在乳汁中稳定生成的修饰抗体及其制备方法

专利名称：在乳汁中稳定生成的修饰抗体及其制备方法
技术领域：
本发明提供在转基因哺乳动物乳汁中制备抗体的方法。该方法包括提供其体细胞和生殖细胞具有编码序列的转基因哺乳动物，该序列编码至少一个重链和一个轻链以及至少一个绞链区，其中该绞链区已不同于通常与重链恒定区相关的绞链区，以提高所得重组抗体的稳定性和折叠性质。
背景技术：
IgG是成人血清中最丰富的同型抗体，构成约80％总血清免疫球蛋白。IgG是具有四级结构的单体分子，由两条免疫球蛋白Pu重链和两条免疫球蛋白轻链(P2或SE)组成。轻、重免疫球蛋白链一般通过二硫键互联。抗体另外包括富含脯氨酸的绞链区，赋予分子的片段柔性。IgG证明具有多种生物学功能，包括抗原凝集、调理、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、穿越胎盘、补体活化、中和毒素、固定细菌以及中和病毒。
由于缺少效应子功能，IgG4可以用作治疗剂。不幸的是，IgG4抗体具有在酸性处理或非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)下的不稳定特性，可产生80kDa蛋白质(也通称″半分子″)。若无二硫键使两条重链连在一起将产生半分子。
在组织培养中生成IgG4已获各种成功。取决于细胞系，″半分子″IgG4的百分比变化介于5-25％。生成IgG4分子的难题之一在于缺少分离半分子和完整IgG4分子的便利方法。很多生产单位简单相信，在处理过程中将产生不同水平的杂质″半分子″。
发明概述本发明部分基于以下发现，即在转基因动物乳汁中生成抗体可致使多达50％所得抗体处于半分子形式，而通过修饰该抗体的绞链区，可以在该动物的乳汁中获得水平升高的装配型抗体。尽管并非旨在受理论约束，在转基因动物乳汁中发现的半分子水平升高可能部分原因在于，乳腺不能使抗体适当折叠和/或重链之间形成二硫键，但仍能提供有效分泌。通过修饰此类抗体的绞链区，使得半分子水平下降。
因此，本发明一方面特征在于在转基因哺乳动物乳汁中制备抗体的方法。该方法包括提供其体细胞和生殖细胞具有编码序列的转基因哺乳动物，该序列编码外源重链可变区或其抗原结合片段、至少一个重链恒定区或其片段以及绞链区，其与指导在乳腺上皮细胞中表达的启动子可操作(operably)连接，其中该绞链区已经被改变而不同于通常与重链恒定区相关的绞链区。
在一个实施方案中，至少70％、75％、80％、90％或95％的存在于乳汁中的抗体处于装配形式。在另一实施方案中，转基因哺乳动物的体细胞和生殖细胞另外包括编码轻链可变区、或其抗原结合片段以及轻链恒定区或其功能性片段的序列，其与指导在乳腺上皮细胞中表达的启动子可操作连接。
在其它实施方案中，该方法包括从转基因哺乳动物中获得乳汁以提供抗体组合物的步骤。此外，该方法可包括从乳汁中纯化外源抗体的步骤。
所用启动子可以是本领域已知的指导乳腺上皮细胞表达的任何启动子，例如酪蛋白启动子、乳清蛋白启动子、β乳球蛋白启动子或乳清酸性蛋白启动子。在一个优选实施方案中，该转基因动物可以是例如牛、山羊、小鼠、大鼠、绵羊、猪和兔。
该抗体可以是来自任何抗体种类的任何抗体，例如IgA、IgD、IgM、IgE或IgG、或其片段。在一个优选实施方案中，该抗体是IgG抗体，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在另一优选实施方案中，该抗体是IgG4抗体。
本发明涵盖抗体绞链区的各种改变。例如，在一个实施方案中，该抗体绞链区的全部或部分被修饰。在另一实施方案中，该抗体绞链区的全部或部分被替换，例如替换为不同于通常与重链恒定区和/或可变区相关的绞链区的绞链区或其部分。在一个优选实施方案中，具有IgG抗体重链恒定区或其部分的抗体的绞链区可被替换为不同于IgG抗体的抗体的绞链区或其部分。例如，IgG抗体(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体)的绞链区或其部分可被替换为来源于IgA、IgD、IgM、IgE抗体的绞链区或其部分。在另一实施方案中，具有IgG抗体(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体)重链恒定区或其部分的抗体的绞链区或其部分可被替换为来源于另一IgG抗体的绞链区或其部分，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的绞链区可被替换为来源于另一IgG亚类的绞链区。还在另一优选实施方案中，具有IgG4抗体重链恒定区的抗体的绞链区可被替换为来源于IgG1、IgG2或IgG3的绞链区。
还在另一实施方案中，绞链区已被修饰，致使编码该抗体绞链区的核酸序列的至少一个核酸残基不同于通常与该抗体重链恒定区相关的绞链区天然存在的核酸序列。在另一实施方案中，该抗体绞链区的氨基酸序列至少一个氨基酸残基不同于与该抗体重链恒定区天然存在的绞链区的氨基酸序列。
在一个优选实施方案中，该绞链区已被修饰，致使与重链恒定区天然相关的绞链区的一个或多个氨基酸被取代为与不同种类或亚类抗体的重链恒定区相关的绞链区对应位置的氨基酸。优选地，所制备抗体的重链恒定区来自IgG抗体，而绞链区被取代为IgA、IgD、IgM或IgE抗体绞链区的一个或多个氨基酸。在另一优选实施方案中，所制备抗体的重链恒定区来自IgG抗体，例如IgG4抗体，而绞链区被取代为不同亚类抗体(例如IgG1、IgG2和IgG3抗体)绞链区的一个或多个氨基酸。
在另一实施方案中，绞链区除半胱氨酸残基之外的至少一个氨基酸可被替换为半胱氨酸残基。修饰可包括改变抗体的至少一个糖基化位点，例如位于抗体重链或轻链、或重链绞链区。
在另一实施方案中，所制备抗体的重链恒定区来自IgG4抗体，而绞链区的丝氨酸残基可被替换为脯氨酸残基。例如，绞链区氨基酸编号241的丝氨酸残基可被替换为脯氨酸残基。
抗体可以是例如嵌合、人类或人源化抗体或其片段。
在另一实施方案中，该转基因哺乳动物的乳汁基本不含半分子形式的外源抗体。优选地，转基因哺乳动物乳汁中存在的装配型外源性抗体与半分子形式抗体之比为至少2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1或更高(例如20∶1)。
另一方面，本发明特征在于制备其体细胞合生殖细胞包括修饰抗体编码序列的转基因哺乳动物的方法，其中该修饰抗体编码序列编码具有改变的绞链区的抗体分子或其部分。该方法包括将构建体引入哺乳动物的步骤，该构建体包括编码外源重链可变区或其抗原结合片段、至少一个重链恒定区或其片段以及绞链区的序列，与指导在乳腺上皮细胞中表达的启动子可操作连接，其中该绞链区已经改变不同于通常与所制备抗体的重链恒定区相关的绞链区。在一个实施方案中，该绞链区已被改变，致使转基因哺乳动物乳汁中存在的外源抗体至少70％、75％、80％、85％、90％、95％处于装配形式。在另一实施方案中，该构建体包括编码轻链可变区、或其抗原结合片段以及轻链恒定区或其功能性片段的序列，与指导在乳腺上皮细胞中表达的启动子可操作连接。
所用启动子可以是本领域已知的指导乳腺上皮细胞表达的任何启动子，例如酪蛋白启动子、乳清蛋白启动子、β乳球蛋白启动子或乳清酸性蛋白启动子。在一个优选实施方案中，该转基因动物可以是例如牛、山羊、小鼠、大鼠、绵羊、猪和兔。
该抗体可以是来自任何抗体种类的任何抗体，例如IgA、IgD、IgM、IgE或IgG、或其片段。在一个优选实施方案中，该抗体是IgG抗体，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在另一优选实施方案中，该抗体是IgG4抗体。
本发明涵盖抗体绞链区的各种改变。例如，在一个实施方案中，抗体绞链区的全部或部分被修饰。在另一实施方案中，该抗体绞链区的全部或部分被替换，例如替换为不同于通常与重链恒定区和/或可变区相关的绞链区的绞链区或其部分。在一个优选实施方案中，该重链恒定区或其部分来自IgG，该抗体的绞链区可被替换为不同于IgG抗体的抗体的绞链区或其部分。例如，IgG抗体(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体)的绞链区或其部分可被替换为来源于IgA、IgD、IgM、IgE抗体的绞链区或其部分。在另一实施方案中，具有IgG抗体(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体)重链恒定区或其部分的抗体的绞链区或其部分可被替换为来源于另一IgG抗体的绞链区或其部分，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的绞链区可被替换为来源于另一IgG亚类的绞链区。还在另一优选实施方案中，具有IgG4抗体重链恒定区的抗体的绞链区可被替换为来源于IgG1、IgG2或IgG3的绞链区。
还在另一实施方案中，绞链区已被修饰，致使编码该抗体绞链区的核酸序列的至少一个核酸残基不同于通常与该抗体重链恒定区相关的绞链区天然存在的核酸序列。在另一实施方案中，该抗体绞链区的氨基酸序列至少一个氨基酸残基不同于与该抗体重链恒定区天然存在的绞链区的氨基酸序列。
在一个优选实施方案中，该绞链区已被修饰，致使与重链恒定区天然相关的绞链区的一个或多个氨基酸被取代为与不同种类或亚类抗体的重链恒定区相关的绞链区对应位置的氨基酸。优选地，所制备抗体的重链恒定区来自IgG抗体，而绞链区被取代为IgA、IgD、IgM或IgE抗体绞链区的一个或多个氨基酸。在另一实施方案中，所制备抗体的重链恒定区来自IgG抗体，例如IgG4抗体，而绞链区被取代为不同种类抗体(例如IgG1、IgG2和IgG3抗体)绞链区的一个或多个氨基酸。
在另一实施方案中，绞链区除半胱氨酸残基之外的至少一个氨基酸可被替换为半胱氨酸残基。修饰可包括改变抗体的至少一个糖基化位点，例如位于抗体重链或轻链、或重链绞链区。
在另一实施方案中，所制备抗体的重链恒定区来自IgG4抗体，而绞链区的丝氨酸残基可被替换为脯氨酸残基。例如，IgG4抗体绞链区氨基酸编号241的丝氨酸残基可被替换为脯氨酸残基。
抗体可以是例如嵌合、人类或人源化抗体或其片段。
在另一实施方案中，该转基因哺乳动物的乳汁基本不含半分子形式的外源抗体。优选地，转基因哺乳动物乳汁中存在的装配型外源性抗体与半分子形式抗体之比为至少2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1或更高(例如20∶1)。在优选实施方案中，该绞链区已被改变，致使转基因哺乳动物乳汁中存在的外源性抗体至少70％、75％、80％、85％、90％、95％处于装配形式。
