石蒜碱作为hmgb1蛋白抑制剂的新用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及石蒜碱类化合物技术领域，具体涉及石蒜碱作为HMGBl蛋白抑制剂及治疗多发性骨髓瘤药物的新用途。
【背景技术】
[0002]人类HMGBl由215个氨基酸残基组成，分子量约为25KD，因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的高速迀移率而得名。HMGBl是细胞内高丰度的染色体结合蛋白，其功能相对复杂，除了参与构建核小体、DNA复制、重组、修复和基因转录，还参与多种慢性炎症和自身免疫性疾病的发病机制。在多数炎症性疾病，如脓毒血症、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、动脉粥样硬化、慢性肾病以及肿瘤的发展、侵袭和转移中都可以检测到血清HMGBl高水平表达。
[0003]目前通过重组HMGBl的Box A功能域等HMGBl竞争性拮抗剂，甘草皂苷等天然/合成的小分子HMGBl特异性抑制剂以及HMGBl的特异性抗体、多肽、蛋白质等生物来源物质等多种策略阻止HMGBl的合成、释放并降低其活性，从多种层面发挥HMGBl抑制剂的功能，从而控制HMGBl及其诱导的相关疾病。其中来自传统药物的天然药物不仅对HMGBl具有很好的抑制作用，同时还能调整机体的免疫功能，改善患者的症状与体征，减轻放化疗对癌症患者造成的毒副作用，具有不可比拟的优势。
[0004]自噬是细胞的一种基本应激调控机制，细胞可以通过自噬和溶酶体途径清除、降解和消化细胞、细胞器和变性蛋白质与核酸等大分子物质。自噬能清除肿瘤细胞内过多的损伤细胞器和蛋白等，使肿瘤细胞逃避死亡；但是若自噬过度发生则会导致肿瘤细胞死亡。细胞自噬的这种两面性使自噬与肿瘤治疗的研究成为热点。多发性骨髓瘤(multiplemyeloma, MM)是浆细胞异常增生的恶性肿瘤，是血液系统发病率第二的B细胞肿瘤。目前医学上还没有根治MM的疗法，多是以化疗为主。研究表明自噬与MM发生关系紧密，自噬能通过清除MM细胞分泌的大量胞内折叠蛋白而促进肿瘤发展，还能保护MM细胞在营养缺乏环境中或药物干预过程中免于凋亡。研究发现通过Beclin l_siRNA或氯喹抑制自噬，能导致MM细胞死亡。因此，抑制自噬在MM治疗中是一个有潜力的新策略。
[0005]HMGBl是一种促自噬蛋白，可以增强细胞的存活率并限制程序性细胞的死亡。已发现HMGBl促自噬的机制是在各种应激情况下，HMGBl可从胞核转位至胞质，启动细胞自噬，介导肿瘤细胞对抗癌药物和放疗的抗性。最新研究表明=HMGBl在血液肿瘤细胞系、急性淋巴细胞白血病患儿血清中表达上调，并与病程发展密切相关。HMGBl的异常增加可作为肿瘤细胞及骨髓细胞的标志。
[0006]石蒜碱是一种从石蒜科植物中分离出来的生物碱，不溶于水，在生物体内主要以盐酸石蒜碱的形式存在。研究表明石蒜碱具有镇痛、解热、抗炎、杀菌、抗病毒、抗疟疾和抗肿瘤等多种作用。石蒜碱作为天然化合物，广泛存在于石蒜科植物中，由于资源丰富，成本低廉，药理作用机制多样，且有良好的生物安全性，临床开发利用价值很大。目前没有研究显示石蒜碱具有下调HMGBl蛋白水平的用途。
【发明内容】
[0007]
本发明的目的在于提供石蒜碱作为HMGBl蛋白抑制剂的新用途。
[0008]为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为:石蒜碱作为制备HMGBl蛋白抑制剂的新用途，所述石蒜碱包括石蒜碱或其水合物或药学上可接受的盐。
[0009]优选地，所述石蒜碱药学上可接受的盐为石蒜碱的盐酸盐。
[0010]本发明通过对石蒜碱进行体外活性实验和体内实验，发现石蒜碱对HMGBl蛋白具有较强的抑制作用，且石蒜碱细胞毒性较小，能通过下调HMGBl蛋白水平，达到治疗HMGBl蛋白质表达异常引起的疾病的目的。
[0011]本发明的另一目的在于提供石蒜碱在制备治疗MM药物中的新用途。
[0012]石蒜碱在制备治疗MM药物中的新用途，所述石蒜碱包括石蒜碱或其水合物或药学上可接受的盐。
[0013]优选地，所述石蒜碱药学上可接受的盐为石蒜碱的盐酸盐。与现有技术相比，本发明的有益效果在于:石蒜碱能下调丽细胞中HMGBl蛋白水平，具有选择性抑制多种MM细胞增殖的作用，且细胞毒性较小，可以作为HMGBl蛋白的抑制剂，通过下调HMGBl蛋白水平，达到治疗因HMGBl蛋白质表达异常引起的疾病如MM等，有望被开发为新型的抗肿瘤药物。
