专利名称：一种判定微管相关蛋白1轻链3蛋白斑点类型的方法
技术领域：
本发明属于细胞成像技术领域，具体涉及一种判定微管相关蛋白I轻链3蛋白斑点类型的方法。
背景技术：
在自吞噬研究领域，经常需要表征细胞内自吞噬结构。微管相关蛋白I轻链3(LC3)蛋白被认为是一种自吞噬结构的标记性蛋白。通常将荧光(FP)蛋白与LC3融合表达于哺乳动物细胞，以便应用荧光显微镜动态观察自吞噬结构的形成与动态变化。在荧光显微成像中，可见均匀分布于胞浆和细胞核的荧光蛋白-微管相关蛋白I轻链3蛋白(FP-LC3 )分子或分布于胞衆中的斑点状的结构，后者主要代表自吞曬结构。但是，近5年的最新研究结果表明，这些FP-LC3斑点结构并不一定代表自吞噬囊泡结构，也可能代表LC3分子参与的蛋白聚集体(不含膜成分)。有研究表明，LC3的突变体LC3G120A(LC3 DG)可以仅标记蛋白聚集体而不标记自吞噬囊泡结构，因此发展出了利用FP-LC3G120A(FP-LC3 □ G)来作为自吞噬结构的一个阴性对照。然而，现有的研究结果显示，虽然在特定条件下FP-LC3G120A(FP-LC3 □ G)确实主要标记蛋白聚集体而不标记自吞噬结构，但是在某些情况下FP-LC3G120A (FP-LC3 □ G)仍然会进入自吞噬囊泡，从而标记自吞噬结构。这表明，FP-LC3G120A(FP-LC3 □ G)并非一个完美的区分自吞噬结构或者蛋白聚集体的工具。因此，发展出一种判定LC3斑点类型的方法，在活细胞内快速鉴别自吞噬结构与蛋白聚集体，对于提升生物学研究的准确性具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种准确、快速判定LC3斑点类型的方法。本发明所采用的技术方案是:—种判定微管相关蛋白I轻链3蛋白斑点类型的方法，包括以下步骤:(I)将荧光蛋白(FP)与微管相关蛋白I轻链3 (LC3)蛋白融合，转染并表达于哺乳动物细胞中；(2)对步骤(I)得到的哺乳动物细胞进行处理，使哺乳动物细胞内形成荧光蛋白-微管相关蛋白I轻链3蛋白(FP-LC3)斑点；(3)对步骤(2)得到的FP-LC3斑点进行分析，若FP-LC3与哺乳动物细胞胞浆中的FP-LC3存在完全、快速的交换行为，则FP-LC3斑点的类型为蛋白聚集体；若FP-LC3与哺乳动物细胞胞浆中的FP-LC3存在少量或者不存在交换行为，则FP-LC3斑点的类型为自吞噬结构。优选地，所述步骤(3)中，分析方法为荧光漂白后恢复(FRAP)方法。进一步地，所述FRAP方法为:对FP-LC3斑点进行FRAP分析，如果检测FP-LC3斑点的荧光信号的半恢复时间<ls，恢复程度>80%，则表明该FP-LC3斑点是蛋白聚集体。
优选地，所述步骤(3)中，分析方法为荧光激活后重分布(FRAPa)方法。进一步地，所述FRAPa方法为:对FP-LC3斑点进行FRAPa分析，如果检测FP-LC3斑点的荧光信号的半衰减时间<2s，衰减程度>60%，则表明该FP-LC3斑点是蛋白聚集体。优选地，所述步骤(3)是利用荧光显微镜进行观察。本发明具有以下优点:本发明是一种判定LC3斑点类型的方法，该方法的关键在于，观测FP-LC3与哺乳动物细胞胞浆中的FP-LC3是否存在完全、快速的交换行为，如果存在，则表明FP-LC3斑点的类型为蛋白聚集体；若FP-LC3与哺乳动物细胞胞浆中的FP-LC3存在少量或者不存在交换行为，则表明FP-LC3斑点的类型为自吞噬结构。利用本方法可以准确、快速地在活细胞内判定LC3斑点是自吞噬结构还是蛋白聚集体，判定的准确率达到100%，对提升生物学研究的准确性具有重要的应用价值。
图1为本发明实施例1中用FRAPa技术判定puromcyin诱导的dendra2_LC3斑点类型的图；图2为本发明实施例2中阴性对照组(未处理组)的图；图3为本发明实施例2中CQ诱导GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的图；图4为本发明实施例2中rapamycin诱导GFP_LC3/mCherry-LC3G120A斑点的图；图5为本发明实施例2中阴性对照组中细胞内平均GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的统计的图；图6为本发明实施例2中CQ处理组中细胞内平均GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的统计的图；图7为本发明实施例2中rapamycin处理组中细胞内平均GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的统计的图；图8为本发明实施例2中FRAP技术检测CQ诱导的GFP-LC3斑点的类型的图；图9为本发明实施例2中FRAP技术检测rapamycin诱导的GFP-LC3斑点的类型的图；图10为本发明实施例3中LY294002诱导GFP_LC3/mCherry-LC3G120A斑点的图；图11 