所示。结果表明，石蒜碱作用ARH-77细胞后HMGBl蛋白下调；进一步验证发现不同浓度石蒜碱作用ARH-77和ANBL-6细胞后HMGBl蛋白均下调，并呈梯度变化蛋白在ARH-77和ANBL-6细胞中的表达比正常人永生化B淋巴细胞要高。这些说明MM细胞中HMGBl高表达，而石蒜碱能下调HMGBl蛋白水平。
[0028]实施例四:石蒜碱下调细胞核和细胞浆中的HMGBl蛋白水平实验
本实施例用Western Blot、细胞免疫荧光等方法检测石蒜碱下调ARH-77和ANBL-6细胞中细胞核和细胞浆中的HMGBl蛋白水平，实验步骤如下:
1、WesternBlot方法检测不同浓度石蒜碱作用ARH-77和ANBL-6细胞后HMGBl蛋白在细胞浆和细胞核中的变化情况:
①收集对数生长期的ARH-77和ANBL-6细胞，调整细胞悬液浓度为5X 15个/mL于细胞培养瓶中，总体积为10mL，然后分别加入2.5 μ M、5 μ M、10 μ M浓度的石蒜碱，以对应浓度DMSO处理组作为对照，置于细胞培养箱中孵育24小时；
②收集细胞，用PBS洗一次。每20μ?细胞沉淀加入200μ?细胞浆蛋白抽提试剂A(用前加入ImM PMSF)，剧烈振荡5秒，冰浴10-15分钟。加入细胞浆蛋白抽提试剂ΒΙΟμ?。剧烈振荡5秒，冰浴I分钟。剧烈振荡5秒，4°C 12000-16000 rpm，离心5分钟。取上清即为细胞浆蛋白；
③吸尽上清，将剩余沉淀加入50μ?细胞核蛋白抽提试剂(用前加入ImMPMSF)。剧烈振荡15-30秒。冰浴30分钟，其中每隔1-2分钟就剧烈振荡15-30秒。4°C，12000-16000rpm离心10分钟。取上清即为细胞核蛋白；
④同上述Western免疫方法相同，用于检测细胞核和细胞浆中的HMGBl蛋白的变化情况；
2、细胞免疫荧光检测石蒜碱作用ARH-77和ANBL-6细胞后细胞核和细胞浆中的HMGBl蛋白的变化情况:
①收集对数生长期的ARH-77和ANBL-6细胞，调整细胞悬液浓度为5X 15个/mL于细胞培养瓶中，总体积为10mL，然后分别加入10 μ M浓度石蒜碱，以对应浓度DMSO处理组作为对照，置于细胞培养箱中孵育24小时；
②取2mL细胞悬液1500rpm离心5分钟，去上清，PBS洗2次；
③滴片，铺开，用500uL左右多聚甲醛固定10-15分钟，去除后用PBS洗3次，每次10分钟； ④用0.1% triton-100透膜15分钟，PBS洗3次，每次10分钟；
⑤5%BSA封闭30分钟，加一抗4°C孵育过夜，PBS洗3次，每次10分钟。加二抗避光30分钟。PBS洗3次，每次10分钟。DAPI染核10分钟。PBS洗3次，每次10分钟。50%甘油封片，焚光显微镜观察。
[0029]实验结果如图4所示，图4B中DAPI是染细胞核，呈蓝色呈红色，两者图片合并后红色部分指HMGBl蛋白在细胞浆中，绿色部分指HMGBl蛋白在细胞核中，即可看出HMGBl蛋白在细胞核和细胞浆中的变化情况。结果表明，不同浓度石蒜碱作用ARH-77和ANBL-6细胞后，细胞核和细胞浆中的HMGBl蛋白的表达均呈梯度降低；10μΜ石蒜碱作用ARH-77和ANBL-6细胞24小时后HMGBl蛋白在细胞核和细胞浆中荧光强度比作用前明显减弱。这些说明石蒜碱下调丽细胞中细胞核和细胞浆中的HMGBl蛋白水平。
[0030]实施例五:ΜΜ细胞中HMGBl沉默和石蒜碱作用后抑制细胞自噬和存活率实验本实施例通过ARH-77细胞中HMGBl沉默和石蒜碱作用后，用Western Blot和CCK-8
方法检测抑制细胞自噬和存活状况，实验步骤如下:
Uffestern Blot方法检测ARH-77细胞中HMGBl沉默和石蒜碱作用后抑制细胞自噬:
①收集对数生长期的ARH-77细胞，调整细胞密度至5X 15个/mL于6孔板，每孔2mL ;
②取100 nM 的 siHMGBl 和 3 μ L Iipofectamin 分别用 250 μ L opt1-MEM 培养基稀释，混匀后每孔加入500 μ L复合物，置于培养箱中孵育24小时；
③收集对数生长期的ARH-77细胞，调整细胞悬液浓度为5X 15个/mL于细胞培养瓶中，总体积为10mL，然后分别加入10 μ M浓度石蒜碱，以对应浓度DMSO处理组作为对照，置于细胞培养箱中孵育24小时；