本发明涵盖本领域技术人员已知的将抗体编码序列引入转基因动物的所有方法。例如，编码抗体部分(例如重链可变区、轻链可变区、重链恒定区、轻链恒定区等)的编码序列可按单独的构建体引入，位于单独的启动子控制下，例如控制乳腺上皮细胞表达的单独启动子。单个启动子可以是相同类型的乳腺上皮细胞启动子(例如两个构建体都包括酪蛋白启动子)或不同类型的乳腺上皮细胞启动子(例如一个构建体包括酪蛋白启动子，另一包括β-乳球蛋白启动子)。因此，在一个相关实施方案中，本发明提供了制备能够在其乳汁中表达装配型外源性抗体或其部分的转基因哺乳动物的方法，包括如下步骤在哺乳动物中引入包括连接指导乳腺上皮细胞中表达的启动子的编码外源抗体轻链的序列的构建体，以及在哺乳动物中引入包含连接指导乳腺上皮细胞中表达的启动子的编码突变的外源抗体重链或其部分的序列的构建体。在另一实施方案中，该构建体包括编码突变的重链的序列以及编码轻链可变区或其抗原结合片段和轻链恒定区或其功能性片段的序列。编码突变的重链的序列以及编码轻链或其部分的序列可操作地连接指导乳腺上皮细胞表达的不同启动子，或置于相同启动子控制之下。例如，该修饰抗体编码序列可以是多顺反子，例如重链编码序列和轻链编码序列可在两者之间具有内部核糖体进入位点(internalribosome entry site，IRES)。处于单独启动子控制之下时，启动子可处于相同类型乳腺上皮细胞启动子控制之下(例如序列均处于β-酪蛋白启动子控制之下)或各处于不同类型乳腺上皮细胞启动子控制之下(例如一个序列处于β-酪蛋白启动子控制之下，另一序列处于β-乳球蛋白启动子控制之下)。
在另一实施方案中，本发明提供了制备能够在其乳汁中表达装配型外源抗体的转基因哺乳动物的方法，该方法包括以下步骤提供来自转基因哺乳动物的细胞，其体细胞和生殖细胞包括与指导哺乳动物上皮细胞中表达的启动子可操作连接的外源抗体轻链编码序列并在细胞中引入包含与指导哺乳动物上皮细胞中表达的启动子可操作连接的外源抗体突变的重链或其部分的编码序列的构建体，其中该重链或其部分包括的绞链区已不同于通常与重链恒定区相关的绞链区。在另一实施方案中，本发明提供了制备能够在其乳汁中表达装配型外源抗体的转基因哺乳动物的方法，包括以下步骤提供来自转基因哺乳动物的细胞，其体细胞和生殖细胞包括与在哺乳动物上皮细胞中指导表达的启动子可操作连接的外源抗体突变的重链或其部分的编码序列，并在细胞中引入包含与在哺乳动物上皮细胞中指导表达的启动子可操作连接的外源抗体轻链编码序列的构建体。
另一方面，本发明特征在于能够在乳汁中表达外源抗体的转基因哺乳动物，其中该转基因哺乳动物的体细胞和生殖细胞包括与在乳腺上皮细胞中指导表达的启动子可操作连接的编码外源重链可变区或其抗原结合片段、至少一个重链恒定区或其片段以及绞链区的修饰抗体编码序列，其中绞链区已经改变不同于通常与所制备抗体的重链恒定区相关的绞链区。
所用启动子可以是本领域已知的指导在乳腺上皮细胞表达的任何启动子，例如酪蛋白启动子、乳清蛋白启动子、β乳球蛋白启动子或乳清酸性蛋白启动子。在一个优选实施方案中，该转基因动物可以是例如牛、山羊、小鼠、大鼠、绵羊、猪和兔。
该抗体可以是来自任何抗体种类的任何抗体，例如IgA、IgD、IgM、IgE或IgG、或其片段。在一个优选实施方案中，该抗体是IgG抗体，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在另一优选实施方案中，该抗体是IgG4抗体。
本发明涵盖抗体绞链区的各种改变。例如，在一个实施方案中，抗体绞链区的全部或部分被修饰。在另一实施方案中，该抗体绞链区的全部或部分被替换，例如替换为不同于通常与重链恒定区和/或可变区相关的绞链区的绞链区或其部分。在一个优选实施方案中，具有IgG抗体重链恒定区或其部分的抗体的绞链区可被替换为不同于IgG抗体的抗体的绞链区或其部分。例如，IgG抗体(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体)的绞链区或其部分可被替换为来源于IgA、IgD、IgM、IgE抗体的绞链区或其部分。在另一实施方案中，具有IgG抗体(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体)重链恒定区或其部分的抗体的绞链区或其部分可被替换为来源于另一IgG抗体的绞链区或其部分，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的绞链区可被替换为来源于另一IgG亚类的绞链区。还在另一优选实施方案中，具有IgG4抗体重链恒定区的抗体的绞链区可被替换为来源于IgG1、IgG2或IgG3的绞链区。
还在另一实施方案中，绞链区已被修饰，致使编码该抗体绞链区的核酸序列的至少一个核酸残基不同于通常与该抗体重链恒定区相关的绞链区天然存在的核酸序列。在另一实施方案中，该抗体绞链区的氨基酸序列至少一个氨基酸残基不同于与该抗体重链恒定区天然存在的绞链区的氨基酸序列。
在一个优选实施方案中，该绞链区已被修饰，致使与重链恒定区天然相关的绞链区的一个或多个氨基酸被取代为与不同种类或亚类抗体的重链恒定区相关的绞链区对应位置的氨基酸。优选地，所制备抗体的重链恒定区来自IgG抗体，而绞链区被取代为IgA、IgD、IgM或IgE抗体绞链区的一个或多个氨基酸。更优选地，所制备抗体的重链恒定区来自IgG抗体，例如IgG4抗体，而绞链区被取代为不同种类抗体(例如IgG1、IgG2和IgG3抗体)绞链区的一个或多个氨基酸。
在另一实施方案中，绞链区除半胱氨酸残基之外的至少一个氨基酸可被替换为半胱氨酸残基。修饰可包括改变抗体的至少一个糖基化位点，例如位于抗体重链或轻链、或重链绞链区。
在另一实施方案中，所制备抗体的重链恒定区来自IgG4抗体，而绞链区的丝氨酸残基可被替换为脯氨酸残基。例如，绞链区氨基酸编号241的丝氨酸残基可被替换为脯氨酸残基。
抗体可以是例如嵌合、人类或人源化抗体或其片段。
在另一实施方案中，该转基因哺乳动物的乳汁基本不含半分子形式的外源抗体。优选地，转基因哺乳动物乳汁中存在的装配型外源性抗体与半分子形式抗体之比为至少2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1或更高(例如20∶1)。
在优选实施方案中，该绞链区已被改变，致使转基因哺乳动物乳汁中存在的外源抗体至少70％、75％、80％、85％、90％、95％处于装配形式。在另一实施方案中，该修饰抗体编码序列另外包括编码轻链可变区或其抗原结合片段以及轻链恒定区或其功能性片段的序列。轻链可变区或其抗原结合片段以及轻链恒定区或其功能性片段可能可操作连接指导在乳腺上皮细胞中表达的启动子，或受与外源重链可变区、重链恒定区(或其部分)以及绞链区编码序列相同的启动子控制。例如，该修饰抗体编码序列可以是多顺反子，例如在重链编码序列和轻链编码序列两者之间具有内部核糖体进入位点(IRES)。
另一方面，本发明提供包括乳汁成分和此处所述抗体成分的组合物。优选地，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％外源抗体处于装配形式。在另一实施方案中，该绞链区已被改变，致使组合物中存在的外源抗体至少70％、75％、80％、85％、90％、95％处于装配形式。
该抗体可以是来自任何抗体种类的任何抗体，例如IgA、IgD、IgM、IgE或IgG、或其片段。在一个优选实施方案中，该抗体是IgG抗体，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在另一优选实施方案中，该抗体是IgG4抗体。
本发明涵盖抗体绞链区的各种改变。例如，在一个实施方案中，抗体绞链区的全部或部分被修饰。在另一实施方案中，该抗体绞链区的全部或部分被替换，例如替换为不同于通常与重链恒定区和/或可变区相关的绞链区的绞链区或其部分。在一个优选实施方案中，具有IgG抗体重链恒定区或其部分的抗体的绞链区可被替换为不同于IgG抗体的抗体的绞链区或其部分。例如，IgG抗体(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体)的绞链区或其部分可被替换为来源于IgA、IgD、IgM、IgE抗体的绞链区或其部分。在另一实施方案中，具有IgG抗体(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体)重链恒定区或其部分的抗体的绞链区或其部分可被替换为来源于另一IgG抗体的绞链区或其部分，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的绞链区可被替换为来源于另一IgG亚类的绞链区。还在另一优选实施方案中，具有IgG4抗体重链恒定区的抗体的绞链区可被替换为来源于IgG1、IgG2或IgG3的绞链区。
还在另一实施方案中，绞链区已被修饰，致使编码该抗体绞链区的核酸序列的至少一个核酸残基不同于通常与该抗体重链恒定区相关的绞链区天然存在的核酸序列。在另一实施方案中，该抗体绞链区的氨基酸序列至少一个氨基酸残基不同于与该抗体重链恒定区天然存在的绞链区的氨基酸序列。
在一个优选实施方案中，该绞链区已被修饰，致使与重链恒定区天然相关的绞链区的一个或多个氨基酸被取代为与不同种类或亚类抗体的重链恒定区相关的绞链区对应位置的氨基酸。优选地，所制备抗体的重链恒定区来自IgG抗体，而绞链区被取代为IgA、IgD、IgM或IgE抗体绞链区的一个或多个氨基酸。更优选地，所制备抗体的重链恒定区来自IgG抗体，例如IgG4抗体，而绞链区被取代为不同种类抗体(例如IgG1、IgG2和IgG3抗体)绞链区的一个或多个氨基酸。
在另一实施方案中，绞链区除半胱氨酸残基之外的至少一个氨基酸可被替换为半胱氨酸残基。修饰可包括改变抗体的至少一个糖基化位点，例如位于抗体重链或轻链、或重链绞链区。
在另一实施方案中，所制备抗体的重链恒定区来自IgG4抗体，而绞链区的丝氨酸残基可被替换为脯氨酸残基。例如，绞链区氨基酸编号241的丝氨酸残基可被替换为脯氨酸残基。
抗体可以是例如嵌合、人类或人源化抗体或其片段。
在另一实施方案中，该转基因哺乳动物的乳汁基本不含半分子形式的外源抗体。优选地，转基因哺乳动物乳汁中存在的装配型外源性抗体与半分子形式抗体之比为至少2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1或更高(例如20∶1)。
在另一优选实施方案中，该组合物基本不含乳汁成分，例如一种或多种乳汁成分按体积重量比低于10％、5％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％。乳汁成分的例子包括酪蛋白、脂类(例如可溶性脂类和磷脂)、乳糖及其它小分子(例如半乳糖、葡萄糖)、小肽(例如微生物肽、抗生物肽)以及其它乳汁蛋白质(例如乳清蛋白质，诸如β-乳球蛋白和α-乳清蛋白、乳铁蛋白(lactoferrin)以及血清白蛋白)。
