[0024]实验结果如图1所示。结果表明，石蒜碱对正常人永生化B淋巴细胞毒性较低，而对丽细胞ARH-77、ANBL-6、NC1-H929和丽.1S的增殖具有明显的抑制效果。且随着石蒜碱作用浓度的增加，MM细胞的存活率下降，具有浓度依赖性效应。
[0025]实施例二:石蒜碱抑制细胞自噬实验
本实施例采用用不同浓度石蒜碱处理ARH-77、ANBL-6、NC1-H929和MM.1S细胞，抑制细胞自噬。然后用Western Blot方法、透射电镜和外源性导入pcDNA3.1-LC3-GFP质粒的方法，进行抑制能力的检测，实验步骤如下:
1、不同浓度石蒜碱作用ARH-77、ANBL-6、NC1-H929和MM.1S细胞后，应用WesternBlot方法检测自噬关键蛋白LC3B的变化；
①收集对数生长期的ARH-77、ANBL-6、NC1-H929和MM.1S细胞，调整细胞悬液浓度为5 X 15个/mL于细胞培养瓶中，总体积为10mL，然后分别加入2.5 μ M、5 μ M、10 μ M浓度的石蒜碱，以对应浓度DMSO处理组作为对照，置于细胞培养箱中孵育24小时；
②收集细胞，用5mLPBS洗2次，每管加入适量体积的RIPA细胞裂解液(含0.5%蛋白酶抑制剂cocktail)混匀后冰上裂解30分钟，冰上超声处理30秒，4°C离心15分钟，吸上清即得到细胞总蛋白；
③用BCA法测定蛋白质浓度；
④将蛋白样品煮沸变性5分钟，用10%SDS-PAGE分离后用NC膜转膜，再用封闭液(PBST溶液配制的5%的脱脂牛奶)室温封闭2小时。加入一抗孵育10-12小时，PBST洗3次，用封闭液稀释的二抗室温孵育2小时，PBST洗3次；
⑤使用ECL显影，凝胶成像系统检测蛋白质LC3B的表达变化；
2、透射电镜法检测10μ M石蒜碱作用ARH-77和ANBL-6细胞24小时后的自噬泡数量;
①收集对数生长期的ARH-77和ANBL-6细胞，调整细胞悬液浓度为5X 15个/mL于细胞培养瓶中，总体积为10mL，然后分别加入2.5 μ M、5 μ M、10 μ M浓度的石蒜碱，以对应浓度DMSO处理组作为对照，置于细胞培养箱中孵育24小时；
②离心收集细胞，加入ImL预冷的2.5%的戊二醛(注意不要将细胞吹散)，于_20°C固定24小时以上。吸去戊二醛，加入2%的锇酸固定2小时；
③按50%、70%、90%、100%浓度梯度的丙酮溶液对细胞进行脱水处理，每一浓度处理10分钟，重复3次。用环氧树脂:纯丙酮为1:1的溶液浸泡24小时；
④弃浸泡液，将Epon812、DDSA,MNA、DMP30按一定比例混合均匀，将组织浸入，60°C下24小时包埋成块；
⑤将包埋块进行修块，半薄切片，用甲苯氨蓝对细胞进行染色，选取实验所需要部分。用超薄切片机进行超薄切片，每片厚约50nm。用硝酸铅和醋酸铀进行双重染色，染色后在透射显微镜下观察自■泡数量；
3、将外源性pcDNA3.1-LC3-GFP质粒导入ARH-77和ANBL-6细胞后用荧光显微镜检测细胞中点状聚集数目；
①收集对数生长期的ARH-77和ANBL-6细胞，调整细胞密度至5X 15个/mL于6孔板，每孔2mL ；
②取I μ g 的 pcDNA3.1-LC3-GFP 质粒和 3 μ L Iipofectamin 分别用 250 μ L opt1-MEM培养基稀释，混匀后每孔加入500 μ L复合物，置于培养箱中孵育24小时；
③加10μ M浓度石蒜碱进行孵育，细胞培养箱中继续培养24小时；
④将孵育好的细胞滴片、封片后，正置荧光显微镜下观察细胞中荧光点状聚集数目。
[0026]实验结果如图2所示，图2Β细胞中白色泡状物为自噬泡。结果表明，不同浓度石蒜碱处理ARH-77、ANBL-6、NC1-H929和丽.1S细胞后，自噬关键蛋白LC3B的表达均呈梯度降低；10 μ M石蒜碱作用ARH-77和ANBL-6细胞24小时后的自噬泡数量比作用前明显减少；10μΜ石蒜碱作用后的ARH-77和ANBL-6细胞中绿色荧光斑点聚集数目明显减少。这些都说明石蒜碱抑制了丽细胞自噬。 实施例二:石蒜喊下调HMGBl蛋白水平的实验
本实施例通过蛋白质组学方法检测不同浓度石蒜碱作用ARH-77细胞后，细胞中HMGBl蛋白下调，然后Western Blot方法验证了不同浓度石蒜碱作用后的ARH-77和ANBL-6细胞HMGBl蛋白均下调，并呈梯度变化。同时通过Western Blot方法检测HMGBl蛋白在正常人永生化B淋巴细胞、ARH-77和ANBL-6细胞中的表达情况，实验步骤如下:
1、通过蛋白质组学方法检测经石蒜碱作用后ARH-77细胞中HMGBl蛋白下调；
①收集对数生长期的ARH-77细胞，调整细胞悬液浓度为5X 15个/mL于细胞培养瓶中，总体积为10mL，然后加入5 μ M浓度石蒜碱，以对应浓度DMSO处理组作为对照，置于细胞培养箱中孵育24小时；
②收集细胞，加入细胞裂解液[8Μ尿素，2Μ硫脲，4%CHAPS, ImM EDTA, 40mMTris, l%Triton X-100，用之前加65mM DTT, ImM苯甲基磺酰氟(PMSF)，ImM蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor Cocktail), DNA 酶，RNA 酶，ImM 磷酸酶抑制剂(phosphataseinhibitor cocktail 2)]，混匀，冰上孵育2小时，期间300W超声两次。15000rpm, 4 °C离心30分钟，吸上清即为细胞总蛋白；
③用BCA法测定蛋白质浓度；
④取蛋白样品加入水化液(8M尿素，2M硫脲，4%CHAPS，65mMDTT, 1%载体两性电解质，1%IPG缓冲液pH3-10，痕量溴酚蓝)充分混合，至总体积为350 μ L，12000 rpm离心10分钟，取上清液加入胶条槽，将IPG干胶条(pH3-10，18cm)放入胶条槽，覆盖矿物油，盖好胶条槽盖子，放置在IPGphor电泳仪上水化和等电聚焦。在20°C自动进行，总电压时间为80000Vh，其中水化在30 V低电压进行12小时，然后经过500V I小时，1000V I小时，3000V I小时，(有时也用5000V I小时，)最后稳定在8000V下进行；
⑤等电聚焦结束后取出胶条，加入平衡液A(50mMTris*HCl，pH8.8、6M尿素、30%甘油、2%SDS、65mM DTT、痕量溴酚蓝)平衡15分钟，然后于平衡液B中(50mM Tris*HCl，pH8.8、6M尿素、30%甘油、2%SDS、2.5%碘乙酰胺、痕量溴酚蓝)平衡15分钟，取出胶条，用双蒸水润洗几秒钟后沥干，准备第二向电泳。将平衡后的IPG干胶条移至第二向12%分离胶上端，并在酸性端加低分子质量SDS标准蛋白质，排净气泡，用0.5%的热琼脂糖凝胶封固胶条，4°C循环水浴冷却。先用16mA /胶恒流电泳，15分钟后换用32mA /胶恒流电泳，直至溴酚蓝到达距离胶底边约l_2cm处终止电泳；
⑥用考马斯亮蓝染色液[G-250、(MM)2SO4、甲酸、磷酸]染色过夜，然后用脱色液(20%乙醇)脱色4次，每次30分钟以上；
⑦染色后的凝胶通过UmaxPowerLcoIcIII扫描仪透射扫描成像，所得图谱用ImageMaster 2D分析软件对图像进行分析；
⑧选择感兴趣差异蛋白，切胶后进行酶解，用美国AppliedB1systems公司的4800plus MALD1-T0F-T0F Analyzer串联飞行时间质谱仪进行分析。获得的混合物肽片段一级和二级质谱数据使用GPS Explore (软件版本号:V3.6，美国Applied B1systems公司)软件进行分析；
2、WesternBlot方法检测HMGBl蛋白在正常人永生化B淋巴细胞、ARH-77和ANBL-6细胞中的表达情况:
①收集对数生长期的正常人永生化B淋巴细胞、ARH-77和ANBL-6细胞，调整细胞悬液浓度为5 X 15个/mL于细胞培养瓶中，总体积为10mL，置于细胞培养箱中孵育24小时；
②收集细胞，提取细胞总蛋白；
③同上述Western免疫方法相同，用于检测HMGBl蛋白的表达情况；
3、Western Blot方法检测不同浓度石蒜碱作用ARH-77和ANBL-6细胞后HMGBl蛋白的表达变化:
①收集对数生长期的ARH-77和ANBL-6细胞，调整细胞悬液浓度为5X 15个/mL于细胞培养瓶中，总体积为10mL，然后分别加入2.5 μ M、5 μ M、10 μ M浓度的石蒜碱，以对应浓度DMSO处理组作为对照，置于细胞培养箱中孵育24小时；
②收集细胞，提取细胞总蛋白；
③同上述Western免疫方法相同，用于检测HMGBl蛋白的表达变化。
[0027]实验结果如图3