专利名称：基于泛蛋白修饰的α螺旋区的人工结合蛋白的制作方法
基于泛蛋白修饰的a螺旋区的人工结合蛋白
本发明涉及源自泛蛋白样蛋白的蛋白质超家族、在其a螺旋区具有修 饰的结合蛋白。本发明还涉及用于产生这些蛋白的方法以及可通过所述方 法获得的蛋白。此外，本发明提供蛋白质用于特异性识别、结合和中和前 述靶分子，用于检测、定量测定、分开和/或用于分离相应的结合配偶体的 用途，和本发明蛋白质用于诊断、预防和治疗直接或间接涉及相应的结合 配偶体的疾病的用途。
背景技术：
泛蛋白是小单体胞质蛋白，其序列高度保守，并存在于从原生动物到 脊椎动物的所有已知的真核细胞中。在生物体中，它在调节细胞蛋白的受 控降解中起关键作用。为了该目的，指定用于降解的蛋白在它们经过酶级 联过程中与泛蛋白或多泛蛋白链共价连接，并由于该标记被选择性降解。 根据近期的结果，泛蛋白或由泛蛋白标记蛋白，也分别在其他细胞过程诸 如引入若干蛋白或其基因调节中起重要作用(Marx, 2002)。
除澄清其生理功能外，泛蛋白是研究的目标，主要是因为其结构和蛋 白质化学特性。泛蛋白的多肽链由以特别紧凑的a/p结构方式折叠的76 个氨基酸组成(Vijay-Kumar, 1987):几乎87%的多肽链通过氢键的方式参 与二级结构元件的形成。明显地，二级结构可以涉及三个半a-螺旋转角以 及一个由四条链组成的反向平行(3-折叠。这些元件的特有排列——反向平 行|3折叠暴露于这样的蛋白质表面，在所述蛋白质表面的背面上堆积垂直 位于其上部的a螺旋——通常被视为所谓的泛蛋白-样折叠基序。因此， 泛蛋白是分别关于各种蛋白质超家族("泛蛋白-样蛋白")或蛋白质家族 ("泛蛋白-相关蛋白")给出的名称(Murzin等，1995)，其包括携带这种 基序以及在其一级序列中与泛蛋白高度同一的蛋白质诸如例如SUMO-l (Miiller等，2001)、 FAU (Michiels等，1993)、 NEDD-8 (Kumar等，1993)、UBL-1 (Jones和Candino, 1993)、和GDX (Filippi等，1990)。
人泛蛋白是——如上所述一76个氨基酸长的多肽(
图1)。它是7,5 kDa 的、具有突出的C-端的小的球状蛋白。泛蛋白的主要结构性质显示在图1 中。来自所述折叠和来自所述螺旋的疏水性残基装配所述蛋白的疏水性核 心并稳定所述螺旋的方向(图2)。所述蛋白质核心的高度密集的疏水性堆 积通过其优秀的热力学稳定性反映，这应该使所述蛋白成为作为蛋白质工 程方法支架使用其的理想候选者。
由于它的小尺寸，泛蛋白的人工制备可以通过化学合成和通过生物技 术的方法进行。由于有利的折叠特性，泛蛋白可以通过使用微生物诸如大 肠杆菌(Escherichia coli)的遗传工程以相对大的量在细胞质或者在壁膜 间隙中产生。由于在周质中主要为氧化条件，通常将后一方案留作用于产 生分泌蛋白。由于简单和有效的细菌制备，泛蛋白可以用作其它要被制备 的其生产有难度的外源蛋白的融合配偶体。通过与泛蛋白融合的方法，可 以获得提高的溶解性和因此提高的产量。本发明中实施的用于提供泛蛋白 作为通用的人工结合蛋白的方法容许其蛋白质化学特性的完全新颖性的 利用。
在诊断学和制药学中使用其天然功能的那些蛋白质中，免疫球蛋白起 主要作用。它们与广泛范围的不同底物的特异性、非-共价结合能力使它们 成为用于生物科学应用的最重要工具。近年来开发的用于在大肠杆菌中功 能生物合成抗体片段的方法进一步扩展了使用免疫球蛋白的可能性，但同 时证明了它们的局限性。
除可以主要可以通过常规方法获得的Fab-和Fv-片段外(Skerra和 Pltickthim, 1988)，通过蛋白质工程方法可以开发不同的人工构建体。通过 免疫球蛋白的模块结构的帮助(在Diibel和Kontermann, 2001中综述)， 可以特别地生成单链Fv片段(scFv) (Bird等，1988)、 二硫键Fv片段(dsFv) (Brinkmann等，1993)以及二价(Carter等，1992)和双特异性抗体片段(例 如，双抗体,Holliger等，1993)。为了诊断和在治疗中使用，可以通过重组 Ig片段与效应子模块的遗传融合获得双功能蛋白。因此，特别地，可以使 用与碱性磷酸酶(Mmier等，1999)和绿色荧光蛋白(GFP; Gri印等，1999)的 融合。抗体片段与放射性同位素或细胞毒性物质的融合对癌症治疗具有巨
7大的潜在重要性(免疫毒素；Reiter和Pastan, 1998)。在该情形中，各种Ig 片段与肿瘤细胞上的特异性表面蛋白的选择性结合用于治疗学的位点-特 异性应用(肿瘤耙向)。
然而，用于在大肠杆菌中制备抗体片段的方法不仅容许其以充足的质 量和数量提供用于诊断和治疗，而且用于它们的蛋白质-和免疫化学特性的 简单快捷修饰。对细菌宿主方便的处理允许通过标准分子-生物学方法的方 式直接改变外源蛋白的载体-编码基因。因此，通过靶向抗体工程的方式 (Kontermann和Diibe1,2001)，可以最优化抗体片段，例如针对它们的结合 亲和性或它们的宿主相容性。而且，特异性抗体或其片段分别可以人工制 备，即由免疫系统制备，它们针对最不同的靶物质，诸如例如低分子量结 构或蛋白。通过所述进化的方法，通过引入随机突变制成抗体片段的合成 文库，所述随机突变在其范围内可以接近人所有组成成分(Knappik等, 2000)。通过合适的选择策略，诸如噬菌体展示或核糖体展示的方式(Winter, 1998, Hoogenboom等，1998; Hanes等，2000)，成功分离具有理想结合特性 的功能性Ig片段。以这种方式，还可能例如获得针对所述抗原的结合蛋白， 所述抗原在经典免疫化过程中应该引起毒性作用或仅引起弱免疫应答。
尽管通过抗体工程提供了上述成就和可能性，但是某些缺点可以限制 抗体的实际应用。因此，以充足量提供它们是个难题。
功能性抗体的生产主要在真核细胞培养系统中进行，这是成本特别高 的方法。此外，抗体分子分别由于其尺寸和其在血清中的长存留时间(缓 慢血液清除)造成的低组织渗透性妨碍许多治疗应用。尽管较小的抗体片 段，诸如scFv或Fab片段(见上)可以在细菌中并因此基本上以较低成 本制备，然而，由于其不利的折叠特性和需要形成若干二硫键，该重组生 产的产率低于理想水平。而且，当与亲本抗体相比时，重组抗体片段经常 显示出降低的热力学稳定性、较低的结合活性和较高的聚集倾向。
为了避开所述限制，已经尝试透露抗体结合——即通过位于保守的蛋 白支架上的超变表面-暴露区域一 一结合于其他蛋白质的原理(Skerra， 2000)。这意味着基本可变环是多样的，从而产生人工结合特性。为了该目 的，通常天然结合蛋白诸如例如脂笼蛋白(Beste等，1999)或纤连蛋白III型 结构域(Koide等，1998)被用作起始点，关于所述起始点以类似于来自灵活"环"结构的抗体的方式形成结合位点，所述灵活"环"结构的修饰允许 配体的诱导契合识别。
WO2004/106368涉及"泛蛋白-样蛋白"超家族的修饰的蛋白，"泛蛋 白-样蛋白"即具有泛蛋白-样折叠的蛋白。作为所述修饰的结果，该蛋白 具有先前不存在的关于预先确定的结合配偶体的结合亲和性。该发明还涉 及用于生产和使用所述蛋白质的方法。按照WO2004/106368,提供选自由 "泛蛋白-样蛋白"蛋白超家族的蛋白组成的组，其中由于P折叠区|3折 叠链中氨基酸的一种或多种修饰，该蛋白质显示出改进的结合亲和性。因 此，从位置Q2, F4， K6, Q62, K63， E64， S65和T66处的新氨基酸取代装配 人泛蛋白的从头结合位点(图6, 7)。
不幸地，由于所述从头结合位点与蛋白质N-端的紧密接近，新引入氨 基酸的密码子组成导致蛋白质变体的不均一表达率，并严重妨碍变体的随 后的N-端遗传融合或翻译后N-端标记。最后，使用凸起的(3折叠拓扑结 构作为互补位形成高亲和性结合多肽依赖于耙分子凹形结构的存在。
发明概述
因此，本发明的一个目的是在不表现出上述缺点的条件下，提供具有 先前不存在的(与野生型蛋白相比)针对所选择的结合配偶体或靶分子的 新型和/或提高的结合亲和性的修饰蛋白，即其也可以用于除具有凹形结构 那些以外的其他靶分子。本发明的另一个目的是构建抗体的替代分子，然 而，所述替代分子不表现出抗体的上述缺点。
此外，本发明的一个目的是提供各种用于制备上述基于泛蛋白的修饰 蛋白的方法，和这些修饰蛋白的用途。
以上目的是通过独立权利要求的主题实现的。优选的实施方案记述在 从属权利要求中。
为了克服基于卩折叠文库策略的局限性，使用一种新方法在泛蛋白表 面上生成备选的结合位点。在该球状蛋白几乎凸起的拓扑结构中，野生型 泛蛋白的a螺旋异常地表现出约750入2的溶剂暴露的平面拓扑结构，其乍 一看似乎更不适合生成新的结合位点。然而，意外地证实了所述螺旋可以 作为生成具有与预先确定的结合配偶体的结合亲和性的新的修饰的泛蛋白分子的优秀的基础。
本方法基于这样的假设，即可以在不扰乱稳定疏水性核心和——甚至 更重要地——泛蛋白折叠途径的条件下，诱变泛蛋白a螺旋。这完全与这 样的事实的形成对比，所述事实是泛蛋白的螺旋在蛋白质的折叠-途径中起 主要作用。在翻译泛蛋白的过程中，泛蛋白最初的两条链从核糖体开始延
伸并迅速折叠为二-链折叠，其本身是稳定的结构(Bofill和Searle 2005)。 理论上，该小折叠然后作为螺旋的主链模板。所述折叠和所述螺旋在蛋白 质折叠途径过程中形成蛋白质的过渡状态(Crespo， Simpson等2006; Jackson 2006; Pandit, Jha等2006)。其余的多肽链随后通过与该复合物碰 撞进行折叠。
因此，泛蛋白过渡状态复合物中的突变应该严重影响蛋白质的折叠途 径。可以预料到突变的蛋白质的溶解性、稳定性和总结构完整性受到所述 方法的严格限制。
在本发明中，举例说明示范性结果，其非常令人吃惊地显示高亲和性 泛蛋白-来源的、单体结合变体可以通过利用泛蛋白a螺旋作为核心结构 的突变方法产生。而且，通过该方法，蛋白质的N-端保持没有突变，这允 许序列异源变体通过最初的19个氨基酸的密码子-最优化DNA序列的均 一的表达产率。此外，N-端遗传融合以及随后的标记方法成为可能的。
发明详述
