn Lys Asn Ser Ser Tyr Phe Val Glu Trp Ile335 340 345Pro Asn Asp Val Lys Ser Ser Val Cys Asp Ile Pro Pro Thr Gly350 355 360Leu Thr Met Ser Ser Thr Phe Met Gly Asn Ser Thr Ser Ile Gln365 370 375Glu Met Phe Arg Arg Val Ser Glu Gln Phe Thr Val Met Phe Arg380 385 390Arg Lys Ala Phe Leu His Trp Tyr Thr Gly Glu Gly Met Asp Glu395 400 405Met Glu Phe Thr Glu Ala Glu Ser Asn Met Asn Asp Leu Val Ser410 415 420Glu Tyr Gln Gln Tyr Gln Asp Ala Val Val Asp Glu Asp Gly Glu426 430 435Gly Tyr Glu Asp Glu Ala Glu Glu Asn440 44权利要求
1.棉花纤维的类β微管蛋白Gh-BtubL，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于它是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质。
3.棉花纤维类β微管蛋白Gh-BtubL的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有85％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述棉花纤维类β微管蛋白Gh-BtubL的编码基因是序列表中序列1的DNA序列。
5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于该基因的读码框为自3’端第1到第1335位碱基。
6.含有权利要求3或4所述基因的表达载体。
7.根据权利要求6所述的载体，其特征在于所述表达载体中还含有启动子。
8.根据权利要求7所述的载体，其特征在于所述启动子为纤维特异性表达启动子、酵母/大肠杆菌的穿梭质粒pREP5N的nmt1启动子或35S启动子。
9.含有权利要求3或4所述基因的细胞系。
10.权利要求3或4所述基因在培育纤维长度增加的植物品种中的应用。
全文摘要
本发明公开了棉花纤维的类β微管蛋白及其编码基因与应用，目的是提供和棉花纤维伸长具有密切相关的类β微管蛋白及其编码基因。本发明所提供的棉花纤维类β微管蛋白的名称为Gh－BtubL，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。棉花纤维类β微管蛋白Gh－BtubL的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有85％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
文档编号A01H1/00GK1478791SQ0212898
公开日2004年3月3日 申请日期2002年8月26日 优先权日2002年8月26日
发明者朱玉贤, 姬生健, 卢迎春, 冯建勋 申请人:北京大学