另一方面，本发明提供包括编码序列的核酸，该序列编码重链可变区或其抗原结合部分、重链恒定区或其片段以及绞链区，与指导在乳腺上皮细胞中表达的启动子可操作连接，其中该绞链区已经改变不同于通常与重链恒定区相关的绞链区。
所用启动子可以是本领域已知的指导乳腺上皮细胞表达的任何启动子，例如酪蛋白启动子、乳清蛋白启动子、β乳球蛋白启动子或乳清酸性蛋白启动子。重链可变区或其抗原结合部分、重链恒定区或其片段以及绞链区可以来自任何抗体种类的任何抗体，例如IgA、IgD、IgM、IgE或IgG或其片段。在一个优选实施方案中，该抗体是IgG抗体，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在另一优选实施方案中，该抗体是IgG4抗体。
本发明涵盖绞链区的各种改变。例如，在一个实施方案中，绞链区的全部或部分被修饰。在另一实施方案中，绞链区的全部或部分被替换，例如替换为不同于通常与重链恒定区和/或可变区相关的绞链区的绞链区或其部分。在一个优选实施方案中，具有IgG抗体重链恒定区或其部分的抗体的绞链区可被替换为不同于IgG抗体的抗体的绞链区或其部分。例如，IgG抗体(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体)的绞链区或其部分可被替换为来源于IgA、IgD、IgM、IgE抗体的绞链区或其部分。在另一实施方案中，具有IgG抗体(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体)重链恒定区或其部分的抗体的绞链区或其部分可被替换为来源于另一IgG抗体的绞链区或其部分，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的绞链区可被替换为来源于另一IgG亚类的绞链区。还在另一优选实施方案中，具有IgG4抗体重链恒定区的抗体的绞链区可被替换为来源于IgG1、IgG2或IgG3的绞链区。
还在另一实施方案中，绞链区已被修饰，致使编码该抗体绞链区的核酸序列的至少一个核酸残基不同于通常与重链恒定区相关的绞链区天然存在的核酸序列。在另一实施方案中，绞链区的氨基酸序列至少一个氨基酸残基不同于与该抗体重链恒定区天然存在的绞链区的氨基酸序列。
在一个优选实施方案中，绞链区已被修饰，致使与重链恒定区天然相关的绞链区的一个或多个氨基酸被取代为与不同种类或亚类抗体的重链恒定区相关的绞链区对应位置的氨基酸。优选地，所制备抗体的重链恒定区来自IgG抗体，而绞链区被取代为IgA、IgD、IgM或IgE抗体绞链区的一个或多个氨基酸。在另一优选实施方案中，所制备抗体的重链恒定区来自IgG抗体，例如IgG4抗体，而绞链区被取代为不同种类抗体(例如IgG1、IgG2和IgG3抗体)绞链区的一个或多个氨基酸。
在另一实施方案中，绞链区除半胱氨酸残基之外的至少一个氨基酸可被替换为半胱氨酸残基。修饰可包括改变抗体的至少一个糖基化位点，例如位于抗体重链或轻链、或重链绞链区。
在另一实施方案中，所制备抗体的重链恒定区来自IgG4抗体，而绞链区的丝氨酸残基可被替换为脯氨酸残基。例如，绞链区氨基酸编号241的丝氨酸残基可被替换为脯氨酸残基。
抗体可以是例如嵌合、人类或人源化抗体或其片段。
在某些实施方案中，核酸可以是多顺反子，例如重链编码序列和轻链编码序列例如通过在两者之间具有内部核糖体进入位点(IRES)而处于相同启动子控制之下。
附图简述

图1显示通过核转移制备克隆动物的方法的略图。
图2显示利用KMK917进行的有关绞链区修饰的分析概述。
图3A显示分离的KMK抗体样品的CEx-HPLC图。
图3B显示分离的KMK抗体样品的CEx-HPLC图。
图3C显示分离的KMK抗体样品的CEx-HPLC图。
图3D显示分离的KMK抗体样品的CEx-HPLC图。
图3E显示分离的KMK抗体样品的CEx-HPLC图。
图3F显示分离的KMK抗体样品的CEx-HPLC图。
图3G显示分离的KMK抗体样品的CEx-HPLC图。
图4A显示KMK野生型样品±内切糖苷酶F处理的CEx-HPLC图，野生型。
图4B显示KMK野生型样品±内切糖苷酶F处理的CEx-HPLC图，野生型。
图4Cc显示KMK野生型样品±内切糖苷酶F处理的CEx-HPLC图，绞链及CH2突变体。
图4D KMK野生型样品±内切糖苷酶F处理的CEx-HPLC图，绞链及CH2突变体。
图5A显示KMK917 1099/2010糖特性的CEx-HPLC图，野生型。
图5B显示KMK917 2012/2014糖特性的CEx-HPLC图，绞链+Ch2突变体。
图5C显示KMK917糖特性的CEx-HPLC图，全范围。
详细说明下列缩写在本说明书中具有指定含义缩写词体细胞核转移(Somatic Cell Nuclear Transfer，SCNT)培养的内细胞团细胞(Cultured Inner Cell Mass Cells，CICM)核转移(Nuclear Transfer，NT)合成的输卵管液(Synthetic Oviductal Fluid，SOF)胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)高压液相层析(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)术语解释牛-属于或关于牛的不同种类。
山羊-属于或关于山羊的不同种类。
细胞偶联体(couplet)-融合和/或活化之前的去核卵母细胞及体细胞或胚胎细胞核体。
细胞松弛素B-某些真菌的代谢产物，可选择性、可逆性阻断胞质分裂而不影响核分裂。
胞质体-真核细胞的细胞质物质。
融合片-平行电极的玻璃片，置于相隔的固定距离。细胞偶联体置于电极之间，以获得电流供融合和活化。
核体-通过去核从细胞中获得的细胞核，由一窄圈细胞质和质膜环绕。
核转移-或″核移植″是指将核从供体细胞移植到去核卵母细胞的克隆方法。
绵羊-属于或关于绵羊。
单性生殖-从卵母细胞不经精子穿透而发育成胚。
猪-属于、关于或类似于猪。
重构胚-重构胚是通过去核程序移去其遗传物质的卵母细胞。通过融合事件将成体或胚胎体细胞的遗传物质置入卵母细胞而被″重构″。选择剂-可作为细胞选择标志的化合物、组合物或分子，能够杀伤和/或阻止不含合适抗性基因的活的生物体或细胞的生长。根据本发明，此类制剂包括但不限于新霉素、嘌呤霉素、zeocin、潮霉素、G418、9-[1，3-二羟-2丙氧甲基]鸟嘌呤(gancyclovir)和FIAU。优选地，本发明提高选择剂的剂量可杀死只含有一个整合位点的所有细胞系(例如杂合子动物和/或细胞)。
体细胞-生物体除生殖细胞外的任何细胞。
体细胞核转移-也称治疗性克隆，通过该过程使体细胞与去核卵母细胞融合。体细胞核提供遗传信息，而卵母细胞提供营养及其它为胚胎发育所需的产能物质。一旦发生融合，细胞便具全能性，并最终发育为囊胚泡，此时分离内细胞团。
转基因生物-经实验转入另一生物遗传物质的生物，以致除其遗传互补物中已存在的遗传信息之外，宿主染色体获得所转基因的遗传信息。有蹄类动物-属于或关于典型的有蹄食草quadraped的哺乳动物，包括但不限于绵羊、猪、山羊、牛和马。
异种移植-涉及使用一种动物来源的活细胞、组织和器官移植或植入另一动物种类(一般是人)或用于临床离体灌注的任何过程。
发明详述本发明涉及在转基因哺乳动物乳汁中制备抗体。本发明的各个方面涉及抗体及抗体片段、在转基因哺乳动物乳汁中制备抗体或其片段的方法以及制备其体细胞和生殖细胞包括修饰抗体编码序列的转基因哺乳动物的方法。还提供了用于在乳腺上皮细胞中表达该修饰抗体编码序列的核酸序列。
为使本发明更易于理解，定义某些术语。在整个详细说明中陈述定义。
抗体及其片段此处所用抗体″种类″是指五种主要的抗体同种型，包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。抗体″亚类″是指特定种类抗体根据该类成员间氨基酸差异的亚分类，例如确定为IgG的抗体种类可分为例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类，而确定为IgA的抗体种类可分为例如IgA1和IgA2亚类。
术语″抗体″是指包含至少一个并优选两个重链(H)可变区(此处缩写VH)、至少一个并优选两个轻链(L)可变区(此处缩写VL)以及至少一个并优选两个重链恒定区的蛋白质。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为″互补决定区″(complementarity determining regions，CDR)，与称为″框架区″(framework regions，FR)的更保守区域相间。框架区和CDR的范围已被准确界定(参见Kabat，E.A等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH PublicationNo.91-3242以及Chothia，C等人(1987)J.Mol.Biol.196901-917，此处引入供参考)。每一VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按下列顺序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
抗体可另外包括轻链恒定区，从而形成免疫球蛋白重链和轻链。在一个实施方案中，抗体是两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的四聚体，其中重、轻免疫球蛋白链通过例如二硫键互联。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。重链和轻链可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体恒定区一般介导抗体结合宿主组织或因子、包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)以及经典补体系统的第一成分(Clq)。
抗体可另外包括绞链区，如下文详述。此处所用″装配型″抗体是其重链相互结合的抗体，例如通过二硫键互联。每一重链绞链区包括至少一个、通常数个半胱氨酸残基。在装配型抗体中，重链的半胱氨酸残基经调整，以致能够在绞链区的半胱氨酸残基间形成二硫键，将两条重-轻链的异二聚体共价结合在一起。因此，完全装配型抗体因其具有两个抗原结合位点而为二价体。此处所用术语″抗体″(或″免疫球蛋白″)也指全长抗体的片段，诸如F(ab′)2片段，这是二价片段，包含由绞链区二硫桥连接的两个Fab片段。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并按完整抗体相同的方式筛选有用片段。