本发明在主要方面涉及用于生成蛋白的方法，所述蛋白选自由"泛蛋 白-样蛋白"蛋白超家族的蛋白，即具有泛蛋白-样折叠基序的蛋白及其各 自具有泛蛋白-样折叠基序的片段或融合蛋白组成的组，其中所述蛋白由于 在ct螺旋区中的一个或多个氨基酸修饰显示出关于抗原的提高的结合亲和 性，所述结合亲和性在未修饰的蛋白质中不存在或不以该程度存在。
此外，本发明提供这样的蛋白，所述蛋白选自由各自具有泛蛋白-样折 叠基序的"泛蛋白-样蛋白"蛋白超家族的蛋白、及其各自具有泛蛋白-样
折叠基序和下列特征的片段或融合蛋白组成的组，所述特征为
一 所述蛋白由于对形成蛋白a螺旋区的那些氨基酸的修饰具有
关于预先确定的结合配偶体(试剂)的新的或增强的结合亲和性；
一 所述结合亲和性在未修饰的蛋白质中不存在或不以该程度存 在；和
一 a螺旋或相邻区域内至少4个表面-暴露的氨基酸被修饰。
因此，本发明提供分别通过修饰分别具有如本发明定义的泛蛋白-样折 叠基序的蛋白质或多肽制备的蛋白质或多肽。这些包括"泛蛋白-样-蛋白" 蛋白超家族的蛋白，具有泛蛋白-样折叠基序的所有蛋白，以及这些蛋白的 片段或融合蛋白，条件是它们也具有泛蛋白-样折叠基序。分别从这些蛋白 质或多肽开始，原始蛋白质或多肽的a螺旋区中的至少四个表面-暴露的 氨基酸分别被修饰。这些修饰具体包括氨基酸的取代，和一个或多个氨基 酸的插入和缺失以及氨基酸的化学修饰。
注意到术语"a螺旋区"用于本文时，意指包括泛蛋白-样折叠中的三 个a-螺旋转角。关于人泛蛋白，位置T22-D32属于泛蛋白的螺旋核心区。 然而，该术语还包括位于a螺旋外的氨基酸16-21 (螺旋的上游位置)和 38-55 (螺旋的下游位置)。或换言之，用于本文时，术语"a-螺旋区"等 价于表述"a螺旋或相邻区"。
所述a螺旋区中至少4个氨基酸的修饰意味着所述氨基酸应该位于结 合配偶体或配体分别易于接近的蛋白质表面，能够以可以确定的亲和性与 修饰的蛋白结合。
因此，按照本发明，所述a螺旋或相邻区域内的至少4个表面-暴露的 氨基酸被修饰。证实可以提高与预先确定的结合配偶体的新的和/或提高的 结合亲和性的可能性，条件是在a螺旋或相邻区域内的至少4个表面-暴 露的氨基酸被修饰。
注意到为了形成非-瞬时蛋白质-蛋白质相互作用，需要充足的表面-暴 露面积，其是由当然参与所述相互作用的氨基酸残基装配的。假定4个表 面-暴露的氨基酸是产生所述相互作用的绝对最少量。为了更有效地形成这 种相互作用，优选地，表面-暴露的氨基酸数量是至少6个，更优选地，至 少8个。进一步优选地，在a螺旋或相邻区域内暴露的氨基酸提供至少 400A2,更优选地600人2的溶剂可及表面积。关于那些表面可及表面积的 实例显示在表1中
ii氨基酸氨基酸位置A2
4T22,E24，N25,A28266.814
6T22, E24,N25,A28，Q31'D32473.884
8D21,T22' E24,N25,A28,Q31JD32，P38544.976
10S20,D2,T22, E24,N25,A28,K29,Q31 ,D32'P38711.029
12S20,D21，T22， E24,N25，A28,K29,Q31 ,D32,P38,D52，G53847.595
4S20，D21,T22，E24,N25,A28,K29，Q31,D32,P38,D52,G53,R54,T551010.998
16El6,El8,S20,D21 ,T22， E24,N25,A28,K29,Q31 ,D32,P38'D52,G53，1239.035
R54，T55
E16，E18,S20，D21，T22,
18E24,N25，线K29,Q31,K33,D32，P38,D39,D52,G53'R54，T551484.749
表h通过PyMOL版本0.98的方式计算泛蛋白(PDB 1UBQ)的SASA (表面可及表面积)。
关于其他信息，参考Fletcher， S.和A. D. Hamilton (2005)."蛋白质表面 识别和蛋白模拟物蛋白表面结构和功能的模仿"("Protein surface recognition and proteomimetics: mimics of protein surface structure and flmction.")当前化学和生物学观点(Curr Opin ChemBiol) 9(6): 632-8。
注意到本发明的蛋白质优选地仅在其a-螺旋区携带关于野生型(wt) 蛋白的修饰。然而，按照本发明，包括位于以上定义范围外的修饰，其另 外可以为总体稳定性、折叠效率、溶解性、靶点-特异性或亲和性作出贡献。
这进一步涉及通过随机诱变(例如，倾向差错的PCR)，通过位点定 向的重新随机化预先选择的结合盒中的位置，通过靶向的单氨基酸修饰或 通过化学修饰成熟化泛蛋白结合变体的其他策略。本领域中的那些技术人 员可以使用本身已知的用于修饰一个或多个氨基酸的不同技术。这些会在 下文中更详细的记述。另外，参考Ausuebel等，1994,以及Sambrook等， 1989的公开文献。
已知泛蛋白的非-表面-暴露核心区的氨基酸的修饰(Finucane等，生物 化学(Biochemistry),巻38， No. 36, 1999或Lazar等，蛋白质科学(Protein Science) (1997)， 6: 1167-1178)。其中作出的改变针对不参与结合的位置，这归因于它们在疏水性核心中的定位是溶剂或可能的结合配偶体不可及 的。
在下文中，术语"未修饰蛋白中不存在或不以该程度存在的结合亲和 性"和从头形成的人工结合位点的意思分别在本发明上下文中得到解释。 这些术语意指修饰的蛋白先前对预先确定的结合配偶体不显示或几乎不 显示结合亲和性。在本发明的另一个实施方案中，选择要进行修饰的蛋白 以对所述预先确定的结合配偶体没有结合亲和性。结合配偶体，也可以定 义为配体，对按照本发明修饰的蛋白具有可测量的亲和性。作为存在可计 量的结合特征的最小值，即配偶体结合的亲和性，按照本发明可以被认为 是形成的复合物的平衡常数KD = 10-5 M或更小。10—5 M以下的值可以被认 为是可计量的结合亲和性。根据应用，1(^M-10^M的值是优选的，更优 选地，对于例如层析应用为10义10'" M，或对于例如诊断或治疗应用为 10久10"2 M。更优选的结合亲和力是在10'8到10'1G M，优选地到10'11 M 范围内。用于确定结合亲和性的方法本身已知，并在下文中进一步描述。 术语"修饰"按照本发明意指氨基酸的取代、插入、缺失或化学修饰。 可以使用"泛蛋白-样蛋白"超家族的蛋白作为要按照本发明修饰的蛋 白。按照本发明，该超家族包括Murzin等(1995)中列出的子集。这些包 括例如下列蛋白家族:"泛蛋白-相关蛋白"、"UBX结构域"、"GABARAP-样"、"RAS-结合结构域"等。优选地，使用"泛蛋白-相关蛋白"蛋白家 族的蛋白。按照本发明，还包括那些具有泛蛋白-样折叠基序的蛋白。这些 的实例是SUMO-l， FAU， NEDD-8, UBL-1，和GDX以及Rubl, APG8, ISG15， URM1， HUB1，伸蛋白B, PLIC2 (N-端结构域)，人帕金蛋白(N-端 结构域)。
已对按照本发明可以使用的来自泛蛋白-样蛋白超家族的蛋白表征到 很高的程度。因此，将泛蛋白-样蛋白家族定义为泛蛋白-相关蛋白家族属 于其中的超家族。因此，泛蛋白-样蛋白成员的特征是暴露于蛋白一个表面 的反向平行(3折叠，所述蛋白表面的背侧堆积垂直位于其上部的oc螺旋。 该泛蛋白-样折叠基序是按照本发明可以使用和修饰的蛋白的特征，且明确 地将所述家族的成员与其他蛋白相区分。由于该定义，本发明还包括 PLIC-2的泛蛋白-样N端结构域和帕金蛋白的泛蛋白-样结构域。本领域中的那些技术人员可以关于序列比较，即所谓的对比，或通过 结构考虑因素，初步判断蛋白质是否是泛蛋白-样蛋白的蛋白超家族的成
员。自然地，最后的证据总是由结构分析，例如通过x-射线结晶学或多维
核磁共振光谱法的结构分析提供。近期，利用遗传运算法则的结构分析可 以提供良好的预测。
上述家族和超家族的蛋白通常是高度保守的。按照现在的知识，例如， 在所有哺乳动物中泛蛋白具有相同的氨基酸序列。酵母的泛蛋白仅以3个 氨基酸不同于该序列。人泛蛋白或哺乳动物泛蛋白分别由76个氨基酸组 成并具有开始所述的结构。
下列实施方案涉及本发明的方法方面和蛋白质方面
按照本发明，所述修饰的蛋白在其氨基酸序列上应该与修饰的起始蛋
白，例如与人泛蛋白具有至少30%,优选地至少40%或50%,进一步优选 地至少60%,至少70%,至少80%,至少90%,或至少95%的同一性，其 中所述蛋白在任何情形中具有如以上详细定义的泛蛋白-样折叠基序。
按照本发明，还包括所述的蛋白质片段，条件是它们包括上述泛蛋白 -样折叠基序，以及包括所述蛋白与其他蛋白的融合。在所述片段和融合蛋 白的情形中，本发明框架中提到的氨基酸位置指人泛蛋白中的各个位置。 融合配偶体的实例是(受体)酶、毒素、蛋白酶、延长或縮短构建体或其 他结合蛋白的半衰期的蛋白等。此外，可以进行与例如低分子量物质诸如 生物素、洋地黄毒苷、荧光和/或发光物质等的化学偶联。
按照更优选的实施方案，蛋白质以位点-特异性和共价方式与相同或不 同特异性的蛋白质相连接，并由此分别显示二价或双特异性结合特性。
在生成融合蛋白的情形中，按照本发明可以修饰所述构建体的片段或 全部融合配偶体。然而，本发明还包括片段融合，随后进行修饰方法，这 可以包括翻译后修饰，亲和性、稳定性或溶解性成熟或进一步选择与一级 靶标或对比二级靶分子的结合。在各种情形中，这可以按照本领域中那些 技术人员已知的方法进行。
关于如何生成和使用包括本发明修饰的蛋白的融合蛋白或缀合物的 更详细信息可以在WO 2006/040129中找到，将其引入本文作为参考。注 意到本发明还包括本发明蛋白的同源二聚体或异源二聚体的产生。按照本发明，选择用于制备修饰的蛋白的蛋白优选地是人泛蛋白或其 他来源的泛蛋白，例如另一种哺乳动物的泛蛋白。因此，在下文中利用特 殊的人泛蛋白作为实例描述本发明。关于若干实例描述人泛蛋白的修饰， 以获得还可以称为突变蛋白并且关于预先确定的结合配偶体显示出先前 不存在的结合亲和性的蛋白。作为哺乳动物的泛蛋白，可以具体使用哺乳 动物领域中啮齿动物、家畜和农畜的泛蛋白。如果按照本发明制备的蛋白 质的使用领域是已知的，即如果修饰的蛋白应该例如用作用于治疗人中疾 病的药物组合物，则人蛋白可以优选地用作待修饰的起始蛋白；也将其应 用于相应的使用领域。应该指出的是，下文中给出的解释仅作为实例基于 人泛蛋白。在该详细说明和提到的实例的基础上，本领域中那些技术人员 按照本发明修饰其他具有泛蛋白-特异性折叠基序的蛋白应该是可能的。因 此，本发明不限于人泛蛋白或普通的泛蛋白。该方面中的指示和解释应该 被认为是本发明的示范性实施方案，然而，其是特别优选地。
