专利名称：一种制备螺旋藻双向电泳分析蛋白的方法
技术领域：
本发明属于螺旋藻开发应用的技术，特别涉及一种制备螺旋藻双向电泳分析蛋白的方法。
背景技术：
螺旋藻(Spirulina)，是一种光合放氧、呈规则螺旋形的原核丝状微藻，系蓝藻门(Cyanophyta)、颤藻目(Oscillatoriales)、颤藻科(Oscillatoriaceae)的一个属[武汉植物学研究，1997，15 (4) :369-374]，因其富含优质蛋白和多种生物活性物质而受到国内外的极大关注，目前已在大量研究的基础上形成了庞大的螺旋藻产业，并应用于食品、生物医药保健、饲料、精细化工等领域。该属中的钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)是国内外在商业化养殖生产与开发中应用最广泛的品种[Journal of Phycology, 2005,41 (3)622-628]。以双向电泳(2-DE)为核心技术之一的蛋白质组学技术，是当前开展螺旋藻良种选育及种质退化和高光效机制等研究的重要前沿技术，而制得高质量的2-DE分析蛋白是有效应用该技术的前提[Trends in Biotechnology，1999，17 (3) : 121-127]。在高等植物或固氮菌等细菌等生物中一般均先用压榨或超声波等破碎细胞，进而经超速离心或蔗糖密度梯度离心将蛋白分离成水溶性或水不溶性等组分，再用试剂盒纯化制得2-DE分析蛋白[Ferns Microbiology Letters, 2008, 288 (I) :92-101]。值得注意的是，螺旋藻在分类学虽属蓝细菌，且具光合作用等与植物类似的功能，但因其蛋白质的含量高、种类多且丰度极不均匀，参照上述其它生物制备2-DE分析蛋白的方法难以制得高质量的螺旋藻2-DE分析蛋白[高等学校化学学报，2009，30 (6) :1152-1157]。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种简便、高效、低成本的制备螺旋藻双向电泳分析蛋白的方法——冻融破壁分步提纯法。为解决技术问题，本发明的解决方案是提供一种制备螺旋藻双向电泳分析蛋白的方法，是将螺旋藻细胞在_20°C冷冻
I.5h后再在4°C融化lh，如此反复冻融5次完全破碎；用Tris-HCl提取液提取3次得到水溶性蛋白，用SDS(十二烷基磺酸钠)提取液从沉淀中提得水不溶性蛋白；所述Tris-HCl 提取液的组成125mM Tris-HCI,0. 9% NaCl，pH 6. 8 ;所述 SDS 提取液的组成64mM Tris-HCl提取液、10%甘油、2% SDS,5% P -巯基乙醇，pH 6.8 ;各百分比为质量百分比关系。该方法具体包括下述步骤取0. 75g钝顶螺旋藻藻泥于5ml离心管中，并加入Tris-HCl提取液3ml，在_20°C冷冻I. 5h后再在4°C融化lh，如此反复冻融5次至出现深蓝紫色荧光，并在显微镜下镜检无完整细胞；4°C下12000r/min离心20min得上清液1_1 ;沉淀加入3ml Tris-HCl提取液轻轻摇匀后置于4°C 15min，4°C下12000r/min离心20min得上清液1_2 ;如此再抽提I次得上清液1-3 ;合并上清液I-I 3即为螺旋藻水溶性蛋白；在上清液1-3的沉淀中加入3mlSDS提取液并轻轻摇勻，4°C放置6h,每30min摇勻一次，4°C下12000r/min离心20min得上清液II，即为螺旋藻水不溶性蛋白；在上述所提的水溶性蛋白和水不溶性蛋白中分别加入3倍体积预冷的含10% TCA (三氯乙酸)和0.07% DTT (二硫苏糖醇)的丙酮溶液，混匀后-20°C静置4h，4°C下12000r/min离心20min，弃上清液；沉淀中加入3ml含0. 