为本发明实施例 3 中 wortmannin 诱导 GFP_LC3/mCherry-LC3G120A 斑点的图；图12为本发明实施例3中MG-132诱导GFP_LC3/mCherry-LC3G120A斑点的图；图13为本发明实施例3中FRAP技术检测LY294002诱导GFP-LC3+/mCherry-LC3G120A+斑点的GFP-LC3的动力学的图；图14为本发明实施例3中FRAP技术检测wortmannin诱导GFP-LC3+/mCherry-LC3G120A+斑点的GFP-LC3的动力学的图；图15为本发明实施例3中FRAP技术检测MG-132诱导GFP-LC3+/mCherry-LC3G120A+斑点的GFP-LC3的动力学的图；图16为本发明实施例4中atg5-/_MEFs中瞬时表达24小时的GFP-LC3/mCherry_LC3G120A 斑点的图17为本发明实施例4中FRAP技术检测atg5-/_MEFs中GFP-LC3+/mCherry-LC3G120A+斑点的GFP-LC3的动力学的图。
具体实施例方式下面结合附图和实施方式对本发明作进一步详细的说明。实施例1在本实施例中，首先将dendra2光转化蛋白融合的LC3蛋白(dendra2_LC3)转染到HeLa细胞中，过24小时。接着用嘌呤霉素(puromycin)处理细胞2.5小时，均诱导形成了dendra2-LC3斑点。Puromycin是广泛使用的诱导自吞曬斑点形成的试剂。最后用FRAPa方法进行分析。图1是FRAPa技术判定puromcyin诱导的dendra2-LC3斑点类型的图，从图中可以看出，dendra2-LC3标记的蛋白聚集体被光激活后，斑点处荧光有快速的和明显程度的降低。实施例2本实施例中，首先将GFP融合的LC3蛋白(GFP-LC3)和mCherry融合的LC3蛋白(mCherry-LC3G120A)共转染到HeLa细胞，过24小时。接着用嘌呤霉素(Rapamycin)和氯喹(chloroquine,简写为CQ)处理细胞6小时。Rapamycin和CQ是广泛使用的诱导自吞曬斑点形成的试剂。最后利用FRAP方法进行分析，图2为阴性未处理组对照组图，图3为CQ诱导GFP-LC3/mCherry-LC3G120A 斑点的图，图 4 为 rapamycin 诱导 GFP_LC3/mCherry-LC3G120A斑点的图，图5为阴性对照组中细胞内平均GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的统计的图，图6为CQ处理组中细胞内平均GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的统计的图，图7为rapamycin处理组中细胞内平均GFP_LC3/mCherry-LC3G120A斑点的统计的图，图8为FRAP技术检测CQ诱导的GFP-LC3斑点的类型的图，图9为FRAP技术检测rapamycin诱导的GFP-LC3斑点的类型的图。从图2至图9中可以看出，诱导形成了大量的GFP-LC3斑点而非mCherry-LC3G120A斑点，GFP-LC3斑点均没有展示出荧光漂白后恢复的特性，表明这些斑点结构为自噬体结构。图2至图7中，R-LC3-G120A代表mCherry_LC3G120A。实施例3本实施例中，首先将GFP-LC3和mCherry_LC3G120A共转染到HeLa细胞，过24小时。接着用LY294002、渥曼青霉素(wortmannin)和MG132处理细胞6小时。LY294002、wortmannin和MG132是被报道的可以诱导蛋白聚集体的化学试剂。最后利用FRAP方法进行分析，图 10 为 LY294002 诱导 GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的图，图 11 为 wortmannin诱导 GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的图，图 12 为 MG-132 诱导 GFP_LC3/mCherry-LC3G120A斑点的图，图 13 为 FRAP 技术检测 LY294002 诱导 GFP-LC3+/mCherry-LC3G120A+ 斑点的GFP-LC3的动力学的图；图14为中FRAP技术检测wortmannin诱导GFP-LC3+/mCherry-LC3G120A+斑点的GFP-LC3的动力学的图；图15为FRAP技术检测MG-132诱导GFP-LC3+/mCherry-LC3G120A+斑点的GFP-LC3的动力学的图。从图10至图15可以看出，诱导形成了一定量的蛋白聚集体。这些荧光蛋白标记的蛋白聚集体斑点，均展示出快速且几乎完全的荧光漂白后恢复特性，表明这些斑点结构为蛋白聚集体结构。图10至图12中，R-LC3-G120A 代表 mCherry_LC3G120A。实施例4