下文是关于选择和修饰待修饰氨基酸的简略概述。
在相应的结构数据诸如例如可在蛋白质数据库TM (Protein Data Bank ) (Berman等，2000; http:〃www.rcsb.org/pdb)中免费获得的那些的基 础上，可以通过计算机化分析定位那些氨基酸在起始蛋白质中，例如在泛 蛋白蛋白支架中的位置，所述起始蛋白的侧链是表面-暴露的，即朝向溶剂 或潜在的结合配偶体(Fratemali和Cavallo 2002)。此外，可以通过计算机 化分析鉴定起始蛋白质中，例如泛蛋白中的那些氨基酸，其随机取代可能 将对蛋白质支架没有或仅有微小的消极作用。该信息可以提供关于每个单 氨基酸作为结合位点元件适合性的第一指示，并然后需要进一步实验验 证。通过分析的区域中的随机氨基酸取代("随机化")，由此可以——以 类似于抗体的抗原结合位点的方式_—在泛蛋白另外完整蛋白结构上生 成超变表面-暴露区。
按照优选的实施方案——起始自可获得的人泛蛋白(PDB 1UBQ)结构 数据——首先选择待生成的结合位点区域内的10根氨基酸位置。通过位 点特异性随机诱变一级序列和随后的特异性选择，获得那些变化，其显示 出关于预先确定的结合配偶体的理想结合活性。尽管对以该方式获得的修 饰的蛋白赋予从头结合特性，但是它们与起始蛋白保持高度一致的结构和
15蛋白质化学特性。它们提供优点诸如例如小尺寸、高稳定性、成本-高效制 备以及容易修饰和针对先前定义的配体的高亲和性和特异性。在这个方 面，不能预期泛蛋白作为生成人工结合蛋白的支架结构的适合性，因为l) 由于泛蛋白的小尺寸，不能预期所述支架对广泛氨基酸取代的耐受性，和 2)涉及被认为是刚性不灵活的螺旋核心结构的人工结合位点的功能性似 乎不可能预见。
按照本发明，抗原应该指由抗体结合的物质。术语抗原包括半抗原、
肽、蛋白质、糖、DNA等。由Roche Lexikon Medizin (第4版； http:〃www.gesundheit.de/roche)，可以获得下列抗原和半抗原定义，其也用
于本发明
抗原(AG):由免疫系统识别为外源("非自身")的任何物质的名称。 在大多数情形中起始导致免疫性的免疫反应(="免疫原")；在过敏(="过 敏原")和特应性(atopy)("特应原(at叩igen)")的情形中，该免疫反 应分别是过大的。AG诱导体液(抗原-抗体反应)和/或细胞防御反应(见 下述免疫性)。如果AG受到免疫系统的耐受(免疫耐受)，则其也称为"耐 受原"。作为抗原有效的主要是具有负责免疫应答的化学可识别功能性(决 定簇)的复合物和较高分子量的物质(蛋白体、多糖、核苷酸和许多合成 的化合物)。分类为l)完全AG，主要是较高分子量和能够通过自身引起 免疫反应的，.2)作为低分子量的半抗原(=半个抗原)，其仅在与较大的 载体分子偶联后起免疫原的作用。参考例如异种、同种异型、或同基因的、 自体AG;自体、异源、移植、抗-肿瘤病毒AG。
半抗原:与完全AG相反，分别负责抗原(AG)的特异性或由于其结 构(决定簇)能够特异结合抗体但不能产生过敏的简单、低分子量化学化 合物。其在结合称为载体的蛋白体后成为完全抗原(抗原)。
应该指出，利用本发明，还可能产生泛蛋白的变化，其具有关于作为 结合配偶体的非-免疫原性物质，诸如肿瘤标记的结合特性。
在本发明的优选实施方案中，至少部分地在一级序列中直接相邻的两 个或更多氨基酸处进行修饰，优选地进行取代，其中在三级结构中彼此直 接相邻的氨基酸还优选地至少部分位于蛋白的螺旋内。 一般地，蛋白质中 氨基酸的每个取代都伴随着该蛋白质稳定性的潜在降低。通常可以耐受单一取代，因为对相邻氨基酸没有广泛的不稳定性影响。然而，如果改变整 个区域，即例如由若干相邻氨基酸组成的结构实体，则不再能预期由于直 接相邻的氨基酸产生的稳定化作用。
具体地，在相对小的泛蛋白的情形中，直接相邻的氨基酸的修饰还具 有这样的优势，即与彼此不直接相邻的氨基酸的情形相比，通过遗传工程 更容易制备这种类型的修饰。因此，按照该实施方案，可以在蛋白质和在 DNA水平提供大量修饰的蛋白质的简单产生。
优选地，直接相邻氨基酸取代的数量是一级序列中彼此直接相邻的
2-10个，更优选地，2-8个氨基酸，进一步优选地， 一级序列中彼此直接 相邻的3-7个或4- 6个或2- 4个氨基酸。
在进一步优选的实施方案中，5个或更多直接相邻的氨基酸被修饰， 优选地被取代，其中2个或更多，优选地2或3个直接相邻的氨基酸形成 a螺旋区的开始或终止端。在该情形中，优选地，8、 9或10个氨基酸， 特别优选地，8个氨基酸可以认作为直接相邻的修饰氨基酸总数的上限。
在本发明优选的实施方案中，修饰那些氨基酸，从而产生具有新结合 特性的区域，所述区域在蛋白质表面上形成邻接区域。以这种方式，可以 产生具有先前不存在的结合特性的邻接区域。按照本发明"邻接区域"意 指如下由于电荷，它们侧链氨基酸的空间结构和疏水性/亲水性以相应的 方式与它们的环境相互作用。所述环境可以是溶剂，通常是水，或其他分 子，例如空间上靠近的氨基酸。通过关于蛋白质的结构信息以及各种软件， 可以表征蛋白质的表面。例如，可以以这种方式显现蛋白质和溶剂的原子 之间的界面区，其包括关于如何构建该界面区，溶剂可及哪些表面积或电 荷如何分布在表面上的信息。例如，可以通过利用合适的软件显现这种类 型而揭示邻接区域。所述方法是本领域中那些技术人员已知的。按照本发 明，基本上还可以使用整个表面-暴露区域作为待修饰表面上的邻接区域， 从而产生新结合特性。
为了诱变a螺旋结构，优选地，在蛋白中选择与表面接近的那些区域。 可以关于可获得的X-射线结晶结构鉴定表面-暴露的氨基酸(Vijay-Kumar， Bugg等1987)。如果晶体结构不可用，则可以通过计算机分析的方式进行 尝试，从而预测表面-暴露的|3折叠区域和各个氨基酸位置关于可用一级结构的可及性(www.embl heidelberg.de/predictprotein/ predictprotein.html)或从 而建模3d蛋白结构(www.expasv.ch/swissmo/SWISS-MODEL.html)和从而
以这种方式获得关于潜在表面-暴露氨基酸的信息。
然而，还可能在a螺旋中进行诱变，对此可以省略对待诱变的氨基酸 位置的耗时预选择。将那些编码a螺旋结构的DNA区域从它们的DNA 环境中分离出来，对其进行随机诱变，并然后重新-整合到编码先前从其中 去除它们的蛋白的DNA中。随后进行关于具有理想结合特性的突变体的 选择过程。
由从亲本蛋白和从彼此从头产生的人工结合位点的区域中的氨基酸 取代引起区别的泛蛋白蛋白支架的变化可以通过各自序列片段的靶向诱 变产生。在这种情形中，具有某些特性诸如极性、电荷、溶解性、疏水性 或亲水性的氨基酸可以分别被具有各种其他特性的氨基酸替换或取代。除 取代外，术语"诱变"还包括插入和缺失。在蛋白质水平上，修饰还可以 通过按照本领域中那些技术人员已知的方法化学改变氨基酸侧链进行。
例如泛蛋白-样蛋白的cDNA可以起诱变各自序列片段的起始点的作 用，其可以通过本领域中那些技术人员已知的方法制备、改变、和扩增。 对于一级序列相对小区域内的泛蛋白位点-特异性改变(约1-3个氨基酸)， 可商购的试剂和方法是现成的("快速改变"("QuickChange") ， Stratagene; "诱变剂噬菌粒体外诱变试剂盒"("Mutagene Phagemid Z" *o Mutagenesis Kit") , Biorad)。为了较大区域的位点定向诱变，例如聚合酶 链反应(PCR)的特异性实施方案是本领域中那些技术人员可以使用的。 为了该目的，在理想位置处具有简并碱基对组成的合成的寡脱氧核苷酸的 混合物可以用于例如引入突变。这还可以通过使用基因组DNA中天然不 存在的碱基对类似物，诸如例如肌苷实现。
诱变a螺旋区的起始点可以是例如泛蛋白-样蛋白的cDNA或还可以 是基因组DNA。此外，编码所述蛋白质的基因也可以合成地制备。
不同本身已知的方法可用于诱变，所述方法是用于位点-特异性诱变的 方法、用于随机诱变的方法、利用PCR的诱变或相似方法。
在本发明的优选实施方案中，预先确定待诱变的氨基酸位置。对待修 饰的氨基酸的选择根据待修饰的蛋白和/或根据选择的结合配偶体进行。在每种情形中，通常构建不同突变体的文库，利用本身已知的方法对其进行 筛选。自然地，如果可获得关于待修饰蛋白充足的结构信息，则可以特别 容易地进行待修饰氨基酸的预选择。然而，在没有所述结构信息的条件下， 利用使用随机诱变和随后选择的方法也可能改变具有泛蛋白-样折叠基序 的蛋白，从而接受分别关于预先确定的抗原或结合配偶体的结合亲和性。 可以形成基于例如8， 10, 14或18个氨基酸位置的文库(见实施例章
节)。优选的文库坐标是E16, E18, S20, D21, T22, E24, N25， A28， K29， Q31, D32， K33， P38, D39, D52， G53, R54， T55。
用于例如通过PCR，通过化学诱变或利用细菌增变株进行的耙向诱变 以及较长序列片段诱变的方法也属于现有技术并可以按照本发明使用。
在本发明的一个实施方案中，诱变通过装配携带密码子三联体化学计 量(stochiometry) NNK的DNA寡核苷酸进行。然而，应该理解，还可 以使用其他密码子化学计量，优选地NNB和NWB基序。
在本发明的另一个实施方案中，使用编码至少2或3个氨基酸，优选 地4,5，6，7,8,10，12，13，14,15,16,17,18或19个氨基酸的密码子三联体化学计
以维持二级结构的方式进行突变。包括一级结构中相对小的区域(约 3-5个氨基酸)的位点-特异性诱变可以使用可商购的Stratagene (快速变化 (QuickChange))或Bio-Rad (诱变剂噬菌粒体外诱变试剂盒(Mutagene phagemid v!'rro mutagenesis kit))试剂盒产生(参考US-A-5,789,166; US-A-4,873,192)。