07% DTT的预冷丙酮溶液，洗涤后-20°C静置2h，4°C下12000r/min离心20min，弃上清液，如此反复抽提3次至上清液完全无色；沉淀经真空冷冻干燥，即制得用于螺旋藻双向电泳分析的水溶性蛋白和水不溶性蛋白。本发明的显著优点本发明所建的螺旋藻2-DE分析蛋白制备方法一冻融破壁分步提纯法，与现有螺旋藻2-DE分析蛋白制备方法相比，具有操作简便、仪器设备简单、成本低廉和信息量更丰富等显著优点，它可显著提升螺旋藻蛋白质2-DE图谱的信息量和分辨率，从而为后续蛋白质组学等生物信息学研究奠定了必要基础。
图I为钝顶螺旋藻ZJU0101的水溶性蛋白双向电泳图谱。图2为钝顶螺旋藻ZJU0101的水不溶性蛋白双向电泳图谱。图3为钝顶螺旋藻ZJU0104的水溶性蛋白双向电泳图谱。图4为顶螺旋藻ZJU0104的水不溶性蛋白双向电泳图谱。
具体实施例方式本发明针对螺旋藻的细胞壁主要由多糖和黏多肽组成、仅含极少量纤维素、只要冻融数次即可使其破裂等显著不同于高等植物等其它生物的特点，通过研究建立了基于冻融破壁和蛋白质分步提纯的螺旋藻2-DE分析蛋白的制备方法，即冻融破壁分步提纯法。我们以钝顶螺旋藻品系ZJU0101为材料，反复冻融5次使藻细胞完全破碎后，先用Tris-HCl提取液提取3次得到水溶性蛋白，再用SDS提取液从沉淀中提得水不溶性蛋白。将上述水溶性和水不溶性蛋白分别用TCA/丙酮法纯化后作双向电泳(2-DE)分析，电泳图上可辨蛋白点分别达512和765个，而两者间匹配率仅为7%，说明利用此法能制得适于2-DE分析的高质量的螺旋藻水溶性蛋白和水不溶性蛋白。本发明用于示例的详细技术方案可以通过以下步骤实施I、选用材料为公知的钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)品系ZJU0101,浙江大学原子核农业科学研究所生物资源与分子工程实验室也有保存。2、试剂和仪器等电聚焦胶条(24cm，pH4_7)、矿物油、IPG buffer (pH4-7)和蛋白质分子量标准等购自GE Healthcare Biosciences (美国)；二硫苏糖醇(DTT)和碘乙酰胺等购自Bio-Rad(美国)；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、尿素、硫脲、丙磺酸(CHAPS)、低熔点琼脂糖、Tris、甘氨酸、十二烷基磺酸钠(SDS)、过硫酸铵(APS)和四甲基乙二胺(TEMED)等购自Amresco (美国)。所用的等电聚焦仪、垂直电泳系统和紫外-可见扫描分光光度计等为Amersham Pharmcia Biotech (美国)产品；冷冻干燥仪为VirTis (美国)产品；扫描仪GS-800和TOQuest软件等为Bio-Rad(美国)产品。3、水溶性蛋白和水不溶性蛋白的制备取0. 75g钝顶螺旋藻藻泥于5ml离心管中，并加入Tris-HCl提取液(125mMTris-HCI, 0. 9% NaCl，pH 6. 8) 3ml，在 _20°C冷冻 I. 5h 后再在 4°C融化 lh，如此反复冻融 5次至出现深蓝紫色荧光，并在显微镜下镜检无完整细胞。4°C下12000r/min离心20min得上清液I-I ;沉淀加入3ml Tris-HCl提取液轻轻摇匀后置于4°C 15min，4°C下12000r/min离心20min得上清液1-2 ;如此再抽提I次得上清液1_3 ;合并上清液1_1 3即为螺旋藻水溶性蛋白。在上清液1-3的沉淀中加入3ml SDS提取液(64mM Tris_HCl、10%甘油、2%SDS,5% ￠-巯基乙醇，pH 6.8)并轻轻摇匀，4°C放置6h，每30min摇匀一次，4°C下12000r/min离心20min得上清液II，即为螺旋藻水不溶性蛋白。