抗体的″抗原结合片段″(或″功能性片段″)是指保持特异性结合抗原能力的抗体的一个或多个部分。术语抗体的″抗原结合片段″所包含的结合片段的例子包括一个或多个互补决定区(CDR)。
此处所用″嵌合抗体重链″是指该抗体重链具有与特定物种抗体重链对应氨基酸序列至少85％、优选90％、95％、99％或以上相同、或属于特定抗体种类或类型的抗体重链部分(例如可变区)，而抗体重链的其余片段(例如恒定区)与另一抗体分子的对应氨基酸序列基本相同。例如，重链可变区具有与某一物种抗体(例如″供体″抗体，如啮齿类抗体)的重链可变区基本相同的序列，而恒定区与另一物种抗体(例如″受体″抗体，如人类抗体)的恒定区基本相同。供体抗体可以是体外产生的抗体，例如通过噬菌体展示产生的抗体。
术语″人源化″或″CDR-移植″的轻链可变区是指抗体轻链包含一个或多个CDR、或具有不多于一个或两个氨基酸残基不同于某一物种、或抗体种类或类型(例如″供体″抗体(例如非人类(通常为小鼠或大鼠)免疫球蛋白、或体外生成的免疫球蛋白))的对应一个或多个CDR的氨基酸序列；以及框架区与不同物种、或抗体种类或类型的受体抗体框架(例如天然存在的免疫球蛋白框架(例如人类框架)或共有框架)对应部分具有约85％或更高、优选90％、95％、99％或更高的一致性的氨基酸序列。在某些实施方案中，框架区包括与受体抗体轻链可变区框架(例如天然存在的抗体框架(例如人类框架)或共有框架)至少约60、更优选约70个氨基酸残基一致。
″异源抗体″或″外源抗体″是通常不由哺乳动物生成、或通常不在乳腺中生成(例如仅存在于血清中的抗体)、或虽在乳腺中生成但在其生成中表达水平增加或增强的抗体。
此处所述任何抗体，例如嵌合、人源化或人类抗体，可包括对其序列更多的修饰，例如通过添加、缺失或替换(例如保守性替换)来修饰序列。
抗体绞链区本发明方法涉及例如在转基因动物乳汁中生成抗体，其中绞链区已改变而不同于通常与该抗体重链恒定区相关的绞链区。此类恒定区此处也称为″突变的重链恒定区″。术语″通常相关″是指绞链区和重链恒定区在天然存在抗体中的关联。此处所用术语″天然存在″是指可在自然中例如自然生物中发现的抗体。例如，自然生物中存在的、未被人为故意修饰的抗体或其片段是为天然存在。该术语还指抗体绞链区和重链恒定区的至少一部分(例如CH1区)之间的关联，如果发现该重链恒定区部分与绞链区在抗体中一起″天然存在″。该术语不仅限于自然中发现的重链恒定区。链恒定区可包括修饰，例如替换、插入或缺失一个或多个氨基酸。通常互相关联的IgG绞链区和重链恒定区(或其部分)的例子包括IgG1抗体绞链区和相同IgG1抗体的重链恒定区(或其部分)；IgG2抗体绞链区和相同IgG2抗体的重链恒定区(或其部分)；IgG3抗体绞链区和相同IgG3抗体的重链恒定区(或其部分)；IgG4抗体绞链区和相同IgG4抗体的重链恒定区(或其部分)。这些例子是非限制性的，该术语也适用于其它种类的抗体。
此处所用抗体″绞链区″是指抗体CH1和CH2结构域之间的一段肽序列。绞链区存在于抗体的Fab和Fc部分之间。绞链区通常由独特外显子编码，并包含连接抗体两条重链片段的二硫键。参见Paul等人Fundamental Immunology，3rdEd.(1993)。绞链区的氨基酸序列通常富含脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基。例如，IgG、IgD和IgA的CH1和CH2结构域之间的延伸肽序列富含脯氨酸。IgM和IgE抗体包括约110个氨基酸的具有绞链样特征的结构域(Ruby，J.，Immunology(1992))，包括在此处所用术语″绞链区″中。
绞链区的氨基酸序列可包括半胱氨酸残基。半胱氨酸残基在链间二硫键形成中起作用。根据抗体的种类，在抗体绞链区可有2-11个重链间二硫键。这些二硫键负责将完整抗体分子的两部分保持在一起。各个种类和亚类抗体的绞链区为本领域已知。
改变标准的分子生物学技术可用于提供具有改变的绞链区的抗体。这些技术可用于在抗体绞链区(或抗体序列的其它部分)的已知氨基酸序列中创造改变，例如缺失、插入或替换。术语″改变的″是指在抗体绞链区或其部分内造成的任何变化。此类变化包括但不限于缺失、插入和替换/取代绞链区的一个或多个或全部氨基酸。熟练的专业人员应当理解，任何适当的技术，诸如定向或随机诱变技术，可用于在绞链区提供特异性的序列或突变。此类技术也可用于改变抗体的其它区域，例如重链和/或轻链恒定和/或可变区。
例如，寡核苷酸介导的诱变是用于制备DNA替换、缺失和插入变体的有用方法，参见例如Adelman等人(DNA2183，1983)。简言之，通过将编码突变的寡核苷酸与DNA模板杂交而改变目的DNA，其中模板是包含目的蛋白质未改变或天然DNA序列的单链形式的质粒或噬菌体。杂交以后，使用DNA聚合酶合成模板的完整第二互补链，因而掺入寡核苷酸引物并在目的蛋白质DNA中编码所选择的变化。一般使用至少25个核苷酸长度的寡核苷酸。最佳的寡核苷酸在编码突变的核苷酸的每一侧具有与模板完全互补的12-15个核苷酸。这可确保寡核苷酸严格地与单链DNA模板分子杂交。寡核苷酸容易使用本领域已知技术合成，例如Crea等人所述(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，755765)。
例如，在一个实施方案中，抗体绞链区或绞链区片段被替换为来自不同抗体(例如不同种类或亚类抗体)的另一绞链区或绞链区片段。在一个优选实施方案中，IgG4绞链区被替换为来自不同亚类的绞链区，例如IgG2绞链区。例如，利用编码包含IgG2绞链区的外显子的寡聚物，使用寡核苷酸介导的诱变，可以进行此类替换。在另一实施方案中，绞链区内(例如IgG4绞链区)的单个氨基酸被替换为不同的氨基酸，例如在不同亚类绞链区对应位置发现的氨基酸(例如IgG2绞链区的氨基酸)。例如，在氨基酸241位发现的丝氨酸可被替换为脯氨酸(在IgG2绞链区对应位置发现的氨基酸)。使用引起氨基酸改变的寡聚物(例如oligo S241P)，可以利用寡核苷酸介导的诱变制造替换。在另一实施方案中，抗体例如IgG4抗体的糖基化位点被改变，例如改变为不再作为糖基化位点。例如，可以改变N连接糖基化位点，使天冬酰胺变为谷氨酰胺。寡核苷酸介导的诱变还可用于实现这种变化，例如通过使用可致氨基酸改变的寡聚物。
提供改变蛋白质的方法的另一例子，盒式诱变，是基于Wells等人所述技术(Gene，34315)。起始物质是包括待突变蛋白质亚单位DNA的质粒(或其它载体)。确认待突变蛋白质亚单位DNA中的密码子。在所确认的突变位点的每一侧必须存在唯一的限制性内切酶位点。如果不存在此类限制性位点，则必须使用上述寡核苷酸介导诱变方法引入目的蛋白质亚单位DNA的合适位置，形成此类位点。将限制性位点引入质粒以后，在这些位点酶切质粒线性化。使用标准方法合成在限制性位点之间编码DNA序列、而包含所需突变的双链寡核苷酸。分别合成双链，然后使用标准方法彼此杂交。该双链寡核苷酸称为盒(cassette)。该盒设计为具有与线性化质粒末端相对等的3′和5′端，因而可以直接连接到质粒。该质粒因而包含突变的目的蛋白质亚单位DNA序列。
本发明另外包含也可以使用编码抗体或其片段的DNA的随机诱变来制备具有改变的绞链区的抗体。有用的方法包括但不限于PCR诱变、饱和诱变以及制备和使用一组简并寡核苷酸序列。这些方法已知。
转基因哺乳动物此处所用″转基因动物″是非人动物，该动物的一种或多种、优选基本全部细胞包含通过人为干预方式引入的异源核酸，诸如通过本领域已知的转基因技术。转基因可以通过精细的遗传操作，诸如显微注射或重组病毒感染，引入细胞前体，从而直接或间接引入细胞中。
术语″转基因″是指核酸序列(编码例如一种或多种抗体多肽或其部分)，对其引入的转基因动物或细胞而言部分或完全异源，即外源；或者，与其引入的转基因动物或细胞的内源性基因同源，但被设计为插入或已插入动物基因组中，以致改变了所插入细胞的基因组(例如插入到不同于天然基因的位置)。转基因可包括一种或多种转录调节序列及任何其它核酸，诸如内含子，可能为所选编码抗体的核酸例如在乳腺中的最佳表达和分泌所必需，均可操作连接所选抗体核酸，并可能包括增强子序列和/或隔离子序列。抗体序列可有效连接组织特异性启动子，例如引起转基因哺乳动物乳汁中分泌蛋白质的乳腺特异性启动子序列。
此处所用术语″转基因细胞″是指包含转基因的细胞。此处哺乳动物定义为除人类以外具有乳腺并产乳的所有动物。本发明可利用任何非人哺乳动物。优选的非人哺乳动物为反刍动物，例如牛、绵羊、骆驼或山羊。优选的非人动物的其它例子包括牛、马、骆驼和猪。例如，本领域已知制备转基因山羊的方法。可以通过显微注射将转基因引入山羊种系，例如Ebert等人(1994)Bio/Technology 12699所述，在此引入供参考。根据整体健康良好、胚胎产量高、胚胎中前核可见度好以及生殖健康，选择实施本发明所用任何动物的特定品系。此外，单倍型是一个重要因素。
产生非人转基因哺乳动物的方法为本领域已知。该方法可包括将DNA构建体引入哺乳动物种系来制备转基因哺乳动物。例如，可能通过标准转基因技术将构建体的一个或若干拷贝并入哺乳动物胚胎的基因组中。此外，可以使用体细胞作为供体细胞制备非人转基因哺乳动物。然后将体细胞基因组插入卵母细胞，卵母细胞经融合、活化，形成重构胚胎。例如，使用体细胞制备转基因哺乳动物的方法如下所述，PCT公开WO 97/07669；Baguisi等人NATURE BIOTECH.，vol.17(1999)，456-461；Campbell等人NATURE，vol.380(1996)，64-66；Cibelli等人SCIENCE，vol.280(1998)；Kato等人SCIENCE，vol.282(1998)，2095-2098；Schnieke等人SCIENCE，vol.278.(1997)，2130-2133；Wakayama等人NATURE，vol.394(1998)，369-374；Well等人BIOL.REPROD.，vol.57(1997)385-393。
转染细胞系可以使用遗传工程细胞系制备转基因动物。可通过常规转化或转染技术，将遗传工程构建体引入细胞。此处所用术语″转染″和″转化″包括将转基因序列引入宿主细胞的各种技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质转染或电穿孔。此外，可如下所述使用生物学载体，例如病毒性载体。在Sambrook等人MolecularCloningA Laboratory Manuel，2nded.，Cold Spring HarborLaboratory，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989)及其它合适的实验室手册中可以找到转化或转染宿主细胞的适当方法。