如果对更广阔的区域进行位点-特异性诱变，则必须制备DNA盒，其 中待诱变的区域通过装配包含突变的和未改变的位置的寡核苷酸获得 (Nord等，1997; McConell和Hoess, 1995)。随机诱变可以通过增变株中的 DNA增殖或通过PCR扩增(倾向差错的PCR)引入(例如Pannekoek等， 1993)。为了该目的，使用具有增高差错率的聚合酶。为了分别提高引入的 诱变的程度或为了组合不同的突变，可以通过DNA改组组合PCR片段中 的突变(Stemmer， 1994)。这些关于酶的诱变策略综述提供在Kuchner和 Arnold (1997)的综述中。为了在选择的DNA区域内进行这种随机诱变， 也必须构建用于诱变的DNA盒。
19按照本发明优选的实施方案，仅修饰不属于这样的区域的氨基酸位 置，以产生新结合特性，所述区域在未修饰的泛蛋白中不参与与泛蛋白的 天然结合配偶体的连接。这确保不仅是改变已经存在的泛蛋白结合特性。
用于修饰的区域可以基本关于它们是否能够被可能的结合配偶体接 近和蛋白质的总结构是否推定表现出针对修饰的耐受性而选择。
按照本发明，在蛋白质，优选地来自哺乳动物的泛蛋白中，a螺旋区 中存在的至少15%的氨基酸，优选至少20%，更优选至少25%可以被修饰， 优选被取代，从而形成先前不存在的结合特性。作为最大量，优选a螺旋 区中存在的约40%的氨基酸，更优选最多约35%和甚至更优选约30%被修 饰，优选被取代。
按照优选的实施方案，所述修饰包括5-10个氨基酸，优选6-8个氨基 酸的邻接区域，其中优选其2-4个氨基酸位于a螺旋的表面-暴露区内。
在按照本发明的蛋白质中，a螺旋链的氨基酸被修饰，且任选另外地， 位于a螺旋外的螺旋上游位置或螺旋下游位置中的氨基酸被修饰。如上述， 在高度优选的实施方案中，a螺旋链的氨基酸22-32被修饰，且任选另外 地(在哺乳动物的泛蛋白氨基酸中)，位于a螺旋外的氨基酸区域16-21 (螺旋上游位置)或38-55 (螺旋下游位置)被修饰。优选地，在本发明 的蛋白质中，修饰的蛋白是取代的、缺失的、插入的和/或化学修饰的，优 选地在位置16, 18, 20， 21, 22， 24, 25， 28， 29， 31， 32, 33, 38， 39, 52, 53, 54, 和/或55中的4个或更多位置取代的人泛蛋白。
在本发明的蛋白质中，优选地， 一级序列中彼此直接相邻的一部分修 饰的氨基酸处于a螺旋区的开始或终止区域，其中该部分具有2个或更多 氨基酸，优选2或3个氨基酸的长度。
在另一个实施方案中，本发明的蛋白是人泛蛋白或其同源蛋白，其中 泛蛋白中螺旋的至少4个氨基酸被修饰，优选被取代，以使这些修饰的氨 基酸包括对结合配偶体具有结合亲和性的区域。
如上所述，本发明在主要方面涉及用于生成蛋白的方法，所述蛋白选 自由"泛蛋白-样蛋白"蛋白超家族的蛋白，即具有泛蛋白-样折叠基序的 蛋白及其各自具有泛蛋白-样折叠基序的片段或融合蛋白组成的组，其中所 述蛋白由于在a螺旋区中的一个或多个氨基酸修饰显示出关于试剂的提高的结合亲和性，所述结合亲和性在未修饰的蛋白质中不存在或不以该程度 存在，所述方法具有下列步骤
a) 选择"泛蛋白-样蛋白"超家族的未修饰蛋白；
b) 提供所述未修饰蛋白对其具有低的或不具有结合亲和性的试剂；
c) 在包括a螺旋区的蛋白质表面-暴露区中选择氨基酸；
d) 优选地通过取代、插入、缺失和/或化学修饰修饰选择的氨基酸， 其中所述a螺旋或相邻区域中至少4个表面-暴露氨基酸被修饰；
e) 使所述修饰的蛋白与步骤b)中提供的试剂相接触；
f) 检测具有关于步骤b)中提供的试剂的新或增高的结合亲和性的蛋 白，和任选地
g) 在合适的原核、真核、体外蛋白质表达系统中或通过化学合成生 成所述修饰的蛋白；
h) 在生成后通过合适的纯化方法分离所述蛋白；和进一步任选地
i) 通过重复步骤d-h)进行所述修饰蛋白的熟化。 在优选的实施方案中，步骤d)通过化学合成所述修饰的蛋白执行，
或备选地，步骤d)中的修饰通过遗传工程执行，从而改变属于相应的修 饰蛋白的DNA。
如上所述，在步骤d)中，基因库优选通过随机诱变，或进行所选择 的氨基酸的随机取代形成。
在步骤e)中，与预先确定的结合配偶体的接触优选通过合适的选择 方法，优选地噬菌体展示、核糖体展示、mRNA展示、CIS展示或细胞表 面展示方法、酵母表面展示、细菌表面展示，特别优选通过噬菌体展示方 法进行。
在步骤f)中，检测具有针对预先确定的结合配偶体的结合亲和性的 蛋白优选通过一种或多种下列方法进行ELISA、胞质基因表面共振光谱 法、共振模式(resonance profiling)、珠技术、荧光光谱法、FACS、等温 滴定热量测定或分析超速离心法。
在一个实施方案中，利用本身已知的方法，针对其结合亲和性、其结 合特异性和/或其他蛋白质化学特性诸如稳定性、溶解性、或产量熟化所述 蛋白质。此外，本发明的蛋白以位点-特异性或随机-样方式与至少一种相同或 不同特异性的蛋白共价连接，并由此分别显示出二价或多价或双特异性结 合特性。
本发明还提供通过上文中公开的方法能够获得的蛋白质。 本发明还涉及编码所述蛋白质的核酸。
一般地，术语"核酸"用于本
文时，包括RNA和DNA，所述DNA包括cDNA、基因组DNA、和合成 的(例如化学合成的)DNA。
修饰选择的氨基酸的步骤按照本发明，优选地通过在遗传水平上通过 随机诱变，即随机取代选择的氨基酸引起的诱变进行。优选地，步骤d) 中的修饰通过改变属于各自蛋白质的DNA的遗传工程方法进行。优选地， 然后，所述蛋白质的表达在原核或真核生物体中进行。
按照本发明，修饰的蛋白可以进一步优选通过化学合成制备。在该实 施方案中，第二实施方案的步骤c) -d)于是以一步进行。
下文分别举例说明选择和确定具有针对预先确定的结合配偶体，本文 中也简称为"试剂"的结合亲和性的氨基酸
通过修饰选择的氨基酸形成蛋白质文库后，按照本发明使修饰的蛋白 质与预先确定的结合配偶体相接触，从而任选地允许所述配偶体彼此结 合，条件是如果结合亲和性确实存在。
按照本发明的接触优选通过合适呈递和选择方法诸如噬菌体展示、核 糖体展示、mRNA展示或细胞表面展示、酵母表面展示或细菌表面展示方 法，优选地通过噬菌体展示方法进行。对于完全的公开，还参考下列参考 文献Hoess,当前结构生物学观点(Curr. Opin. Struct. Biol.) 3 (1993), 572-579; Wells和Lowmann,当前结构生物学观点(Curr. Opin. Struct. Biol.) 2 (1992), 597-604; Kay等，肽和蛋白质的噬菌体展示一一实验室手册 (Phage Display of Peptides and Proteins - A Laboratory Manual) (1996)，学 术出版社(Academic Press)。上文提到的方法是本领域中那些技术人员已 知的，且包括其改进可以按照本发明使用。
确定修饰的蛋白是否具有针对预先确定的结合配偶体的可计量的结 合亲和性可以按照本发明，优选地通过下列方法中的一种或多种进行 ELISA、胞质基因表面共振光谱法、荧光光谱法、FACS、等温滴定热量测定或分析超速离心法。
适合于这种应用的一种噬菌体展示程序类型记述在下列各项中，作为 按照本发明针对显示结合特性的泛蛋白变体的选择程序的实例。以相同的
方式，可以应用例如用于在细菌(潘慮表厫展^Daugherty等，1998)或酵母 细胞(^母表面展示；Kieke等，1997)或无细胞选择系统诸如提薪沐展示 (Hanes和Pliickthun， 1997; He和Taussig, 1997)或展示(Odegrip等， 2003)或mRNA展示上呈递的方法。在后者情形中，基因型和表型的瞬间 物理连锁通过将蛋白质变异通过核糖体偶联于合适的mRNA而实现。
在本文中所述的噬菌体展示程序中，泛蛋白的重组变异存在于丝状噬 菌体上，而存在的变异的编码DNA同时以单链形式堆积在噬菌体包膜中。 因此在亲和性富集的框架中，具有某些特性的变异可以选自文库，并且它 们的遗传信息可以分别通过感染合适的细菌而扩增或加入到另一富集周 期中。突变泛蛋白在噬菌体表面上的呈递通过与氨基端单信号序列——优 选地，PdB信号序列——和噬菌体的衣壳或表面蛋白——遗传融合——优 选是羧基端融合于所述衣壳蛋白pIII或其片段——实现的。此外，编码的 融合蛋白可以包含其他功能性元件，诸如例如用于在亲合富集期间通过亲 合层析法或关于融合蛋白特异性切割的蛋白酶识别序列进行检测和/或纯 化的亲合标记物或抗体表位。此外，琥珀终止密码子可以存在于例如关于 泛蛋白变异的基因和噬菌体衣壳蛋白或其片段的编码区域之间，部分由于 引入一个氨基酸，其在合适的抑制菌株中的翻译过程中不被识别。
在分离具有对预先确定的半抗原或抗原的结合特性的泛蛋白变体的 情形中适用于选择程序和向其中插入关于所述融合蛋白的基因盒的细菌 载体称为噬粒。其中，它包含丝状噬菌体(例如M13或fl)的基因间区域 或其一部分，其在通过辅助噬菌体诸如例如M13K07超感染携带噬菌粒的 细菌细胞的情形中导致噬粒DNA闭合链包装到噬菌体衣壳中。以这种方 式产生的噬菌粒通过细菌分泌并呈现各种编码的泛蛋白变异——这归因 于它与衣壳蛋白pIII或其片段——在它们表面上的融合。天然pIII衣壳蛋 白存在于噬菌粒中，以便保持其重新-感染合适细菌菌株的能力和因此扩增 相应DNA的可能性。因此，确保泛蛋白变异的表型——即其潜在的结合 特性——和其基因型之间的物理连锁。可以通过本领域中那些技术人员已知的方法，针对其上存在的泛蛋白 变异与预先确定的半抗原或抗原的结合选择所获得的噬粒。为了该目的， 存在的泛蛋白变异可以瞬间固定在结合在例如微滴定板上的靶物质，并可 以在己经分离非-结合变异后特异性洗脱。洗脱优选通过碱性溶液诸如例如 100mM三乙胺进行。备选地，洗脱可以在酸性条件下，通过蛋白质水解 或直接添加感染的细菌进行。以这种方式获得的噬菌粒可以通过对具有与 预先确定的半抗原或抗原的结合特性的泛蛋白变异的连续选择和扩增周 期重新-扩增和富集。