在上述所提的水溶性蛋白和水不溶性蛋白中分别加入3倍体积预冷的含10% TCA和0. 07% DTT的丙酮溶液，混匀后_20°C静置4h，4°C下12000r/min离心20min，弃上清液。沉淀中加入3ml含0. 07% DTT的预冷丙酮溶液，洗涤后_20°C静置2h，4°C下12000r/min离心20min，弃上清液，如此反复抽提3次至上清液完全无色，沉淀经真空冷冻干燥，即制得用于螺旋藻2-DE分析的水溶性蛋白和水不溶性蛋白。4、2_DE和软件分析将经真空冷冻干燥的蛋白样品用适量裂解液(7M尿素、2M硫脲、4% CHAPS,2% IPGbuffer,40mM DTTUmM PMSF)充分溶解，4°C下12000r/min离心20min得上清液，参照考马 斯亮蓝 G-250 法定量[Analytical Biochemistry, 1976,72 :248-254]后进行 2-DE 分析。采用24cm pH4-7 IPG胶条，上样的总体积450 yl、总蛋白量800 y g。等电聚焦程序为50V主动水化12h，500V线性除盐lh，1000V线性除盐3h，8000V线性升压4h，8000V快速聚焦110000V-hr，500V保持。聚焦后的胶条经两次平衡后转至浓度为12. 5%的胶上作第二向电泳，先以2W/gel电泳45min后，再以17W/gel电泳使溴酚蓝至胶底部。用考马斯亮蓝G-250染色，脱色并扫描后，图像用TOQuest软件分析。5、结果与分析图1、2为钝顶螺旋藻ZJU0101水溶性蛋白和水不溶性蛋白的2-DE图谱。由图I、2可知，ZJUO101水溶性蛋白和水不溶性蛋白图谱的可辨蛋白点分别达512和765个，且两者明显不同，匹配率仅为I0A。说明利用本法能制得适于2-DE分析的较高质量的钝顶螺旋藻水溶性蛋白和水不溶性蛋白。蛋白质样品制备是获得高分辨率和高信息量2-DE凝胶图谱，取得高水平蛋白质组学研究成果的必要前提与关键步骤[Electrophoresis, 2007, 28 (6) :1022-1024]。Hongsthong 等[Molecular Biotechnology, 2007, 36 (2) 123-130]用压榨法破碎纯顶螺旋藻细胞，并用密度梯度离心制得水溶性和水不溶性等蛋白组分，再经试剂盒纯化后作2-DE分析，所得水溶性和水不溶性蛋白图谱的相似性较高，可辨蛋白点各约400个，匹配率约50%;林重阳等[高等学校化学学报，2009，3(K6) :1152-1157]用超声波破碎钝顶螺旋藻细胞，并用Triton提取液抽提全蛋白，经TCA/丙酮法纯化后作2-DE分析，因受藻胆蛋白等高丰度蛋白影响较大，上样量等受限，可辨蛋白点仅约200个。本发明用反复冻融法破碎钝顶螺旋藻细胞后，先用Tris-HCl提取液提得水溶性蛋白，再用SDS提取液从沉淀中提得水不溶性蛋白，两者再用TCA/丙酮法纯化后，2-DE图谱的可辨蛋白点分别达510多和760多个，且匹配率仅7%。这表明，(I)反复冻融不仅能有效破碎螺旋藻的细胞壁，而且所需的仪器设备与操作均比压榨法和超声波法简便，且作用力较温和而对蛋白质的损伤更小；(2)Tris-HCl和SDS提取液分步提取，不仅能将破壁螺旋藻中的水溶性蛋白和水不溶性蛋白较彻底地分离，而且不存在如密度梯度离心分离过程中难免丢弃某些蛋白组分等问题，从而既可有效减小高丰度的藻胆蛋白等对周边低丰蛋白的掩盖，又能使蛋白组分尽可能不丢失[海洋与湖沼，2010，41(3) =348-351] ; (3) TCA/丙酮法不仅能有效去除螺旋藻蛋白提取液中的色素和糖类等对2-DE有影响的 杂质，而且可对蛋白样品进行浓缩，以便于后续研究，因而在效果、操作和成本上均优于试剂盒纯化法[Proteomics，2005，5(10) :2497-250] ； (4)用SDS提取液提取螺旋藻蛋白，不仅提取效率显著比Triton提取液的高，而且对蛋白质样品2-DE等电聚焦基本无影响。