两种有用的方法为电穿孔和脂质转染。各自简要实例如下所述。
通过电穿孔可将DNA构建体稳定引入供体细胞系，使用以下程序体细胞，例如成纤维细胞，例如胚胎成纤维细胞以约4×106细胞/mL重悬于PBS中。将50μg线性化DNA加入0.5mL细胞悬液中，并将悬液置于0.4cm电极间隙的小槽中(Biorad)。使用Biorad GenePulser electroporator，按330V电压、25mA、1000μF以及无穷大电阻进行电穿孔。如果该DNA构建体包含新霉素抗性基因供选择之用，则利用350μg/mL G418(GibcoBRL)温育15天，选择新霉素抗性克隆。
DNA构建体可以通过脂质稳定引入供体体细胞系，使用例如下列程序将约2×105细胞接种于3.5cm直径的微孔中，使用″LipfectAMINETM″(GibcoBRL)转染2μg线性化DNA。转染48小时以后，按1∶1000和1∶5000分离细胞，如果DNA构建体包含新霉素抗性基因供选择之用，则加入终浓度0.35mg/mL G418。分离新霉素抗性克隆并扩增，供深低温保藏及核转移。
DNA构建体编码异源蛋白质的盒可装配成构建体，其包括特定组织例如乳腺上皮细胞的启动子(例如酪蛋白启动子，如山羊β酪蛋白启动子)、乳汁特异性信号序列(例如酪蛋白信号序列，如β-酪蛋白信号序列)以及编码异源蛋白质的DNA。
构建体还包括编码非分泌型蛋白质的DNA序列下游的3′非翻译区。此区域可以稳定表达系统的RNA转录物，从而提高该表达系统目的蛋白质产量。在本发明所用构建体中有用的3′非翻译区是提供多聚腺苷酸信号的序列。该序列可能来自例如SV40小t抗原、酪蛋白3′非翻译区或本领域已知的其它3′非翻译序列。一方面，3′非翻译区来自乳汁特异性蛋白质。3′非翻译区的长度并不重要，其多聚腺苷酸转录物的稳定作用在稳定该表达序列的RNA中显得重要。
可选地，该构建体可包括介于启动子和信号序列编码DNA序列之间的5′非翻译区。该非翻译区可来源于启动子所出自的相同控制区，或来源于不同基因，例如可能来源于其它合成、半合成或天然来源。其特定长度仍不重要，但似乎有益于提高表达水平。
构建体也可包括优选于乳腺上皮细胞中表达基因约10％、20％、30％或更多的N端编码区。例如，N端编码区可对应于所用启动子，例如山羊β酪蛋白N端编码区。
可以使用本领域已知方法制备构建体。构建体可制备成较大质粒的一部分。此种制备使得可以按有效方式克隆和选择正确的构建体。构建体可以位于质粒常规限制性位点之间，以便容易与质粒其余序列分离而引入目的哺乳动物。
隔离子(insulator)序列用于制备转基因动物的DNA构建体可包括至少一个隔离子序列。此处术语″隔离子″、″隔离子序列″和″隔离子元件″可交换使用。隔离子元件是隔离处于其作用范围内基因的转录、而不扰乱(不论负面或正面)基因表达的控制元件。优选地，将隔离子序列插入待转录DNA序列的任一侧。例如，隔离子可位于启动子5′约200bp-1kb以及目的基因3′端至少离启动子约1kb-5kb。本领域技术人员根据构建体中所用目的基因、启动子和增强子的相对大小，可以确定隔离子序列与启动子和目的基因3′端的距离。此外，多于一个隔离子序列可位于启动子5′端、或转基因3′端。例如，两个或多个隔离子序列可位于启动子5′端。转基因3′端的一个或多个隔离子可位于目的基因3′端，或位于3′调节序列例如3′非翻译区(UTR)或3′侧翼序列的3′端。
优选的隔离子是包括鸡β-珠蛋白座位5′端的DNA片段，并对应于PCT公开94/23046所述鸡5′组成型超敏位点，其内容在此引入供参考。
在乳腺中表达蛋白质希望在转基因动物特定组织或体液例如乳汁中表达异源蛋白质，例如抗体。从其表达的组织或体液中回收异源蛋白质。例如，本发明的异源蛋白质(例如抗体)可以在转基因动物乳汁中表达。在乳腺特异性启动子控制下生成异源蛋白质的方法如下所述。
乳腺特异性启动子和信号序列有用的转录启动子是优先在乳腺上皮细胞中活化的启动子，包括控制乳汁蛋白质编码基因的启动子，例如酪蛋白、β乳球蛋白(Clark等人(1989)BIO/TECHNOLOGY 7487-492)、乳清酸性蛋白质(Gordon等人(1987)BIO/TECHNOLOGY 51183-1187)以及乳清蛋白(Soulier等人(1992)FEBS Letts.29713)。酪蛋白启动子可能来自任何哺乳动物物种的α、β、γ或κ酪蛋白基因；优选的启动子来自山羊β酪蛋白基因(DiTullio，(1992)BIO/TECHNOLOGY 1074-77)。启动子也可来自乳铁蛋白或嗜乳脂蛋白(butyrophin)。乳腺特异性蛋白质启动子或在乳腺组织中特异性活化的启动子可以来源于cDNA或基因组序列。优选起源于基因组。
可以在至少一个、通常若干生物中获得上文所列乳腺特异性基因的DNA序列信息。参见例如Richards等人J.BIOL.CHEM.256，526-532(1981)(大鼠α-乳清蛋白)；Campbell等人NUCLEIC ACIDS RES.12，8685-8697(1984)(大鼠WAP)；Jones等人J.BIOL.CHEM.260，7042-7050(1985)(大鼠β-酪蛋白)；Yu-Lee & Rosen，J.BIOL.CHEM.258，10794-10804(1983)(大鼠γ-酪蛋白)；Hall，BIOCHEM.J.242，735-742(1987)(人α-乳清蛋白)；Stewart，NUCLEIC ACIDSRES.12，389(1984)(牛αs1和κ酪蛋白cDNA)；Gorodetsky等人GENE 66，87-96(1988)(牛β-酪蛋白)；Alexander等人EUR.J.BIOCHEM.178，395-401(1988)(牛κ-酪蛋白)；Brignon等人FEBS LETT.188，48-55(1977)(牛αS2酪蛋白)；Jamieson等人GENE 61，85-90(1987)，Ivanov等人BIOL.CHEM.Hoppe-Seyler 369，425-429(1988)；Alexander等人NUCLEIC ACIDS RES.17，6739(1989)(牛β-乳球蛋白)；Vilotte等人BIOCHIMIE 69，609-620(1987)(牛α-乳清蛋白)。Mercier & Vilotte，J.DAIRY Sci.76，3079-3098(1993)综述了各种乳汁蛋白质基因的结构和功能(全文引入以供各种参考)。若其它侧翼序列可用于优化异源蛋白质的表达，则可以使用现有序列为探针克隆此类序列。使用已知的同源核酸序列或同源蛋白质的抗体为探针，通过筛选某生物的文库，可以获得不同生物的乳腺特异性调节序列。
有用的信号序列为引起真核或原核蛋白质分泌的乳汁特异性信号序列或其它信号序列。优选该信号序列选自乳汁特异性信号序列，即来自分泌到乳汁中的产物的编码基因。优选该乳汁特异性信号与构建体中所用乳腺特异性启动子有关，如下所述。信号序列的大小并不重要。所需的只是足够大小的序列，以便例如在乳腺组织中有效分泌目的重组蛋白质。例如，可以使用酪蛋白例如α、β、γ或κ酪蛋白、β乳球蛋白、乳清酸性蛋白以及乳清蛋白编码基因的信号序列。
可以将编码异源抗体例如修饰的IgG4抗体的盒装配成构建体。例如，该构建体可包括特定组织(例如乳腺上皮细胞)的启动子(例如酪蛋白启动子)、乳汁特异性信号序列(例如酪蛋白信号序列)以及编码异源抗体(例如修饰的IgG4抗体)的DNA。可以使用本领域已知方法制备该构建体。该构建体可制备成较大质粒的一部分。此种制备使得可以按有效方式克隆和选择正确的构建体。构建体可以位于质粒方便的限制性位点之间，以便容易与质粒其余序列分离而引入目的哺乳动物。
卵母细胞可以在动物生殖周期的不同时间获得卵母细胞。可以获得细胞周期不同阶段的卵母细胞，然后体外诱导进入特定的减数分裂阶段。例如，在血清缺乏培养基中培养的卵母细胞停滞于中期。此外，通过血清活化可以诱导停滞的卵母细胞进入末期。
在用于形成重构胚之前，卵母细胞可以体外成熟。此过程通常需要从哺乳动物卵巢(例如山羊卵巢)中收集未成熟的卵母细胞，并在去核之前使卵母细胞在培养基中成熟，直至达到所需减数分裂阶段，例如中期或末期。此外，可以使用体内成熟的卵母细胞来形成重构胚。
可以在雌性哺乳动物超排卵期间收集卵母细胞。简言之，可以通过冲洗雌性供体的输卵管，手术回收卵母细胞，例如山羊卵母细胞。诱导山羊超排卵并收集山羊卵母细胞的方法于此处所述。
转移重构胚可以将重构胚转移给受体并使其发育成克隆或转基因哺乳动物。例如，通过伞部(fimbria)将重构胚转移到每一受体的输卵管内腔中。此外，将胚胎转移到受体哺乳动物的方法为本领域已知，并描述于例如Ebert等人(1994)Bio/Technology 12699。
从乳汁中纯化蛋白质此处所用制备物是指两种或多种抗体分子。该制备物可由一种或一种以上的转基因动物生成。可以包括不同糖基化的分子，或就此而言是均一的。
此处所用″纯化的制备物″、″基本纯的抗体制备物″或″分离的抗体″是指基本不含转基因哺乳动物乳汁中所含物质的抗体。优选抗体也与纯化所用物质分离，例如凝胶基质如聚丙烯酰胺。在一个实施方案中，术语″基本不含″包括具有少于约30％(按干重)的非抗体物质(此处也称为″乳汁杂质″或″乳汁成分″)、更优选少于约20％非抗体物质、更优选少于10％非抗体物质约、最优选少于非抗体物质约5％的抗体制备物。非抗体物质包括酪蛋白、脂类(例如可溶性脂类和磷脂)、乳糖及其它小分子(例如半乳糖、葡萄糖)、小肽(例如微生物肽、抗生物肽)以及其它乳汁蛋白质(例如乳清蛋白质，诸如乳球蛋白和β-乳清蛋白、乳铁蛋白以及血清白蛋白)。抗体优选构成纯化制备物干重的至少10、20、50、70、80或95％。优选该制备物包含至少1、10或100μg抗体；至少1、10或100mg抗体。此外，该纯化制备物优选包含约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％的装配型抗体。
可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化方法分离抗体(或其片段)。例如，可以利用Kutzko等人方法(美国专利6,268,487)纯化本发明的抗体和/或片段。