以这种方式获得的泛蛋白变异的其他表征可以以噬菌粒，即与噬菌体 融合，或在将相应的基因盒克隆到处于可溶性蛋白质形式的合适表达载体 中后进行。合适的方法是本领域中那些技术人员已知的或记述在本文献
中。所述表征可以包括例如确定DNA序列和由此确定分离的变异的一级
序列。此外，分离的变异的亲和性和特异性可以例如通过免疫学标准方法
诸如ELISA或胞质基因表面共振光谱法、荧光光谱法、FACS、等温滴定 热量测定或分析超速离心法检测。考虑到稳定性分析，例如与化学或物理 解折叠有关的光谱法是本领域中那些技术人员已知的。
在还使用的/,凝沐^^^^呈序中，泛蛋白变异通过无细胞转录/翻译系统 制备并作为与相应mRNA以及核糖体的复合物存在。为了该目的，使用 如上所述的DNA文库作为基础，其中变异的基因以与关于表达和蛋白质 生物合成的相应调节序列融合的形式存在。由于基因文库的3'末端终止密 码子的缺失以及合适的实验条件(低温，高Mg^浓度)，在体外转录/翻译 过程中维持由新生蛋白、mRNA和核糖体组成的三元复合物。
这些复合物可以针对存在于其上的泛蛋白变异与预先确定的半抗原 或抗原的结合，通过本领域中那些技术人员已知的方法进行选择。为了该 目的，核糖体复合物上存在的泛蛋白变异分别可以瞬间固定于结合在例如 微滴定板上的靶物质，或可以在溶液中结合后与磁性粒子结合。分离非-结合的变体后，具有结合活性的变体的遗传信息可以通过破坏核糖体复合 物，以mRNA的形式特异性洗脱。所述洗脱优选使用50 mM EDTA进行。 以这种方式获得的mRNA可以分离并利用合适的方法(反转录酶反应) 反转录成DNA，以这种方式获得的DNA可以重新-扩增。
24通过连续的体外转录/翻译、选择和扩增周期，可以富集具有关于预先 确定半抗原或抗原的结合特性的泛蛋白变异。
以这种方式获得的泛蛋白变异的其他表征可以以如上所述的可溶性 蛋白形式，在将相应的基因盒克隆到合适载体后进行。合适的方法是本领 域中那些技术人员己知的或记述在参考文献中。
表达按照本发明修饰的具有泛蛋白4羊折叠基序的蛋白后，可以通过本 身己知的方法进一步对这些进行纯化和富集。选择的方法依赖于若干本身 对本领域中那些技术人员已知的因素，例如使用的表达载体、宿主生物体、 目的使用领域、蛋白质的尺寸和其他因素。为了简化的纯化，可将按照本 发明修饰的蛋白融合于具有对分离物质增高的亲和性的其他肽序列上。优 选地，选择这样的融合，即其对泛蛋白功能性不具有决定作用或由于引入 特异性蛋白酶切割位点可以在纯化后分离。所述方法本身也是本领域中那 些技术人员已知的。
按照本发明和特别地按照以上刚刚描述的程序， 一般可以分离具有针 对预先确定的结合配偶体诸如例如半抗原或抗原的结合亲和性的泛蛋白 变异。注意到术语"预先确定的结合配偶体"对应于术语"试剂"。同样 地，"对其不存在或不以该程度存在结合亲和性的预先确定的结合配偶 体"对应于"未修饰蛋白对其具有低的或无结合亲和性的试剂"。
作为按照本发明提供的修饰的蛋白的结合配偶体(试剂)，可以使用 所有生物学和医学活性和相关分子。可能的结合配偶体将通过实施例的方 式记述如下。然而，应该注意到，许多其他可能的配体可以加入到该列表 中。类似于抗体和抗原之间的关系，潜在的结合配偶体的列表可以通过其 他潜在的配体完善。
优选地，所述结合配偶体是生物学受体，优选G蛋白-偶联受体(GPCR;
例如人GLP-1受体、人PTH受体、人andrenergic受体)、或EGF受体、 IGF1R、 HER2、 HER3、 VEGF/Rl-4、 Ep-CAM、或其配体或结构域、肿 瘤标记(前列腺特异性膜抗原(PSMA))、细胞因子(肿瘤坏死因子a (TNF-a)、肿瘤坏死因子P (TNF-fi)、白细胞介素(例如IL-2, IL-6, IL-8, IL-11,IL-12，IL-13)、生长因子(例如NGF(神经生长因子)及其前体-形式 (pro画form)、 ProNGF、 BMPs、 EGF、 MIA、 MIA-2、 FGFs、血管内皮生长因子(VEGF)、 PDGF、 P1GF、 IGFs)、激酶、整联蛋白(例如，糖蛋白受 体1Ib/IIIa (GPIIb/IIIa))、 HSA(人血清清蛋白)、F4丝束蛋白、T和B细胞 抗原，优选地CD4、 CDll、 CD14、 CD16、 CD20、 CD22、 CD25、 CD34、 CD47、 CD56、 CD83、 CD154、 CTLA-4、免疫球蛋白或其部分，例如全抗 体、(例如免疫球蛋白G,E,M)、例如人免疫球蛋白M的Fc部分或抗原结 合位点区域中的抗体片段、或糖(Lewis Y, Lewis X)、或毒素，例如真菌毒 素、或激素，例如皮质醇。
此外，本发明的蛋白质可以用于检测和用于定量测定以及用于分开和 分离各种结合配偶体。
另一种应用是用在各种结合配偶体参与其中的疾病的诊断和治疗中。
如已经提到地，本发明还涉及位于从头生成的人工结合位点外的各个 氮基酸位置的靶向改变。以这种方式，例如由负责天然泛蛋白生物学功能 的氨基酸占据的位置可以被其他氨基酸占据。以这种方式，获得这样的泛 蛋白蛋白支架，即，所述泛蛋白蛋白支架，针对其生物学功能诸如例如针 对与遍在蛋白化级联的酶的相互作用是失活的，但是针对其结构和蛋白质 化学特性在很大程度上与起始蛋白一致。
因此，对于按照本发明修饰和选择的蛋白质，可用于广谱的可能的应 用。它们可以不仅用在医-药领域，还用在分析学、营养和食品工业、营养 增补剂、化妆品、医学和非-医学诊断和分析等领域中。自然地，使用领域 依赖于选择的结合配偶体的类型。
在人和兽医治疗和预防领域中，药物有效药物可以通过本身已知的方 法制备。根据草药制剂，这些组合物可以静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、 经皮、或通过其他应用方法施用。药物制剂的类型依赖于待治疗的疾病的 类型、疾病的严重性、待治疗的患者和医学领域中那些技术人员已知的其 他因素。施药可以通过注射或灌输、吸入、全身、口服、直肠或通过其他 常规使用的方法肠胃外进行。
使所述组合物适合包含治疗有效剂量。待施用剂量的量依赖于待治疗 的生物体、疾病的类型、患者的年龄和体重和其他本身已知的因素。
所述组合物可以包含本身已知的辅剂。这些包括例如稳定剂、表面-活性剂、盐、缓冲剂、着色剂等。所述药物组合物可以处于用于局部施用的液体制剂、霜剂、洗剂形式， 气雾剂，处于粉剂、粒剂、片剂、栓剂、或胶囊的形式，处于乳剂或脂质 体制剂的形式。所述组合物优选地是无菌的、非-致热性的和等渗的，其包 括本身己知的药物常规和药用添加剂。另外，参考美国药典的规章。
提供下列实施例进一步举例说明本发明。本发明特别利用关于泛蛋白 的修饰作为实例进行示范。然而，本发明不仅限于此，且下列实施例仅显 示本发明在以上说明书基础上的可行性。为了完全公开本发明，还参考本 申请中和附件中引用的文献，将其完整引入本申请作为参考。
在下文中，将关于实施例和附图更详细地描述本发明，其中图解下列 各项
图l:人野生型泛蛋白的带状结构图(Ribbon diagram)。 (PDB 1D3Z; Pymol,版本0.98)
图2:人野生型泛蛋白的带状结构图。(PDB1D3Z)。将装配蛋白质疏 水性核心的氨基酸绘成绿色球体。(Pymol,版本0.98)。
图3:人野生型泛蛋白的带状结构图。(PDB 1D3Z)氨基酸T22, E24， N25, A28， K29， Q31，D32禾B K33属于螺旋(红色)。螺旋-上游位置E16, E18, S20, D21绘成绿色。螺旋下游位置P38, D39， D52, G53, R54， T55绘成橙色。 文库中主要部分是螺旋。(Pymol,版本0.98)
图4:人野生型泛蛋白的表面图(surface presentation)。 (PDB 1D3Z)氨 基酸T22, E24, N25, A28, K29， Q31， D32和K33属于螺旋(红色)。螺旋-上游位置E16， E18, S20, D21绘成绿色。螺旋下游位置P38， D39, D52, G53, R54，T55绘成橙色。文库中主要部分是螺旋。(Pymol，版本0.98)
图5:人野生型泛蛋白的表面图。(PDB 1D3Z; Pymol,版本0.98)。将 最大结合位点1485 V染成红色。
图6:人野生型泛蛋白的带状结构图。(PDB 1D3Z; Pymol,版本0.98) 将装配基于折叠的文库的氨基酸位置染成蓝色。
图7:人野生型泛蛋白的表面图。(PDB lD3Z;Pymo1,版本0.98)将装 配基于折叠的文库的氨基酸染成蓝色。
图8:核糖体展示构建体SPAIO。将引物绘成蓝色箭头。使用引物forw. MunRD和R3MunEco为文库片段和间隔片段后来的限制性连接产生EcoRI和MunI限制性位点。引物RDRT用于反转录。引物对F1/RDRT和 F1A/RDRT用于在核糖体展示选择程序中的PCR扩增。红叉标记引物 SPAF2、 SPAF3和SPAR2，其引入位点定向的突变，从而产生所述文库。
图9:示范性击中-ELISA，显示SPA10文库的变体相对TNFa (红色) 和作为背景的BSA(蓝色)。
图10:结合TNFa的泛蛋白变体2E11的氨基酸序列。IO个取代的氮 基酸位置标记为黄色。位置K33变为E (红色)。
图lh纯化泛蛋白变体2E11过程中的SEC(Superdex 75, 1.6 x 60, GE 卫生保健(GE Healthcare))层析模式图。级分B5用于进一步的结合研究。
图12:显示SPA14变体2E11的TNFa浓度-依赖性结合特征的ELISA。 实心圆变体2E11相对TNFa。空心圆变体2E11相对BSA。通过非线 性S形曲线拟合，确定表观亲和性为400 nM (R = 0,99)。拟合通过cj图(版 本6.10)创建。
实施例
在下文中，存在这样的数据，其描述如何利用螺旋作为中心二级结构 基序构建泛蛋白文库。通过核糖体展示选择技术的一些实施方案选择相对 TNFa的结合活性变体。在大肠杆菌中作为可溶性蛋白重组生成结合剂。 显示TNFa结合活性的变体通过ELISA击中-筛选程序鉴定。通过浓度依 赖性ELISA，这些针对TNFa的"第一代"结合剂的表观亲和性确定为 400nM。
泛蛋白文库及其不同实施方案的文库坐标