有报道指出，FP-LC3表达于自吞噬缺陷细胞株永生化的atg5基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(atgS^EFs)中，可形成非自吞噬的斑点。本实施例中，将GFP-LC3和mCherry-LC3G120A共转染到atgS^EFsJA小时后用共聚焦显微镜观察，可见形成了一定量的蛋白聚集体。利用FRAP方法进行分析，图16为BtgS7IffiFs中瞬时表达24小时的GFP-LC3/mCherry-LC3G120A 斑点的图，图 17 为 FRAP 技术检测 atgS^MEFs 中 GFP-LC3+/mCherry-LC3G120A+斑点的GFP-LC3的动力学的图。从图16和图17中可以看出，这些蛋白聚集体斑点均展示出快速且几乎完全的荧光漂白后恢复特性，表明这些斑点结构为蛋白聚集体结构。图 16 和图 17 中 R-LC3-G120A 代表 mCherry-LC3G120A。本发明是一种判定LC3斑点类型的方法，该方法的关键在于，观测若FP-LC3与哺乳动物细胞中胞浆中FP-LC3是否存在完全、快速的交换行为，如果存在，则表明FP-LC3斑点的类型为蛋白聚集体；若FP-LC3与哺乳动物细胞胞浆中的FP-LC3存在少量或者不存在交换行为，则表明FP-LC3斑点的类型为自吞噬结构。利用本方法可以准确、快速在活细胞内快速判定LC3斑点是自吞噬结构还是蛋白聚集体，判定的准确率达到100%，对提升生物学研究的准确性具有重要的应用价值。最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当 中。
权利要求
1.一种判定微管相关蛋白I轻链3蛋白斑点类型的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将荧光蛋白(FP)与微管相关蛋白I轻链3(LC3)蛋白融合，转染并表达于哺乳动物细胞中； (2)对步骤(I)得到的哺乳动物细胞进行处理，使哺乳动物细胞内形成荧光蛋白-微管相关蛋白I轻链3蛋白(FP-LC3)斑点； (3)对步骤(2)得到的FP-LC3斑点进行分析，若FP-LC3与哺乳动物细胞胞浆中的FP-LC3存在完全、快速的交换行为，则FP-LC3斑点的类型为蛋白聚集体；若FP-LC3与哺乳动物细胞胞浆中的FP-LC3存在少量或者不存在交换行为，则FP-LC3斑点的类型为自吞噬结构。
2.根据权利要求1所述的判定微管相关蛋白I轻链3蛋白斑点类型的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，分析方法为荧光漂白后恢复(FRAP)方法。
3.根据权利要求1所述的判定微管相关蛋白I轻链3蛋白斑点类型的方法，其特征在于，所述FRAP方法为:对FP-LC3斑点进行FRAP分析，如果检测FP-LC3斑点的荧光信号的半恢复时间<ls，恢复程度>80%，则表明该FP-LC3斑点是蛋白聚集体。
4.根据权利要求1所述的判定微管相关蛋白I轻链3蛋白斑点类型的方法，其特征在于，所述步骤(3 )中，分析方法为荧光激活后重分布(FRAPa )方法。
5.根据权利要求4所述的判定微管相关蛋白I轻链3蛋白斑点类型的方法，其特征在于，所述FRAPa方法为:对FP-LC3斑点进行FRAPa分析，如果检测FP-LC3斑点的荧光信号的半衰减时间<2s，衰减程度>60%，则表明该FP-LC3斑点是蛋白聚集体。
6.根据权利要求1所述的判定微管相关蛋白I轻链3蛋白斑点类型的方法，其特征在于，所述步骤(3)是利用荧光显微镜进行观察。
全文摘要
本发明公开了一种判定微管相关蛋白1轻链3蛋白斑点类型的方法，属于细胞成像技术领域。该方法是观测荧光蛋白偶联的微管相关蛋白1轻链3蛋白(FP-LC3)斑点，与哺乳动物细胞胞浆中的FP-LC3是否存在完全、快速的交换行为。如果存在，则表明FP-LC3斑点的类型为蛋白聚集体；若FP-LC3与哺乳动物细胞胞浆中的FP-LC3存在少量或者不存在交换行为，则表明FP-LC3斑点的类型为自吞噬结构。利用该方法可以准确、快速判定LC3斑点类型。
文档编号G01N21/64GK103115907SQ20131003192
公开日2013年5月22日 申请日期2013年1月29日 优先权日2013年1月29日
发明者骆清铭, 张智红, 王亮 申请人:华中科技大学