④收集上述转染后和未转染的ARH-77细胞，提取细胞总蛋白。同上述Western免疫方法相同，用于检测HMGBl蛋白和自噬相关蛋白LC3B和Beclinl的表达变化；
2、CCK-8方法检测ARH-77细胞中HMGBl沉默和石蒜碱作用后抑制细胞存活状况:
①收集对数生长期的转染后和未转染的ARH-77细胞。调整细胞悬液浓度，每孔加入100 μ L，96孔板铺板，使待测细胞密度为2 X 15个/mL ；
②设置不加细胞只有培基的调零组以及不加药物仅适当浓度的DMSO对照组，每个浓度设置3-5个平行孔；
③将10y M石蒜碱分别加至铺好的未转染细胞的悬液中，置于5% CO2, 37°C细胞培养箱中孵育24小时；
④每孔加入10μ L CCK-8溶液，置于37°C条件下避光孵育2小时，用酶标仪在450nm波长测量各孔的OD值，进行统计学分析，计算细胞相对存活率。
[0031]实验结果如图5所示。结果表明，ARH-77细胞中HMGBl沉默和石蒜碱作用后都能抑制细胞自噬和HMGBl蛋白表达，降低细胞存活率，效果相同。说明石蒜碱通过抑制HMGBl蛋白表达从而抑制丽细胞自噬。
[0032]实施例六:裸鼠动物模型中石蒜碱抗肿瘤实验
本实施例通过构建MM细胞的裸鼠皮下移植瘤模型，给药组给予石蒜碱，在体内水平研究HMGBl蛋白表达变化对石蒜碱抑制MM细胞自噬的影响以及肿瘤变化情况，实验步骤如下:
1、取裸鼠共20只，雌雄各10只。分别取0.2ml MM.1S细胞悬液(细胞总数2X 16个)注入每只裸鼠颈背部皮下，建立MM.1S细胞的裸鼠皮下移植瘤；
2、实验组裸鼠经腹腔注射石蒜碱(5mg/kg)，每天注射一次，连续注射5天；对照组给予相同体积的生理盐水，定期观察裸鼠肿瘤生长状况；
3、比较用石蒜碱治疗后各组的肿瘤大小和裸鼠体重变化情况；
4、肿瘤组织切片后HE染色，光学显微镜下进行形态学观察；
5、对照组和石蒜碱治疗组的肿瘤组织研磨后，提取总蛋白，同上述Western免疫印迹方法相同，检测肿瘤组织中HMGBl蛋白以及自噬相关蛋白LC3B和Beclinl蛋白的表达变化情况。
[0033]实验结果如图6所示。结果表明，石蒜碱治疗后的裸鼠体重变化不明显，肿瘤大小比对照组要小，有显著性差异(P〈0.05);石蒜碱治疗组的肿瘤组织出现核固缩和核碎裂现象；石示示喊治疗后肿瘤组织中HMGBl蛋白、自卩蜜相关蛋白LC3B和Beclinl的表达均下降。说明石蒜碱在体内也是通过抑制HMGBl蛋白表达从而抑制细胞自噬，进而抑制肿瘤的生长。
[0034]综上所述，石蒜碱是一种很好的HMGBl抑制剂，其能有效抑制MM细胞增殖和自噬，有望成为治疗HMGBl表达异常所引起的疾病特别是肿瘤的一类新药。
[0035]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.石蒜碱作为HMGBl蛋白抑制剂的新用途，其特征在于，所述石蒜碱包括石蒜碱或其水合物或药学上可接受的盐。2.根据权利要求1所述的石蒜碱作为HMGBl蛋白抑制剂的新用途，其特征在于，所述石蒜碱药学上可接受的盐为石蒜碱的盐酸盐。3.石蒜碱在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的新用途，其特征在于，所述石蒜碱包括石蒜碱或其水合物或药学上可接受的盐。4.根据权利要求3所述的石蒜碱在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的新用途，其特征在于，所述石蒜碱药学上可接受的盐为石蒜碱的盐酸盐。
【专利摘要】本发明公开了石蒜碱作为HMGB1蛋白抑制剂的新用途。所述石蒜碱包括石蒜碱或其水合物或药学上可接受的盐。本发明通过系列实验，证明了石蒜碱对HMGB1蛋白具有较强的抑制作用，可以作为HMGB1蛋白的抑制剂，通过下调HMGB1蛋白水平，达到治疗因HMGB1蛋白质表达异常引起的疾病如多发性骨髓瘤等，有望被开发为新型的抗肿瘤药物。
【IPC分类】A61P35/00, A61K31/4745
【公开号】CN105193806
【申请号】CN201510593052
【发明人】刘静, 萧小鹃, 胡维新, 罗伊, 梁龙, 罗誉皓, 周卫华
【申请人】中南大学
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年9月17日