氨基酸T22, E24, N25， A28, K29, Q31， D32和K33属于人泛蛋白的a 螺旋并代表文库的核心-位置(图3)。螺旋上游-位置E16， E18， S20， D21 和螺旋下游位置P38, D39， D52, G53, R54, T55另外将表面可及面积扩大到 最大值1485 A2 (图4、 5)。这些周围的位置属于泛蛋白的连接转角环。位 置F45突变为W，以增高消光系数，从而促进光谱分析(Khomsanizadeh, Peters等，1993)。随机化总共最多11个残基。构建螺旋文库的不同实施 方案。在第一实施方案中，生成SPA10文库，其中利用NNK密码子化学
28计量，在DNA水平上随机化10个氨基酸位置(S20， T22， E24, N25, A28, Q31,P38,G53,R54,T55)。 SPA10文库应该形成750 A2的表面。在第二种 方法中，随机化14个位置(SPA14 : S20， D21, T22, E24, N25， A28, K29, Q31, D32,P38D52,G53,R54，T55)，从而形成扩大的表面1011 A2。最后的方法 是SPA18文库，通过所述文库诱变18个残基，从而形成最大表面1485 A2 (E16, E18, S20, D21, T22, E24, N25, A28, K29， Q31, D32， K33, P38, D39, D52, G53，R54, T55)。
在下文中描述了实施例，是TNFa结合泛蛋白变体，其选自SPA10文库。
实施例l:
描述基于PCR合成SPA10文库
在重叠延伸连接PCR中，装配5个寡核苷酸，从而合成DNA片段文 库(图8)。将三种合成引物SPAF2、 SPAF3和SPAR2合成为序列特异性 随机化寡核苷酸，其编码SPA10螺旋文库。
进行第一合成-步骤如下100inl的PCR体积，其包括0，2 mM dNTPs (lOmM储液，dNTP混合物，罗氏(ROCHE) ); 5单位PWO聚合酶(250 单位储液， 罗氏)； 1 pM 引物 SPAF1 5'-GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCAGATTTTTGTGAAAA CCC-3'; 0,25 pM引物SPAF2 5'画CACTCTGGAAGTGGAGCCCNNKGA CNNKATC丽K丽KGTGAAGNNKAAGATCNNKGACAAGGAGGGCAT CCCG-3'; 0，25引物SPAF3 5'- CTGGGCGGGTAAACAGCTCGAA GACNNKNNKKNKCTGAGCGATTACAACATCCAGAAAGAAAGC-3'; 1 一弓|物 SPAR1 5'陽CGCAGACGCAGCACCAGATGCAGGGTGCTTT CTTTCTGGATGTTGTAATCGC隱3'; 0，25一 弓|物 SPAR2 5'-CGAGCTGTTTACCCGCCCAGATCAGACGCTGCTGATCMNNCGGGAT GCCCTCCTTGTC-3'; 0,25pM引物SPAR3 5'画GGGCTCCACTTCCAG AGTGATGGTCTTGCCGGTCAGGGTTTTCACAAAAATCTGC画3'。 PCR模 式如下(30秒94。C; 60秒55°C; 40秒72°C) x 30。
将PCR产物在1,5 %溴化乙锭-染色的琼脂糖凝胶中分离。利用Qiagen凝胶提取试剂盒，按照供应商的使用说明，从凝胶中提取250bp处的目标 DNA-条带。为了形成约10"个变体的文库尺寸，将至少100ng第一合成 步骤的纯化PCR产物转移到下一个附加PCR (Add-on PCR)步骤中作为 模板。在该合成步骤中，通过末端引物重新扩增文库片段，其附加调节序 列如RBS基因10基序(Fl引物)和用于随后的限制性连接程序的EcoRI 限制性位点。所述PCR测定法组合100 )il的体积，其包括0,2 mM dNTPs (10 mM储液，dNTP混合物，罗氏(ROCHE) ); 5单位PWO聚合酶(250 单位储液，罗氏)；1 pM 弓|物Fl 5'-GGAGACCACAACG
ATG-3'禾卩1 ]LiM 弓|物 R3MunEco 5'-GAATTCACTACCTCCG CCGCCACGCAGACGC AGC ACCAGATGC-3'。
PCR模式如下(30秒94。C; 60秒65°C; 40秒72°C) x 30。 .再次将PCR产物在1,5 %溴化乙锭-染色的琼脂糖凝胶中分离。如上所 述，从所述凝胶中分离305bp处的目标DNA条带并进行纯化。
将100ng来自步骤2的PCR产物转移到最终合成PCR中作为模板。 PRC的设置如上所述，利用各1 的引物
F1A5 '-C ATACGAAATTAATACG ACTC ACTATAGGGAGACC AC AACGGT TTCCC-3'禾卩R3MunEco。正向引物F1A在DNA片段上游引入T7启动子 序列。PCR模式是(30秒94。C;60秒60。C;40秒72。C)x30。
再次从制备级溴化乙锭-染色的1,5 %琼脂糖凝胶中分离333bp处的 PCR产物。如已在上文所述，纯化PCR产物，所述PCR产物类似于编码 SPA10的DNA片段。
按下述生成核糖体展示间隔。质粒pIVEX2.3MCSRD包含核糖体展示 间隔的DNA序列。该序列没有天然存在的同族序列。其在mRNA3'-末端 不包含任何为了停止翻译核糖体的终止密码子。315bp的间隔序列是5'-
GGAGGTAGTCAATTGGCTGGCTCTGGAGCTGGTGCAGGCTCTGGTGCTGGCGCAGGTTCT
GGCGCTGGTGCTGGTTCTGGCACTGGTGCTTCTCCGGCAGCTGTTCCGGCAGCGGTTCCA
GCAGCGGTGCCGGCAGCAGTTCCTGCTGCGGTGGGCGAAGGAGAAGGAGAAGGCGAGG
GAGAGGGCGAAGGATACCCGTACGACGTACCGGACTACGCCGAAGGTGGTGGTGGCTCC
GAGCAGAAGCTCATCTCCGAAGAAGACCTGGAGGGTGGTGGTGGCTCCACAGACTACAA
GGACGACGACGACAAATCC -3'。PCR设置包括处在lOOpl体积中的下列各项0，2mMdNTPs(10mM 储液，dNTP混合物，罗氏(ROCHE) ); 5单位PWO聚合酶(250单位储 液，罗氏)；5ng质粒DNA pIVEX2.3MCSRD。使用各1 pM的引物 forw.MunRD
5 '-GGCGGCGGAGGTAGTGAATTCGCTGGCTCTGGAGCTGGT-3' 和 RDRT
5 '匿GGATTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAGTCTGTGGAGCCACCACC-3'。 正向引物forw.MunRD引入用于随后的核糖体展示间隔与文库DNA
片段的限制性连接步骤的Muni限制性位点。
PCR模式是(30秒94°C; 60秒50°C; 40秒72。C) x 30。
在制备级1.5 %琼脂糖凝胶中电泳进行完整PCR测定。由EtBr染色所
述凝胶，并从该凝胶中分离220bp。如已在上文所述地纯化DNA。
利用限制性连接步骤将螺旋文库与核糖体展示间隔相连接。在该合成
步骤中，将文库DNA片段连接于核糖体展示间隔DNA片段，从而产生完
全功能的核糖体展示构建体。
该反应包含10单位(l pi) Muni (Cat.No. R0589S, NEB), 10单位(l EcoRI (Cat.No.: R0101S， NEB), 5 |il 10x缓冲液NEB4， 1,25 mM ATP溶液 (25 mM储液，Fermentas)， 2,000单位(2.5 pi) T4 DNA连接酶(NEB浓度)1 pg提取的文库片段和1 )ig展示间隔，各处在19pl溶液中。在室温下过夜 培养后，在制备级琼脂糖凝胶中电泳进行完整的测定。从该凝胶中分离 633bp处的反应产物，并利用Qiagen凝胶提取试剂盒，按照供应商的使用 说明进行提取。最后，利用Qiagen小洗脱试剂盒(Qiagen Mindute kit), 按照供应商的使用说明，将50pl洗出液浓縮5倍。
在链霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白-包被的MTP板中固定靶分子
用通用缀合缓冲液(Conjugate Buffer Universal)(罗氏)清洗一反应 体积(RV)的MTP孔三次。将0,1 生物素化的人TNFa溶解在100 pi 缀合缓冲液中，并填入预制的MTP的孔中。将生物素化的配体固定在链 霉抗生物素蛋白-(罗氏)或抗生物素蛋白-包被的(PIERCE) MT-板的孔中。 室温下，在500rpm摇动下，将配体-溶液在MT-板中温育30分钟。其他MTP-孔仅用lOOnl省略所述配体的封闭试剂(处在缀合缓冲液中的5% BSA)包被。随后，使用这些孔预温育核糖体展示混合物10分钟，从而 耗尽非特异性结合的三元复合物。所有孔用3RV封闭试剂清洗。在4。C 和200rpm下，在各孔中温育300^1封闭试剂。在应用终止的翻译-混合物 前，用3 RV的冰冷缓冲液WB (50 mM Tris. pH 7,5 (4。C); 50 mM乙酸镁; 150mMNaCl; 33mMKCl;0,1 %吐温20; 5 % BSA)清洗孔。将板保存在冰 上。在选择周期过程中，所述板交替用于耗尽背景-结合的变体。
相对于人TNFa的具有SPA10文库的核糖体展示
按照供应商的使用说明组合100^1 RTS 100大肠杆菌HY混合物(罗 氏)。向所述混合物增补40单位(l pl) RNAsin+ (温度稳定的RNA酶抑制 齐廿，普洛麦格(Promega))和10 pl核糖体展示DNA模板。在30 。C， 550 rpm 摇动下，在干净的1.5ml反应管中进行转录和翻译40分钟中。
使用500pl冰冷缓冲液SB(50 mM Tris. pH 7,5 (4。C); 50 mM乙酸镁; 150 mM NaCl; 33 mM KC1; O，l %吐温20; 5 % BSA; 5吗tRNA (大肠杆菌); 4mMGSSG;25 |iM氯霉素)，立即终止反应。在2。C，以> 10.000 g离心 该混合物IO分钟。