【附图说明】
[0014]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0015]图1:不同浓度石蒜碱对正常人永生化B淋巴细胞和丽细胞的存活率的影响； B-cell为正常人永生化B淋巴细胞；ARH-77、ANBL-6、NC1-H929、MM.1S为不同MM细胞系;**p〈0.0l0
[0016]图2:石蒜碱对ARH-77、ANBL-6、NC1-H929和MM.1S细胞自噬水平的影响；
A.Western Blot方法检测不同浓度石蒜碱作用ARH-77、ANBL-6、NC1-H929和MM.1S细胞后自噬关键蛋白LC3B的变化。β-actin为β肌动蛋白，作为内参；B.电镜检测10 μΜ石蒜碱作用ARH-77和ANBL-6细胞24小时后的自噬泡数量；C.将ARH-77和ANBL-6细胞外源性导入pcDNA3.1-LC3-GFP质粒后用荧光显微镜检测细胞中点状聚集数目，**p〈0.01。
[0017]图3 =HMGBl蛋白在正常人永生化B淋巴细胞和石蒜碱作用前后ARH-77和ANBL-6细胞中的变化情况；
A.蛋白质组学方法检测发现5μΜ石蒜碱作用ARH-77细胞后HMGBl蛋白下调，图中箭头所示为HMGBl蛋白；B.Western Blot方法检测HMGBl在正常人永生化B淋巴细胞、ARH-77和ANBL-6细胞中的表达情况。GAPDH为甘油醛_3_磷酸脱氢酶，作为内参；C.Western Blot检测HMGBl蛋白在不同浓度石蒜碱作用ARH-77和ANBL-6细胞后的表达变化，*ρ〈0.05，**ρ〈0.0lo
[0018]图4:石蒜碱作用ARH-77和ANBL-6细胞后HMGBl蛋白在细胞核和细胞浆中的变化情况；
A.Western Blot方法检测不同浓度石蒜碱作用ARH-77和ANBL-6细胞后HMGBl蛋白在细胞核和细胞浆中的表达变化，a-tubulin为α微管蛋白，作为内参；RCCl为染色体浓缩调节因子，仅在细胞核中表达；B.细胞免疫荧光检测10 μ M石蒜碱作用ARH-77 24小时后HMGBl蛋白在细胞核和细胞浆中的变化情况，DAPI为4,，6- 二脒基-2-苯基吲哚，用于染细胞核的标记荧光染料;MERGE指将DAPI染色和HMGBl抗体染色的结果合并。
[0019]图5:ARH-77细胞中HMGBl沉默和石蒜碱作用后自噬相关蛋白的表达变化和细胞存活状况；
A.Western Blot方法检测ARH-77细胞中HMGBl沉默和10 μ M石蒜碱作用后自噬相关蛋白的表达变化，Beclinl为自噬相关蛋白；B.CCK-8方法检测ARH-77细胞中HMGBl沉默和10 μ M石蒜碱作用后细胞存活率的变化，**ρ〈0.01。
[0020]图6:石蒜碱治疗丽裸鼠后的系列变化情况；
Α.石蒜碱治疗MM裸鼠后肿瘤大小变化曲线图，*ρ〈0.05 ；Β.石蒜碱治疗MM裸鼠后肿瘤组织的形态变化；C.石蒜碱治疗MM裸鼠后裸鼠体重的变化；D.HE染色检测石蒜碱治疗MM裸鼠后肿瘤组织的变化；Ε.Western Blot方法检测石蒜碱治疗MM裸鼠后肿瘤组织中HMGBl蛋白和自噬相关蛋白LC3B、Beclinl的表达变化。
【具体实施方式】
[0021 ] 下面结合实验及实验数据，进一步对本说明作详细说明。
[0022]下述实施例中采用的石蒜碱为98%以上纯度的盐酸石蒜碱。
[0023]实施例一:正常细胞与MM细胞敏感性实验
本实施例采用相同浓度的石蒜碱处理正常人永生化B淋巴细胞和MM细胞，用CCK-8方法检测细胞存活状况，来评估不同细胞类型对石蒜碱的敏感性，实验步骤如下:
1、收集对数生长期的ARH-77、ANBL-6、NC1-H929、MM.1S细胞和正常人永生化B淋巴细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 μ L，96孔板铺板，使待测细胞密度为2 X 15个/mL ;
2、设置不加细胞只有培基的调零组以及不加药物适当浓度的DMSO对照组，每个浓度设置3-5个平行孔；
3、分别加入2.5 μ M、5M、10 μ M浓度石蒜碱，置于5%C02，37°C细胞培养箱中孵育24小时；
4、每孔加入10μ LCCK-8溶液，置于37°C条件下避光孵育2小时，用酶标仪在450nm波长测量各孔的OD值，进行统计学分析，计算细胞相对存活率。