由此可见，本发明所建的制备螺旋藻2-DE分析蛋白的方法一冻融破壁分步提纯法，与已有方法相比，具有操作简便、仪器设备简单、成本低廉、图谱分辨率高和信息量更丰富等优点。作为另一个实例，我们选取了钝顶螺旋藻品系ZJU0104来验证本发明的实用性。利用上述方法获得了 ZJU0104的水溶性蛋白和水不溶性蛋白的2-DE图谱(图3、4)，两者的可辨蛋白点分别达546和811个，且匹配率仅为11%，进一步说明本发明建立的“冻融破壁分步提纯法”是一种制备螺旋藻2-DE分析蛋白有效而简便的方法。
权利要求
1.一种制备螺旋藻双向电泳分析蛋白的方法，其特征在于，是将螺旋藻细胞在-20°C冷冻I. 5h后再在4°C融化lh，如此反复冻融5次完全破碎；用Tris-HCl提取液提取3次得到水溶性蛋白，用SDS提取液从沉淀中提得水不溶性蛋白； 所述 Tris-HCl 提取液的组成125mM Tris-HCI,0. 9% NaCl，pH 6. 8 ;所述 SDS 提取液的组成64mM Tris-HCl提取液、10%甘油、2% SDS、5% P -巯基乙醇，pH 6. 8;各百分比为质量百分比关系。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，具体包括下述步骤 取0. 75g钝顶螺旋藻藻泥于5ml离心管中，并加入Tris-HCl提取液3ml，在_20°C冷冻.I. 5h后再在4°C融化lh，如此反复冻融5次至出现深蓝紫色荧光，并在显微镜下镜检无完整细胞； .4°C下12000r/min离心20min得上清液1-1 ;沉淀加入3ml Tris-HCl提取液轻轻摇勻后置于4°C 15min，4°C下12000r/min离心20min得上清液1_2 ;如此再抽提I次得上清液 .1-3 ;合并上清液I-I 3即为螺旋藻水溶性蛋白； 在上清液1-3的沉淀中加入3ml SDS提取液并轻轻摇匀，4°C放置6h，每30min摇匀一次，4°C下12000r/min离心20min得上清液II,即为螺旋藻水不溶性蛋白； 在上述所提的水溶性蛋白和水不溶性蛋白中分别加入3倍体积预冷的含10% TCA和.0.07% DTT的丙酮溶液，混匀后_20°C静置4h，4°C下12000r/min离心20min，弃上清液；沉淀中加入3ml含0. 07% DTT的预冷丙酮溶液，洗涤后_20°C静置2h，4°C下12000r/min离心.20min，弃上清液，如此反复抽提3次至上清液完全无色；沉淀经真空冷冻干燥，即制得用于螺旋藻双向电泳分析的水溶性蛋白和水不溶性蛋白。
全文摘要
本发明涉及螺旋藻开发应用技术，旨在提供一种制备螺旋藻双向电泳分析蛋白的方法。该方法是将螺旋藻细胞在-20℃冷冻1.5h后再在4℃融化1h，如此反复冻融5次完全破碎；用Tris-HCl提取液提取3次得到水溶性蛋白，用SDS提取液从沉淀中提得水不溶性蛋白。本发明所建的螺旋藻2-DE分析蛋白制备方法——冻融破壁分步提纯法，与现有螺旋藻2-DE分析蛋白制备方法相比，具有操作简便、仪器设备简单、成本低廉和信息量更丰富等显著优点，可显著提升螺旋藻蛋白质2-DE图谱的信息量和分辨率，从而为后续蛋白质组学等生物信息学研究奠定了必要基础。
文档编号G01N1/28GK102645357SQ201210084120
公开日2012年8月22日 申请日期2012年3月27日 优先权日2012年3月27日
发明者于金鑫, 刘新颖, 汪志平, 王景梅, 蓝瑾瑾, 邵斌, 陈子元 申请人:浙江大学