将上清液转移到新的冰冷的1.5ml反应管中。将250^1所述混合物转 移到链霉抗生物素蛋白-包被的MTP的空预温育-孔中，并在4°C， 300 rpm， 温育10分钟。然后将该混合物转移到选择孔中，其中固定了生物素化的 人TNFa。在4。C， 300rpm，培养该混合物30分钟。
为了去除背景蛋白和弱结合三元复合物，用300jal冰冷缓冲液WB (50 mM Tris. pH 7，5 (4°C); 50 mM乙酸镁；150 mM NaCl; 33 mM KC1; 0,1 % 吐温20; 5 % BSA)清洗孔。用lOOpl冰冷缓冲液EB (50 mM Tris. pH 7,5 (4。C); 20 mM EDTA; 150 mM NaCl; 33 mM KC1; 0,1 %吐温20; 5 % BSA)， 在4 °C和750 rpm进行洗脱10分钟。
将100^1洗出液与350W来自Qiagen RNA Easy试剂盒的缓冲液RLT 混合。短暂涡旋该溶液。下列mRNA纯化按照供应商的使用说明进行。 用50nl无RNA酶的水洗脱mRNA。洗出液再用于第二洗脱-步骤。
为了避免受到来自翻译-步骤的DNA的污染，利用Ambion无DNA试剂盒去除洗出液中剩余的DNA-模板(DNA-消化)。向50W洗出液中增 补5.7 pi DNA酶I缓冲液和1.3 ^含有DNA酶的溶液。在37 °C温育该 混合物30分钟。加入6.5pl DNA酶I失活试剂。在消化-测定中，室温下 温育该悬浮液3分钟，并随后在11.000 g离心l分钟。上清液用于反转录
为了mRNA的反转录，使用Transcriptor反转录酶(罗氏)。完整反应 体积是20|il : 12 |il mRNA洗出液；1 pM引物 RTRD 5 '隱GGATTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAGTCTGTGGAGCCACCACC-3'; 4 Hi Transcriptor反应缓冲液5x, RNAsin+ 0.5 pi (20单位，普洛麦格 (Promega)) , 1 mM dNTP-混合物。小心离心沉淀该混合物。将反应管置于 65。C预-平衡的热循环器中。在65。C5分钟后，加入10单位(0.5|il)的 反转录酶。随后将该混合物在65。C温育45分钟。
随后，在100^1标准PWO-PCR中扩增cDNA，所述100jal标准 PWO-PCR包含12 转录混合物、5单位PWO DNA-聚合酶和引物RTRD 和F1。 PCR模式是:(30秒94。C,60秒65。C;40秒72。C)x25个循环。
将获得的PCR产物在1，5 %琼脂糖凝胶中电泳。利用Qiagen凝胶提取 试剂盒小洗脱试剂盒(Qiagen Gel Extraction Kit Minelute kit)，从溴化乙锭 -染色的凝胶中分离各个目标DNA-条带。将PCR产物洗脱在lO)il EB缓 冲液(Qiagen)中。
在IOOW包含IOjlU洗出液、5单位PWO-DNA-聚合酶(热起动)和引 物F1A和RDRT的PCR中再扩增PCR-产物。PCR模式(30秒94°C, 60 秒60 。C; 40秒72 。C) x 30个循环。在制备级1.5%琼脂糖凝胶中电泳进行 完全PCR测定，并通过溴化乙锭染色。利用Qiagen凝胶提取试剂盒，按 照供应商的使用说明，分离目标-条带。将PCR产物洗脱到50|iil EB缓冲 液中。该样品用于接下来的核糖体展示循环。
核糖体展示程序重复6次。在第三、第四和第五展示循环中选择的其 他实施方案中，除半胱氨酸外，将各2mM的所有必需的氨基酸分别增补 到RTS100HY系统。因此，在选择过程中消除包含半胱氨酸的变体。在选 择程序的其他实施方案中，利用链霉抗生物素蛋白-包被的磁珠，如在溶液 中选择和如在溶液中竞争地进行选择步骤。按下述制备所述珠20(il所述珠溶液(Invitrogen， M270 Dynabeads) 在300 plNaH2PO4缓冲液，pH8中清洗5次。然后，所述珠在300 )il缓冲 液WB中清洗5次，并在4°C保存在20 pi缓冲液WB中。
在第四展示循环中，进行在溶液中的选择。将100ng生物素化的人 TNFa在终止的核糖体展示翻译混合物中在4 °C温育1小时。在第五循环 中，实行溶液中的竞争。100ng生物素化的人TNFa与lO吗非-生物素化 的TNFa—起在终止的核糖体展示反应混合物中温育。在这两个循环中， 然后，将1(^1预制的珠溶液吸移到该混合物中，并在4 。C温育30分钟， 从而从该混合物中捕获生物素化的TNFa以及重叠结合的三元复合物。随 后的过程步骤保持不变。通过在缓冲液EB中培养所述珠，从三元复合物 中洗脱mRNA。
最后，将从第五轮选择中获得的DNA集合通过限制性位点Ndel和 Xhol亚克隆到载体pET20b(+)中。因此，在100|il包含5单位PWO DNA-聚合酶和引物 SPAF1 5'-GTTTAACTTTAAGAAGGAG ATATACATATGCAGATTTTTGTGAAAACCC-3'; 和 WubiFlagXhoIrv 5'-CCATTCCACCTCGAGACCTTTATCATCATCATCTTTGTAATCGCCGC CACGCAGACGCAGC-3'的PCR中扩增来自第五轮选择的第一核糖体展 示PCR循环的100ng线性模板DNA。通过使用该引物-对，编码泛蛋白变 体的的DNA序列在C-端融合于FLAG-表位和六组氨酸序列。PCR模式为 (30秒94°C， 60秒65 °C; 40秒72 。C) x 30个循环。利用Qiagen PCR纯化 试剂盒，按照供应商的使用说明，纯化PCR产物。将纯化的PCR产物利 用酶Ndel和Xhol进行限制性双消化。40^1消化反应包含500ng处在10pl 10mM Tris缓冲液pH 8中的PCR产物，12单位NdeI(普洛麦格(Promega)); 12单位Xho1 (普洛麦格)，4 缓冲液D (普洛麦格)，O，l mg/ml BSA。在 37。C温育该混合物12小时。如上所述，通过制备级琼脂糖凝胶纯化消化 的DNA片段。
在60^1反应中，消化载体DNA pet20b(+)。将l|ig处在30pl 10mM Tris 缓冲液PH 8中的质粒-DNA吸移到6pl缓冲液D(普洛麦格)，0，1 mg/ml BSA: 各24单位的Ndel和Xhol (普洛麦格)中。在37°C培养该混合物12小时。 如上所述，通过制备级琼脂糖凝胶纯化消化的DNA片段。利用快速连接试剂盒(Rapid Ligation Kit)(罗氏)，按照供应商的使用说明，进行连接 反应。利用Qiagen反应清理试剂盒(Qiagen Reaction Cleanup kit),按照 供应商的使用说明，纯化连接反应。将纯化的连接产物转化到大肠杆菌电 感受态细胞中(Novablue, Novagen)。
将转化体涂布在包含100 pg/ml氨苄青霉素的选择性Luria-Bertanii培 养基琼脂-板(Q-Tray)上。在37°C培养该板12小时。将单菌落分离到5个 包含250pl含有60 pg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertanii培养基的MTP中。 在37°C培养该MTP 12小时。用60|til预制的培养物接种包含60吗/ml氨 苄青霉素的i.5mi Luria-Bertanii培养基。将剩余的培养物体积保存在-20 。C。在37 。C和700rpm剧烈摇动培养2小时后，在30 。C，由0,1 mM IPTG 诱导重组蛋白质生产4小时。在Heraeus多离心机(Heraeus Multifbge)3 L-R 中，利用转子75006445 (Heraeus)，以3600 x g，在4 。C，离心深孔群 (blocks)。去除上清液，并在室温下利用300 nl NPI0缓冲液(50 mM NaH2P04， 300 mM NaCl， 1 mg/ml T4溶菌酶，10 pl/ml Bugbuster (Novagen); 4 mM MgCl2; 0,8 mM PMSF; 20单位/ 10ml Benzonase (VWR))裂解细胞沉 淀。
再在Heraeus多离心机3 L-R中，在4。C，以3600 x g离心细胞碎片 15分钟。将上清液转移到干净的MTP中。
击中-Elisa鉴定泛蛋白结合变体
Nunc Medisorb ELISA板用300 pl PBST缓冲液(PBS pH 7,4; 0,1 %吐温 20)清洗3次。将TNFa以1 pg/ml稀释在PBS缓冲液中。在板的偶数栏中 室温温育50 pl该溶液1小时。
将BSA以10pg/ml稀释到PBS缓冲液中，并且是50 PBS。在奇数 栏中室温温育50 ^该溶液1小时。用300 ]id PBST缓冲液清洗板。孔中充 入300 ^1封闭缓冲液(PBSpH7,4;3。/。BSA;0,5。/。吐温20)，并在室温下培 养4小时。用300 pl PBST缓冲液清洗板3次。将60pl各种离心的上清液 样品应用到一个偶数TNFa包被的孔中，和应用到相邻的奇数BSA-包被 的孔中，并在室温下温育1小时。用300 pi PBST缓冲液清洗板3次。将 50 |il抗-FLAG-POD缀合物M2 (西格玛(Sigma))加入到孔中(在PBSTpH 7.4中1:2000稀释)，并在室温下温育1小时。用300 jal PBST缓冲液 清洗板3次。将50 |ul TMB底物溶液(KEM-EN-Tec)吸移到孔中并温育15 分钟。由50 ^ 0,2 M H2S04终止该反应。利用TECAN日出ELISA-读数器 (TECAN Sunrise ELISA-Reader)对ELISA板读数。利用620 nm作为参 照，在450nm处进行吸光度测量(图9)。
表达的泛蛋白变体的显现
通过PAGE电泳分离10pl大肠杆菌上清液。对丙烯酰胺凝胶进行考马 斯-染色，从而分析所述变体的可溶性蛋白质部分。
选择在考马斯-染色的凝胶中作为可溶性级分出现并在击中-ELISA中 显示出靶分子结合活性的克隆，以用于DNA测序过程。
生产和纯化结合TNFa的泛蛋白变体2E11