通常利用组合方法分离乳汁蛋白质。例如，首先分级未加工乳汁以去除脂肪，例如通过撇乳、离心、沉降(H.E.Swaisgood，Developments in Dairy Chemistry，inCHEMISTRY OF MILK PROTEIN，Applied Science Publishers，NY，1982)、酸沉淀(美国专利#4,644,056)或利用凝乳酶或胰凝乳蛋白酶进行酶促凝集(Swaisgood，ibid.)。然后，将主要的乳汁蛋白质分级为澄清溶液或松散沉淀，便于从中纯化特异性目的蛋白质。另一例子，法国专利#2,487,642描述了通过膜超滤联用排阻层析或离子交换层析，从脱脂乳或乳清中分离乳汁蛋白质。首先利用粗制凝乳酶(rennet)或乳酸凝集，去除酪蛋白，制备乳清。美国专利#4,485,040描述了利用两步连续超滤，从乳清分离保留物中富含α-乳球蛋白的产物。美国专利4,644,056通过pH4.0-5.5酸性沉淀以及连续切向流过滤，先用0.1-1.2微米孔径的膜使产物澄清，然后利用分离界限5-80kd的膜浓缩，提供了从乳汁或初乳中纯化免疫球蛋白的方法。美国专利#4,897,465教导了利用带有pH变化的金属氧化物膜进行连续超滤，从血清、卵黄或乳清中浓缩并富集蛋白质，例如免疫球蛋白。过滤首先在低于所选蛋白质等电点(pI)的pH下进行，从蛋白质保留物中去除大部分杂质，然后在高于所选蛋白质pI的pH下保留杂质，使所选蛋白质通过而到达穿透液中。欧洲专利EP 467 482 B 1阐释了不同的过滤浓缩方法，将脱脂乳降低到pH3-4，低于乳汁蛋白质的pI，以溶解酪蛋白和乳清蛋白质。然后利用连续三轮超滤或渗滤浓缩蛋白质，形成包含15-20％固体的保留物，其中90％是蛋白质。
另一例子先使乳汁澄清。典型的澄清方法包括以下步骤(a)利用2.0M精氨酸-HCl pH5.5按2∶1稀释乳汁；(b)将稀释样品在离心机中于4-8℃旋转约20分钟；(c)冰上冷却样品约5分钟，使脂肪于上方凝固；(d)用吸管尖端″抽吸″上层，去除脂肪垫；以及
(e)将上清倾入干净管中。
使用本领域已知的任何蛋白质纯化方法，例如上述方法，进行蛋白质的进一步纯化。
实施例实施例1抗体修饰可以使用寡核苷酸诱变来修饰抗体重链。简言之，通过将编码突变的寡核苷酸与DNA模板杂交而改变目的DNA，其中模板是包含目的蛋白质未改变或天然DNA序列的单链形式的质粒或噬菌体。杂交以后，使用DNA聚合酶合成模板的完整第二互补链，因而掺入寡核苷酸引物并在目的蛋白质DNA中编码所选择的变化。一般使用至少25个核苷酸长度的寡核苷酸。最佳的寡核苷酸在编码突变的核苷酸的每一侧具有与模板完全互补的12-15个核苷酸。这可确保寡核苷酸严格地与单链DNA模板分子杂交。寡核苷酸容易使用本领域已知技术合成，例如Crea等人所述(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，755765)。
为实现绞链区氨基酸编号241处丝氨酸到脯氨酸的改变，可利用将丝氨酸变为脯氨酸的oligo S241P进行寡核苷酸诱变。所得突变形式可用于产生转基因小鼠。转基因小鼠可产乳，测试乳汁中存在的抗体以及″半分子″的相对数量。IgG4抗体绞链区以及用于诱变的寡核苷酸S241P序列如下IGG4绞链区1668 TCTGCA GAG TCC AAA TAT GGT CCC CCA TGC CCA TCA TGC CCAGGTAAGCCAACCCAGGCCT1RSGlu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys ProS241P OLIGOGGT CCC CCA TGT CCT CCC TGC CCA GGT AAG CCARSGly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Lys Pro此外，IgG抗体的整个绞链区可以替换为另一抗体的绞链区。为实现这种改变，可以使用编码包含替换绞链区的外显子的寡核苷酸。
IgG4抗体绞链区以及包含IgG2替换绞链区的寡核苷酸的序列如下IGG4绞链区1662 CTTCTCTCTGCA GAG TCC AAA TAT GGT CCC CCA TGC CCA TCA TGC CCA GGTCCGCCAACCCAGGC1RSGlu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys ProIGG2绞链区1729 CTTCTCTCTGCA GAG CGC AAA TGT TGT GTC GAG TGC CCA CCG TGC CCA GGTCCGCCAACCCAGGC1RSGlu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro使用可引起共有位点中天冬酰胺改变为谷氨酰胺的寡聚物，通过寡核苷酸诱变可以去除IgG重链CH2的N-连接糖基化位点。实现这一改变的寡核苷酸序列如下2014 GAG GAG CAG TTC CAG TCT ACT TAC CGA GTG GTC1RSGlu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val测试突变型抗体将轻链和突变重链连接到酪蛋白启动子，用于产生转基因小鼠。然后测试小鼠中抗体和半抗体的表达。
转基因动物通过转移注射了构建体的山羊受精卵，可以制成起始(founder，Fo)转基因山羊。此部分遵循的方法可用于产生转基因山羊。熟练的专业人员应当理解，可以修改这些方法用于其它动物。
山羊种类和品系瑞士起源的山羊，例如Alpine、Saanen和Toggenburg品系，可用于生产转基因山羊。
下文所述部分简单描述了制备转基因山羊所需步骤。这些步骤包括雌性山羊超排卵、与多产雄性交配以及收集受精胚。单细胞受精胚的前核一经收集便显微注射DNA构建体。将来自一个雌性供体的所有胚胎放在一起，如有可能转移到单个雌性受体。
山羊超排卵第0天通过皮下6mg诺甲醋孕酮(norgestomet)耳部植入物(Syncromate-B，CEVA Laboratories，Inc.，Overland Park，KS)，使供体动情周期时相同步。起初7-9天后给予前列腺素，关闭内源性孕酮的合成。从插入植入物后第13天开始，肌内给予总共18mg促滤泡激素(FSH-Schering Corp.，Kenilworth，NJ)，每天两次，注射3天。第14天去除植入物。去除植入物24小时后，使供体动物与多产雄性在两天内交配数次(Selgrath等人，Theriogenology，1990.pp.1195-1205)。
胚胎收集繁育后第2天(或去除植入物后72小时)，进行胚胎收集手术。手术前36小时，超排卵雌山羊去除食物和水。给予雌山羊0.8mg/kg地西泮(Diazepam，Valium)，IV，然后立即给予5.0mg/kg氯胺酮(Ketamine，Keteset)，IV。手术期间通过气管内管道在2L/分钟的氧气中给予氟烷(Halothane)(2.5％)。通过中线剖腹术切口将生殖道外置。计数黄体、直径大于6mm的未破裂卵泡以及卵巢胞囊，评价超排卵结果，并预测通过输卵管冲洗将收集到的胚胎数目。将插管置于输卵管口，用单个临时3.0Prolene缚线固定。将20号计量注射针置于子宫内距离子宫输卵管接合处约0.5cm。用10-20mL无菌磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗插管的输卵管，并收集到培养皿中。对侧重复该过程，然后将生殖道放回腹部。闭合之前，腹腔内倒入10-20mL无菌甘油盐溶液，防止粘连。利用2.0Polydioxanone或Supramid的简单间断缝术闭合腹白线，用无菌缝合夹闭合皮肤。
在立体显微镜下从PBS输卵管冲洗物中收集山羊受精卵，然后用购自Sigma包含10％肽牛血清(FBS)的Ham′s F12培养基(Sigma，St.Louis，MO)洗涤。如果看得见前核，则胚胎立即进行显微注射。如果看不见前核，则将胚胎置于包含10％FBS的Ham′s F12中，在含5％CO2空气的增湿气室中37℃短期培养，直至可见前核(Selgrath等人，Theriogenology，1990.pp.1195-1205)。
显微注射程序将单细胞山羊胚放在凹玻片上的油下培养基微滴中。在带有固定平台的Zeiss正置显微镜下，使用Normarski光学装置，将具有两个可见前核的受精卵固定于经火焰抛光的挟持微量吸管。使用精细玻璃显微针，利用注射缓冲液(Tris-EDTA)中的目的DNA构建体显微注射前核，例如包含可操作连接山羊β-酪蛋白基因调节元件的目的编码序列的BC355载体(Selgrath等人，Theriogenology，1990.pp.1195-1205)。
胚的发育显微注射后，将存活的胚置于包含10％FBS的Ham′s F12培养物中，然后在含5％CO2空气的增湿气室中37℃温育，直至受体动物准备胚胎转移(Selgrath等人，THERIOGENOLOGY，1990.p.1195-1205)。
受体准备利用6mg诺甲醋孕酮耳部植入物(Syncromate-B)诱导受体动物动情周期同步化。插入植入物后第13天，给予动物单次非超排卵性注射(400I.U.)Sigma孕母血清促性腺素(PMSG)。雌性受体与输精管切除的雄性交配，以确保动情周期同步(Selgrath等人，THERIOGENOLOGY，1990.pp.1195-1205)。
胚胎转移将来自同一雌性供体的所有胚胎放在一起，如有可能转移给单个受体。手术过程与上述胚胎收集所述相同，只是输卵管不插管，胚胎处于最小体积包含10％FBS的Ham′s F12中，使用玻璃微量吸管通过伞部转移到输卵管内腔。认为卵巢排卵点多于6-8个的动物不适合作为受体。切口闭合及术后管理与供体动物相同(参见例如Selgrath等人，Theriogenology，1990.pp.1195-1205)。
监控妊娠及分娩首日停止动情周期后45天，通过超声图像检查确定妊娠。第110天进行第二次超声检查，确认妊娠并评估胎音。第130天怀孕受体母山羊接种破伤风类毒素和梭状芽胞杆菌C&D。IM给予硒和维生素E(Bo-Se)，SC给予伊维菌素(Ivermectin)。第145天将母山羊移到干净畜栏，让其在大约第147天诱产前适应该环境。第147天用40mgPGF2a(Lutalyse，Upjohn Company，Kalamazoo Michigan)诱导分娩。此注射为IM给予两次剂量，一次20mg剂量，然后4小时后20mg剂量。第147天首次注射Lutalyse后全天定期观察母山羊。次日晨开始，将观察增加到间隔30分钟。分娩于首次注射后30-40小时发生。分娩后为母山羊挤乳，以收集初乳，并确认胎盘娩出。
确认F0动物的转基因性质为筛选转基因F0动物，从两种不同细胞系中分离基因组DNA，以避免遗漏任何嵌合(mosaic)的转基因。嵌合动物定义为并非在每一细胞中都具有至少一个转基因拷贝的任何山羊。因此，取2日龄F0动物耳组织样品(中胚层)和血液样品，分离基因组DNA(Lacy等人，ALABORATORY MANUAL，1986，Cold Springs Harbor，NY；以及Herrmann和Frischauf，METHODS ENZYMOLOGY，1987.152pp.180-183)。使用引物SPECIFIC FOR HUMAN DECORIN GENE AND BY SOUTHERN BLOTANALYSIS(THOMAS，PROC Natl.Acad.Sci.，1980.775201-5205)、随机引发的人核心蛋白聚糖cDNA探针(Feinberg和Vogelstein，Anal.Bioc.，1983.132pp.6-13)，利用聚合酶链式反应分析DNA样品(Gould等人，Proc.Natl.Acad.Sci，1989.86pp.1934-1938)。评价分析敏感性为检测10％体细胞中一个转基因拷贝。
生产畜群的产生和选择上述方法可用于产生转基因起始(F0)山羊及其它转基因山羊。转基因F0山羊起始者，例如若为雌性，则饲养产乳，或若为雄性，则产生转基因雌性后代。此转基因雄性起始者可以与非转基因雌性繁育，产生转基因雌性后代。
转基因及相关特征的传递利用PCR及Southern印迹分析耳组织和血液，分析目的转基因在山羊家系中的传递。例如，Southern印迹分析雄性起始者及3只转基因后代，显示代间没有重排及拷贝数变化。由人核心蛋白聚糖cDNA探针探测Southern印迹。利用Betascope 603分析印迹，通过比较转基因与山羊β酪蛋白内源性基因，确定拷贝数。
评价表达水平使用酶学分析或Western印迹，测定转基因动物乳汁中转基因蛋白质的表达水平。
实施例2抗体绞链区改变的小鼠模型为核查转基因动物产生重组治疗性抗体的可行性，在转基因小鼠乳腺中表达抗体KMK917的cDNA。然后从小鼠乳汁中纯化KMK917，并与来源于KMK917转染的Sp2/0细胞补料分批发酵的KMK917相比较。KMK917转基因小鼠在GTC Biotherapeutics，Inc.，Framingham，MA，USA产生。由sub-contractor进行后续纯化及分析鉴定。
产生KMK917转基因小鼠产生3种KMK 917编码构建体1. 1099/2010编码KMK917野生型2. 2012/2014编码KMK917绞链突变体(229 Ser→Pro)3. 2012/2017编码KMK917绞链+Ch2突变体(229 Ser→Pro，236Leu→Glu)产生突变构建体是为了减少来源于野生型构建体的KMK917物质中观察到的半抗体部分。基于这些构建体共得到了15个转基因小鼠系(各系概况及标记参见表1a-c)。表1包含由Western印迹评估的小鼠系中KMK917的表达水平。
表1a 利用构建体1099/2010野生型得到的转基因小鼠系
表1b 利用构建体2012/2014绞链突变体得到的转基因小鼠系
表1c 利用构建体2012/2017得到的转基因小鼠系
表1c (续)利用构建体2012/2017得到的转基因小鼠系
转基因小鼠乳汁中KMK917的纯化及鉴定收集来自总共15个转基因小鼠系的乳汁样品(F0、F1和/或F2代)，用PBS稀释(详情参见表1)。样品然后纯化并鉴定KMK917抗体。所做分析之概述参见图2。
为去除乳汁胶体成分，用Sorval离心机将预先稀释的乳汁样品高速离心30分钟(SS-34转头，20,000转/分)，利用注射器从沉淀中吸出上清并去除上层脂肪层。将浅乳白色上清通过0.22μm Millex-GV滤膜过滤，上样1mL蛋白A柱(MabSelect，APB)。利用20mM柠檬酸钠/柠檬酸pH3.2洗脱结合的抗体。
调节抗体组分至pH5.5，无菌过滤，4℃保存。
测定转基因小鼠乳汁中KMK917含量使用可检测人IgG4的商品化ELISA试剂盒，测定预先稀释的小鼠乳汁样品的KMK917浓度。对应的未稀释小鼠乳汁的KMK917含量值如表2所示。
表2 转基因系乳汁的KMK917浓度
然后利用3.2所述蛋白A层析纯化所选小鼠系(每一构建体2或3个)的KMK917。再利用大小排阻HPLC(SEC)测定抗体组分中KMK917含量(表2)。可用于进一步分析的KMK917总量如表2所示。
SEC分析显示，所有抗体样品包含95％以上的单体抗体。根据所测抗体组分的KMK917含量以及用于蛋白A纯化的体积，推算小鼠乳汁样品的KMK917含量。发现推算的小鼠乳汁KMK917浓度为3.2-22.1mg/mL，与利用IgG4 ELISA直接测定小鼠乳汁的数值非常相关(表2)。
纯化的KMK917物质中存在小鼠抗体使用蛋白A纯化不仅富集人IgG同种型，也富集可能存在于乳汁中的某些小鼠抗体同工型，因而检查纯化的KMK917中存在的小鼠免疫球蛋白。使用SPR技术(Biacore 3000)以及固定化抗小鼠IgG作为″捕获分子″，在纯化的KMK917物质中检测到没有或只有极少量小鼠IgG亚类(≤0.1％)。利用SEC和人IgG4 ELISA进行的纯化的物质的浓度测量均显示非常类似的结果，也支持上述发现(表2)。可能SEC测定的浓度水平较高的大量小鼠免疫球蛋白，因为该方法不仅测量KMK917，也测量小鼠抗体。相比之下，ELISA特异性针对人IgG4，因而只检测KMK917。
″半抗体″的存在及数量使用SDS-PAGE和SDS-DSCE测定来自转基因小鼠系的KMK917物质中存在的半抗体数量。SDS-PAGE揭示野生型转染小鼠样品比突变型构建体转染小鼠样品具有较高的半抗体部分。
这些结果由SDS-DSCE证实，显示来源于利用野生型构建体产生的转基因系的KMK917物质中具有24和34％半抗体。发现来自突变型构建体的KMK917物质中半抗体部分非常低于5％，特别是来源于单一突变型构建体的物质(参见表4的总结)。
为评价来源于不同构建体的KMK917的生物学活性，使用基于荧光的细胞分析，其中KMK917与一种细胞受体竞争结合其受体靶分子。与细胞培养(Sp2/0)来源的KMK917相比，发现野生型和突变型转染的小鼠的KMK917均具有完整的生物学活性(参见表4)。
为进一步鉴定，使用SPR技术(Biacore 3000)测定KMK917与其配基靶分子结合及解离的动力学速率常数。发现所有样品中，转基因小鼠来源物质的速率常数类似于Sp2/0来源的KMK917。这表明KMK917的结合亲和力和生物学活性(1)不论在转基因小鼠或细胞系Sp2/0中表达均类似以及(2)不受引入cDNA突变的影响。
表4.
来源于转基因小鼠的KMK917分析特征概要
*Western 印迹测定nd＝未确定糖基化模式使用阳离子交换HPLC分析纯化的KMK917物质。所用特定方法能够完成抗体C端des-Lys变体(变体K0、变体K1和变体K2)的分离，也可以分辨不同糖基化形式的抗体，例如唾液酸化与非唾液酸化糖形(glycoform)，还有甘露糖型与复合型糖形。
图3a-3g显示得自细胞培养物的KMK参照样品的洗脱图以及得自乳汁样品的抗体的洗脱图。参照物的3个主峰对应K0、K1和K2变体。
得自转基因乳汁的样品更为异质。两个野生型样品显示早于参照物洗脱的其它峰，可能由唾液酸化糖形所致。突变系所得抗体样品显示非常异质的图形，变体也在参照物后洗脱。
为阐明观察到的异质性多大程度上由不同的糖基化形式引起，通过N-糖苷酶处理使野生型和突变型样品去糖基化。图4a-4d显示野生型样品在糖苷酶处理前后的CEx-HPLC图。去糖基化后的野生型样品产生更为异质的图形。按4∶1比率得到的两个峰很可能对应抗体的K0和K1形式。由此结果可以推断，观察到的野生型抗体异质性主要由糖形变体所致。
系1-36的突变抗体也产生大约相同比率的两个主峰。然而，这两个峰洗脱相距甚远，并伴有一组副峰(参见图3b)。此种行为可以解释为突变型变体中存在不同的抗体构象异构体，可能因部分未折叠所致。因此，在突变体抗体CEx-HPLC分析中观察到的主要异质性看起来不仅由不同的糖形、也由其它原因引起。
已经利用纯化的KMK917进行了进一步的糖侧链结构说明。利用PNGase F酶促断裂之后，分离糖侧链并用2-氨基苯甲酰胺标记。使用Glyco Sep N-柱HPLC分离各个糖结构，通过荧光检测定量。图5a-5c显示所分析的来自a)转基因小鼠、野生型，b)转基因小鼠、突变型，c)细胞培养的KMK917的层析谱。
层析谱显示来自转基因小鼠的KMK917的糖图形显著不同于从细胞培养物中分离的抗体。突变体的图形定性上与野生型相同，只显示某些定量上的差异。倘与其它公知的糖侧链结构做比较，从HPLC图中已经可以明确指定若干峰。分子结构如表3所示。
表3糖侧链的分子结构
为确认从HPLC获得的分子结构并取得有关延迟洗脱峰的一些额外信息，还用MALDI-MS分析了糖混合物。阴性方式的MALDI-MS提示了另一结构，包含唾液酸(sialinic acid)的糖BiG2S1。
在转基因小鼠乳腺中表达KMK917产生的小鼠乳汁KMK917滴度为3.2-22.1mg/mL。进一步鉴定来源于3种不同KMK917构建体的KMK917，显示来源于野生型构建体1099/2010物质的″半抗体″数量较高(分别24％和34％)。引入229 Ser→Pro突变(构建体2012/2014绞链和2012/2017绞链+Ch2)显著降低″半抗体″数量值，2012/2014低于2％，而2012/2017低于5％。所有3种构建体所获物质的生物学活性显示较之细胞培养来源的KMK917没有差异。
应当理解，尽管已经连同其详细说明书描述了本发明，上述说明书意在阐释而非限制本发明范围，本发明范围由所附权利要求确定。其它方面、优点及修正处于下文权利要求的范围之内。
权利要求
1.在转基因哺乳动物乳汁中产生抗体的方法，其包括提供转基因哺乳动物，其体细胞和生殖细胞包含编码外源重链可变区或其抗原结合片段、至少一个重链恒定区或其片段以及绞链区的序列，其与指导在乳腺上皮细胞中表达的启动子可操作性连接，其中所述绞链区已经改变而不同于通常与重链恒定区相关的绞链区。
2.权利要求1的方法，其中至少70％存在于乳汁中的抗体为装配形式。
3.权利要求1的方法，其中所述转基因哺乳动物另外包含编码轻链可变区或其抗原结合片段以及轻链恒定区或其功能性片段的序列，与指导在乳腺上皮细胞中表达的启动子可操作性连接。
4.权利要求1的方法，其另外包含从所述转基因哺乳动物获得乳汁的步骤，从而提供抗体组合物。
5.权利要求4的方法，其另外包含从所述转基因哺乳动物产生的乳汁中纯化外源抗体的步骤。
6.权利要求1的方法，其中所述启动子选自酪蛋白启动子、乳清蛋白启动子、β乳球蛋白启动子和乳清酸性蛋白启动子。
7.权利要求1的方法，其中所述转基因哺乳动物选自牛、山羊、小鼠、大鼠、绵羊、猪和兔。