为了详细研究选择的突变体的结合特性，纯化泛蛋白变体2E11 (图 10)。用质粒pET20b十/22E11转化NovaBlue(Novagen)大肠杆菌细胞。所 述克隆通过用LB培养基/100昭/ml氨苄青霉素1:100稀释预培养物和以 200 rpm摇动和37°C培养直到OD,达到0.5。通过加入IPTG (终浓度 1 mM)诱导表达。以30°C和200 rpm继续培养过夜。通过以4 °C， 6 000 x g 离心20分钟收获细菌细胞。将细胞沉淀混悬在30ml包括DNA酶和10 mg/ml溶菌酶的NPI-20缓冲液中。在所有缓冲液系统中，用5 mM CHAPS 纯化变体2E11。利用处于800-1000 PSIG的Gaulin压碎器破碎细胞两次。 以4°C和40000 x g离心细胞混悬液30分钟后，获得包含可溶性蛋白质的 上清液。
用5 CV的NPI-20平衡一个Ni-NTA-琼脂糖(5 ml, GE卫生保健(GE Healthcare))柱。将包含可溶性蛋白的上清液应用于该柱，随后用5 CV NPI-20洗涤。以20CV中达50 % NPI-500的线性梯度洗脱结合的蛋白。 级分分别以2ml洗脱，并通过SDS-PAGE针对其纯度进行分析。汇集包含 目标蛋白的级分，并以流速lml/分钟应用于用PBS(pH 7.4)平衡的凝胶过 滤柱(Superdex 75， 1.6 x 60, GE卫生保健(GE Healthcare))(图11)。纯化 的蛋白用于结合实验。
36ELISA确定特异性结合
突变体2E11对人TNFa的特异性结合通过浓度依赖性ELISA测定。 将增加量的纯化Affilin 2E11应用到用作为对照的BSA包被的 NUNC-medisorp板。使用50 (1 pg/ml)/孔在4°C进行抗原包被过夜。用 PBS， 0.1 %吐温20 pH 7.4 (PBST)洗涤该板后，利用封闭溶液(PBS pH 7,4; 3 WBSA;0,5。/。吐温20)在37。C封闭所述孔2小时。再用PBST洗涤孔。然 后，在所述孔中在37。C温育50 pl不同浓度的2E11 l小时。用PBST洗 涤孔后，应用以1:2000稀释在PBST中的抗-FLAG POD缀合物(西格玛 (Sigma))。如在击中-ELISA章节中所述地，进行底物反应和信号读取。 图12显示变体2E11与人TNFa以400nM的表观KD值特异性结合。
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权利要求
1.用于生成蛋白的方法，所述蛋白选自由“泛蛋白-样蛋白”蛋白超家族的蛋白、及其各具有泛蛋白-样折叠基序的片段或融合蛋白组成的组，其中所述蛋白由于对在α螺旋区中的一个或多个氨基酸的修饰而显示出关于试剂的提高的结合亲和性，所述结合亲和性在未修饰的蛋白质中不存在或不以该程度存在，所述方法具有下列步骤a)选择“泛蛋白-样蛋白”超家族的未修饰蛋白；b)提供所述未修饰蛋白对其具有低的或不具有结合亲和性的试剂；c)选择在包括α螺旋区的蛋白质表面-暴露区中的氨基酸；d)优选地通过取代、插入、缺失和/或化学修饰而修饰所选择的氨基酸，其中所述α螺旋或相邻区域中的至少4个表面-暴露的氨基酸被修饰；e)使所述修饰的蛋白与步骤b)中提供的试剂相接触；f)检测和分离关于步骤b)中提供的试剂具有新或增高的结合亲和性的蛋白，和任选地进行下述步骤g)在合适的原核、真核或体外表达系统中或通过化学合成生成所述修饰的蛋白；h)在生成后通过合适的纯化方法分离所述蛋白；和进一步任选地i)通过重复步骤d-h)进行所述修饰的蛋白的熟化。
2. 按照权利要求l的方法，其中步骤d)通过化学合成所述修饰的蛋 白而进行。
3. 按照权利要求l的方法，其中步骤d)中的修饰是通过遗传工程从 而改变属于相应的修饰蛋白的DNA进行的。
4. 按照权利要求l的方法，其中在步骤d)中构建基因文库。
5. 按照权利要求l的方法，其中在步骤d)中通过随机诱变进行所选 择的氨基酸的随机取代。
6. 按照权利要求l的方法，其中在步骤e)中，与所述试剂的所述接 触通过合适的选择方法，优选地，噬菌体展示、核糖体展示、mRNA展示、 CIS展示或细胞表面展示方法、酵母表面展示、细菌表面展示，特别优选通过噬菌体展示方法进行。
7. 按照权利要求1的方法，其中在步骤f)中，针对所述试剂具有结 合亲和性的蛋白的检测通过下列方法中的一种或多种进行ELISA、胞质 基因表面共振光谱法、荧光光谱法、FACS、等温滴定热量测定或分析式 超速离心法。
8. 按照权利要求l的方法，其中利用本身已知的方法，针对其结合亲 和性、其结合特异性和/或其他蛋白质化学特性诸如稳定性、溶解性、或产 量熟化所述蛋白质。
9. 按照以上权利要求中一项或多项的方法，其中所述蛋白以位点-特 异性或随机方式与至少一种相同或不同特异性的蛋白共价连接，由此获得 二价、多价或双特异性蛋白。
10. 按照权利要求1-9中一项或多项的方法，其中选择用于修饰的蛋 白与人泛蛋白具有至少30%的氨基酸序列同一性，且具有泛蛋白-样折叠 基序，和/或属于"泛蛋白-相关蛋白"蛋白家族。
11. 按照以上权利要求中一项或多项的方法，其中选择用于修饰的蛋 白具有泛蛋白-样折叠基序并优选选自由下列各项组成的的组SUMO-l、 FAU、 NEDD-8、 UBL-1、 Rubl、 APG8、 ISG15、 URM1、 HUB1、 GDX、 伸蛋白B、 PLIC2 (N-端结构域)，人帕金蛋白(N-端结构域)。
12. 按照以上权利要求中一项或多项的方法，其中所述蛋白是人泛蛋 白或其他哺乳动物泛蛋白。
13. 按照以上权利要求中一项或多项的方法，其中所述修饰包括5-10 个氨基酸，优选6-8个氨基酸的相邻区域，其中优选地，其2-4个氨基酸 位于所述a螺旋的表面-暴露区。
14. 按照以上权利要求中一项或多项的方法，其中所述a螺旋的氨基 酸被修饰，且任选另外地，在位于所述a螺旋外的螺旋上游位置或螺旋下 游位置中的氨基酸被修饰。
15. 按照以上权利要求中一项或多项的方法，其中哺乳动物泛蛋白ct 螺旋氨基酸22-32被修饰，且任选另外地，在位于所述a螺旋外的区域16-21(螺旋上游位置)或38-55 (螺旋下游位置)的氨基酸被修饰。
16. 按照以上权利要求中一项或多项的方法，其中所述修饰是至少部分在一级序列中直接相邻或不直接相邻的氨基酸处的取代、插入、缺失、 化学修饰或其组合，优选地是取代，其中优选地，所述在一级序列中彼此 不相邻的修饰的氨基酸在二级结构中形成针对所述试剂的优选邻接结合 区。
17. 按照以上权利要求中一项或多项的方法，其中在所述一级序列中 彼此直接相邻的氨基酸的修饰、优选取代的数目是2-8个直接相邻的氨基酸，此外，优选地，3-7或4-6或2-4个直接相邻氨基酸。
18. 按照以上权利要求中一项或多项的方法，其中所述一级序列中彼 此直接相邻的修饰的氨基酸的部分是在所述a螺旋区的起始或终止区，其 中该部分具有2个或更多个氨基酸，优选2或3个氨基酸的长度。
19. 按照以上权利要求中一项或多项的方法，其中在所述蛋白中，所 述一级序列中彼此直接相邻的5个或更多个氨基酸被修饰，优选被取代， 其中1、 2个或更多个，优选2或3个直接相邻的氨基酸形成a螺旋链区 的起始或终止。
20. 按照以上权利要求中一项或多项的方法，其中，任选地，不属于 这样的区域的那些位置的氨基酸被修饰，所述区域在按照权利要求1的未 修饰蛋白中参与与泛蛋白天然结合配偶体的结合。
21. 按照以上权利要求中一项或多项的方法，其中在所述蛋白质，优 选泛蛋白的01螺旋区中存在的至少25%的氨基酸被修饰。
22. 按照以上权利要求中一项或多项的方法，其中所述未修饰的蛋白 是人泛蛋白或其同源蛋白，且其中泛蛋白的至少8个表面-暴露的氨基酸被 修饰，优选被取代，以使这些修饰的氨基酸包括具有针对所述试剂的结合 亲和性的区域。
23. 按照以上权利要求中一项或多项的方法，其中所述修饰的蛋白是 在位置16, 18, 20, 21， 22, 24， 25, 28, 29, 31, 32, 33, 38, 39, 52, 53， 54,和/或 55中的至少4处或更多处被取代、缺失、插入和/或化学修饰，优选被取 代的人泛蛋白。
24. 按照以上权利要求中一项或多项的方法，其中所述试剂是抗原或 半抗原。
25. 按照以上权利要求中一项或多项的方法，其中所述修饰的蛋白与所述试剂的结合亲和性，以KD表示，为10—5M-10—12M,此外优选地10'6 一 10-12M或10-9- 10-12M。
26. 按照以上权利要求中一项或多项的方法，其中所述蛋白以位点-特 异性或随机样方式与至少一种相同或不同特异性的蛋白共价连接，并由此 分别显示出二价或多价或双特异性结合特性。
27. 通过以上权利要求中一项或多项的方法获得的蛋白质。
28. 编码权利要求27的蛋白质的核酸。
29. 按照权利要求27的蛋白质用于特异性识别、结合和中和前述靶分 子以用于检测、用于定量测定、用于通过本身已知的方法诸如层析法或吸 附技术分开和/或分离相应结合配偶体的用途。
30. 按照权利要求27的蛋白质用于诊断、预防和治疗其中直接或间接涉及所述相应的结合配偶体的疾病的用途。
31. 按照权利要求27的蛋白质用于熟化方法以通过遗传工程、化学修 饰或其组合提高所述亲和性、稳定性、溶解性或特异性的用途。
32. 权利要求31的用途，通过所述用途，所述亲和性、稳定性、溶解 性或特异性通过随机诱变(例如倾向差错PCR)，通过位点定向的重新随 机化预先选择的结合盒中的位置，通过靶向的单氨基酸取代或通过化学修 饰得到提高。
全文摘要
本发明涉及用于生成源自泛蛋白样蛋白的蛋白超家族、在其α螺旋区具有修饰的结合蛋白的方法，以及通过所述方法可以获得的蛋白。此外，本发明提供蛋白用于特异性识别、结合和中和前述靶分子，用于检测、定量测定、分开和/或用于分离相应的结合配偶体的用途，和本发明蛋白用于诊断、预防和治疗所述相应的结合配偶体直接或间接参与其中的疾病的用途。
文档编号C07K14/47GK101563456SQ200780047132
公开日2009年10月21日 申请日期2007年11月15日 优先权日2006年11月15日
发明者埃里克·菲德勒, 迈克尔·施雷尔姆 申请人:希尔蛋白质有限公司