8.权利要求1的方法，其中该抗体选自IgA、IgD、IgM、IgE或IgG。
9.权利要求1的方法，其中该抗体是IgG抗体。
10.权利要求1的方法，其中该抗体是IgG4抗体。
11.权利要求10的方法，其中该抗体的全部或部分绞链区已被改变。
12.权利要求10的方法，其中该抗体的全部或部分绞链区已被替换，例如替换为不同于通常与所述重链恒定区相关的绞链区的绞链区或其部分。
13.权利要求10的方法，其中该抗体绞链区的氨基酸序列至少一个氨基酸残基不同于与所述重链恒定区天然相关的绞链区的氨基酸序列。
14.权利要求1的方法，其中编码该抗体绞链区的核酸序列至少一个核酸残基不同于与所述重链恒定区天然相关的绞链区的天然存在的核酸序列。
15.权利要求12的方法，其中该抗体的绞链区或其部分已被替换为不同于IgG4抗体的抗体的绞链区或其部分。
16.权利要求12的方法，其中该抗体的绞链区或其部分已被替换为来源于选自IgG1、IgG2和IgG3的抗体的绞链区或其部分。
17.权利要求12的方法，其中该抗体的绞链区或其部分已被替换为来源于选自IgA、IgD、IgM和IgE的抗体的绞链区或其部分。
18.权利要求12的方法，其中绞链区的一个或多个氨基酸已被替换为不同于IgG4抗体的抗体对应位置的氨基酸。
19.权利要求15的方法，其中不同于IgG4抗体的抗体选自IgA、IgD、IgM和IgE。
20.权利要求15的方法，其中不同于IgG4抗体的抗体选自IgG1、IgG2和IgG3。
21.权利要求10的方法，其中绞链区的丝氨酸残基已被替换为脯氨酸残基。
22.权利要求10的方法，其中绞链区氨基酸编号为241的丝氨酸残基已被替换为脯氨酸残基。
23.权利要求10的方法，其中绞链区除半胱氨酸残基外的至少一个氨基酸被替换为半胱氨酸。
24.权利要求10的方法，其中该抗体的至少一个糖基化位点被改变。
25.权利要求24的方法，其中重链或轻链的至少一个糖基化位点被改变。
26.权利要求24的方法，其中重链绞链区的至少一个糖基化位点被修饰。
27.权利要求1的方法，其中该抗体是人源化抗体。
28.权利要求1的方法，其中该抗体是嵌合抗体。
29.权利要求1的方法，其中该抗体是人抗体。
30.权利要求1的方法，其中该转基因哺乳动物的乳汁基本不含半分子形式的外源抗体。
31.权利要求1的方法，其中转基因哺乳动物乳汁中存在的已装配外源抗体与半分子形式抗体之比为至少2∶1、3∶1、4∶1或5∶1。
32.制备其体细胞和生殖细胞包含修饰抗体编码序列的转基因哺乳动物的方法，其中所述修饰抗体编码序列编码可在乳汁中表达的、包含修饰的绞链区的抗体分子或其部分，所述方法包括以下步骤在哺乳动物中引入构建体，所述构建体包含编码外源重链可变区或其抗原结合片段、至少一个重链恒定区或其片段以及绞链区的序列，其与指导在乳腺上皮细胞中表达的启动子可操作地连接，其中所述绞链区已经改变而不同于通常与重链恒定区相关的绞链区。
33.权利要求33的方法，其中所述绞链区已被改变，以致至少70％存在于转基因哺乳动物乳汁中的外源抗体为装配形式。
34.权利要求33的方法，其中所述修饰抗体编码序列另外包含轻链可变区或其抗原结合片段以及轻链恒定区或其功能性片段的编码序列，其与指导在乳腺上皮细胞中表达的启动子可操作地连接。
35.权利要求33的方法，其中该启动子选自酪蛋白启动子、乳清蛋白启动子、β乳球蛋白启动子和乳清酸性蛋白启动子。
36.权利要求33的方法，其中该转基因哺乳动物选自牛、山羊、小鼠、大鼠、绵羊、猪和兔。
37.权利要求33的方法，其中该抗体选自IgA、IgD、IgM、IgE或IgG。
38.权利要求33的方法，其中该抗体是IgG抗体。
39.权利要求33的方法，其中该抗体是IgG4抗体。
40.权利要求40的方法，其中该抗体的全部或部分绞链区已经改变。
41.权利要求40的方法，其中该抗体的全部或部分绞链区已被替换，例如替换为不同于通常与所述重链可变区或所述恒定区相关的绞链区的绞链区或其部分。
42.权利要求40的方法，其中该抗体绞链区的氨基酸序列至少一个氨基酸残基不同于与所述重链恒定区天然相关的绞链区的氨基酸序列。
43.权利要求33的方法，其中编码该抗体绞链区的核酸序列的至少一个核酸残基不同于与所述重链恒定区天然相关的绞链区的核酸序列。
44.权利要求44的方法，其中该抗体的绞链区或其部分已被替换为不同于IgG4抗体的抗体的绞链区或其部分。
45.权利要求42的方法，其中该抗体的绞链区或其部分已被替换为来源于选自IgG1、IgG2和IgG3的抗体的绞链区或其部分。
46.权利要求42的方法，其中该抗体的绞链区或其部分已被替换为来源于选自IgA、IgD、IgM和IgE的抗体的绞链区或其部分。
47.权利要求42的方法，其中绞链区的一个或多个氨基酸已被替换为不同于IgG4抗体的抗体对应位置的氨基酸。
48.权利要求48的方法，其中不同于IgG4抗体的抗体选自IgA、IgD、IgM和IgE。
49.权利要求48的方法，其中不同于IgG4抗体的抗体选自IgG1、IgG2和IgG3。
50.权利要求40的方法，其中绞链区的丝氨酸残基已被替换为脯氨酸残基。
51.权利要求40的方法，其中绞链区氨基酸编号为241的丝氨酸残基已被替换为脯氨酸残基。
52.权利要求40的方法，其中绞链区除半胱氨酸残基之外的至少一个氨基酸被替换为半胱氨酸。
53.权利要求40的方法，其中该抗体的至少一个糖基化位点被改变。
54.权利要求54的方法，其中重链或轻链的至少一个糖基化位点被改变。
55.权利要求40的方法，其中重链绞链区的至少一个糖基化位点被修饰。
56.权利要求33的方法，其中该抗体是人源化抗体。
57.权利要求33的方法，其中该抗体是人抗体。
58.权利要求33的方法，其中该抗体是嵌合抗体。
59.权利要求33的方法，其中所述绞链区已被改变，以致该转基因哺乳动物的乳汁基本不含半分子形式的外源抗体。
60.权利要求33的方法，其中转基因哺乳动物乳汁中存在的已装配外源抗体与半分子形式抗体之比为至少2∶1、3∶1、4∶1或5∶1。
61.权利要求60的方法，其中该抗体选自IgA、IgD、IgM、IgE或IgG。
62.制备能够在其乳汁中表达装配型外源抗体或其部分的转基因哺乳动物的方法，该方法包括在哺乳动物中引入构建体，所述构建体包含与指导在乳腺上皮细胞中表达的启动子可操作连接的外源抗体轻链编码序列；以及在哺乳动物中引入构建体，所述构建体包含与指导在乳腺上皮细胞中表达的启动子可操作连接的外源抗体突变的重链或其部分的编码序列，其中该重链或其部分包含已被改变的绞链区，以致至少70％存在于乳汁中的外源抗体为装配形式。
63.制备能够在其乳汁中表达装配型外源抗体的转基因哺乳动物的方法，该方法包括提供来自转基因哺乳动物的细胞，所述转基因哺乳动物的体细胞和生殖细胞包含与指导在乳腺上皮细胞中表达的启动子可操作连接的外源抗体轻链编码序列；以及在细胞中引入构建体，该构建体包含与指导在乳腺上皮细胞中表达的启动子可操作连接的外源抗体突变的重链或其部分的编码序列，其中该重链或其部分包含已被改变的绞链区，以致至少70％存在于乳汁中的外源抗体为装配形式。
64.包含乳汁组分和抗体组分的组合物，其中所述抗体组分包含具有绞链区的外源抗体或其部分，其中所述绞链区已被改变不同于通常与抗体相关的绞链区。
65.权利要求63的组合物，其中至少70％存在于所述组合物中的外源抗体为装配形式。
66.权利要求63的组合物，其中所述绞链区已被改变，以致至少70％存在于所述组合物中的外源抗体为装配形式。
67.权利要求63的组合物，其中该抗体选自IgA、IgD、IgM、IgE或IgG。
68.权利要求63的组合物，其中该抗体是IgG抗体。
69.权利要求67的组合物，其中该抗体是IgG4抗体。
70.权利要求63的组合物，其中该抗体绞链区的全部或部分已经改变。
71.权利要求63的组合物，其中该抗体的全部或部分绞链区已被替换，例如替换为不同于通常与抗体相关的天然存在的绞链区的绞链区或其部分。
72.权利要求63的组合物，其中该抗体绞链区的氨基酸序列至少一个氨基酸残基不同于天然存在的抗体的绞链区的氨基酸序列。
73.权利要求63的组合物，其中该抗体的绞链区或其部分已被替换为不同于IgG4抗体的抗体的绞链区或其部分。
74.权利要求72的组合物，其中该抗体的绞链区或其部分已被替换为来源于选自IgG1、IgG2和IgG3的抗体的绞链区或其部分。
75.权利要求72的组合物，其中该抗体的绞链区或其部分已被替换为来源于选自IgA、IgD、IgM和IgE的抗体的绞链区或其部分。
76.权利要求63的组合物，其中绞链区的一个或多个氨基酸已被替换为不同于IgG4抗体的抗体对应位置的氨基酸。
77.权利要求75的组合物，其中不同于IgG4的抗体选自IgA、IgD、IgM和IgE。
78.权利要求75的组合物，其中不同于IgG4抗体的抗体选自IgG1、IgG2和IgG3。
79.权利要求63的组合物，其中绞链区的丝氨酸残基已被替换为脯氨酸残基。
80.权利要求63的组合物，其中绞链区氨基酸编号为241的丝氨酸残基已被替换为脯氨酸残基。
81.权利要求63的组合物，其中绞链区除半胱氨酸残基之外的至少一个氨基酸被替换为半胱氨酸。
82.权利要求63的组合物，其中该抗体的至少一个糖基化位点已改变。
83.权利要求63的组合物，其中该抗体重链或轻链的至少一个糖基化位点被改变。
84.权利要求82的组合物，其中该抗体重链绞链区的至少一个糖基化位点被修饰。
85.权利要求63的组合物，其中该抗体是人源化抗体。
86.权利要求63的组合物，其中该抗体是人抗体。
87.权利要求63的组合物，其中所述绞链区已被改变，以致该组合物基本不含半分子形式的外源抗体。
88.权利要求63的组合物，其中该组合物中存在的装配型外源抗体与半分子形式抗体之比为至少2∶1、3∶1、4∶1或5∶1。
89.包含编码重链可变区和重链恒定区之序列的核酸，该序列与指导在乳腺上皮细胞中表达的启动子可操作连接，其中重链或其部分包含已被改变的绞链区，以致至少70％存在于乳汁中的外源抗体为装配形式。
全文摘要
本发明特征在于在转基因哺乳动物乳汁中制备抗体的方法。该方法包括提供其体细胞和生殖细胞包含编码序列的转基因哺乳动物，该序列编码外源重链可变区或其抗原结合片段、至少一个重链恒定区或其片段以及绞链区，与指导在乳腺上皮细胞中表达的启动子有效连接，其中所述绞链区已经不同于通常与重链恒定区相关的绞链区。本发明特征还在于转基因哺乳动物、制备所述哺乳动物的方法、包含所述抗体的组合物以及编码该抗体的核酸。
文档编号C07K16/04GK1729298SQ200380107311
公开日2006年2月1日 申请日期2003年11月26日 优先权日2002年11月27日
发明者H·M·米德, E·伯克－威尔森, D·普洛克 申请人:Gtc生物治疗学公司