专利名称：一种螺旋藻藻蓝蛋白及其提取方法
技术领域：
本发明涉及天然产物深加工技术领域，具体涉及一种螺旋藻藻蓝蛋白及其提取方法。
背景技术：
螺旋藻中包含多种生物活性物质，其中藻胆蛋白在螺旋藻干粉中含量丰富(占15-25，w/w%)，并具有重要的医药、保健、生物工程等方面应用价值。对于我国螺旋藻产业中普遍养殖的钝顶螺旋藻品系而言，其藻胆蛋白成分主要包含藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白，二者在藻胆蛋白中的含量比例约为3 :1，其中藻蓝蛋白由于含量上的绝对优势(约占螺旋藻干粉的10-20，w/w%)致使其研究应用更为普遍。藻蓝蛋白不但在保健食品及医药领域具有抗辐射、抗癌、免疫调节、促进造血和延缓衰老等功能，据其纯度的不同更广泛地被应用于荧光探针和天然色素等生物工程、食品科学和精细化工等领域。然而由于螺旋藻藻胆蛋白中 的藻蓝蛋白分子和别藻蓝蛋白分子的亚基之间氨基酸序列同源性很高，造成藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白难以分离的技术瓶颈。目前螺旋藻藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的分离纯化通常采用羟基磷灰石介质进行层析分离，但存在吸附性弱、洗脱时间长、上样量少等问题，并且还需结合其它多步层析操作如体积排阻层析和离子交换层析等进一步提高藻蓝蛋白纯度。也有报道可通过反复盐析操作或双水相萃取技术，提高藻胆蛋白的纯度，无需多步层析操作，但多步提取操作同样存在产品收率低，操作周期长等问题，尤其对具有荧光特性的藻蓝蛋白，其荧光特性易在长时间的提取操作过程中损失。
发明内容
本发明的目的是提供一种螺旋藻藻蓝蛋白的提取方法，该方法通过硫酸铵分级盐析、PEG20000-NaCl聚合物沉淀制得的藻蓝蛋白粗提物可长时间贮存藻蓝蛋白并保持其生物及荧光活性，进一步结合双水相萃取分离可获得高纯度的、具有抗氧化活性和荧光特性的藻蓝蛋白成品。本发明的螺旋藻藻蓝蛋白的提取方法包括如下步骤( I)制备螺旋藻粉悬浊液取螺旋藻粉溶解于磷酸盐缓冲液中，制得螺旋藻粉悬浊液；(2)制备螺旋藻细胞破碎液将螺旋藻粉悬浊液采用反复冻融法结合机械破碎法处理，离心取上清，得到螺旋藻细胞破碎液；(3)制备藻蓝蛋白粗提液1:采用30%和50%硫酸铵溶液分级盐析沉淀螺旋藻细胞破碎液，透析除盐，得到藻蓝蛋白粗提液I ;(4)制备藻蓝蛋白粗提物将PEG20000和NaCl溶解至藻蓝蛋白粗提液1，配制成PEG20000-NaCl沉淀体系，静置、离心取沉淀，得到藻蓝蛋白粗提物。本发明的螺旋藻藻蓝蛋白的提取方法还包括如下步骤
(5)制备藻蓝蛋白粗提液2 :用磷酸盐缓冲液溶解藻蓝蛋白粗提物，制得藻蓝蛋白粗提液2 ；(6)制备藻蓝蛋白精提液采用PEG20000/Na2S04双水相体系双水相萃取藻蓝蛋白粗提液2，分配平衡、离心分相，取下相，透析除盐，制得藻蓝蛋白精提液；(7)冷冻干燥制备藻蓝蛋白成品。其中，步骤(I)中螺旋藻粉与磷酸盐缓冲液的比例为ImL磷酸盐缓冲液对应0. 04-0. 05g螺旋藻粉。所述磷酸盐缓冲液为0. 01mol/L, pH=7的磷酸盐缓冲液。其中，步骤(2)为将螺旋藻粉悬浊液采用反复冻融法结合机械破碎法反复操作三次，离心取上清，制得螺旋藻细胞破碎液；
反复冻融法结合机械破碎法反复操作三次的步骤为将螺旋藻粉悬浊液置于4-1 (TC下静置4-8h后至-15—25 °C冰冻，将冰块绞碎，再次4-1 (TC至-15—25 °C反复冻融与机械破碎直至反复操作三次；离心的转速为6000-9000rpm，时间为20_30min。其中，步骤(3)中硫酸铵溶液分级盐析沉淀的方法为先将硫酸铵溶解至螺旋藻细胞破碎液至30%饱和度，4-10°C静置12-15h，9000-12000rpm下离心20_30min取上清，再向上清中溶解硫酸铵至50%饱和度，4-10°C静置12-15h，9000-12000rpm下离心20_30min取沉淀；透析除盐的步骤为将沉淀溶解于磷酸盐缓冲液中进行透析30_40h，换5-7次透析液。其中，步骤(4)中所述PEG20000_NaCl沉淀体系的组分为20%(w/v)PEG20000和0. 8mol/LNaCl ;静置为 4_10°C静置 12_15h，离心为 9000_12000rpm 下离心 20_30min。其中，步骤(5)为用0. 01mol/L, pH=7. 0的磷酸盐缓冲液溶解藻蓝蛋白粗提物；其中，步骤(6 )中所述PEG20000/Na2S04双水相体系的组分包含10. 5% (w/w)PEG20000，5. 9%(w/w) Na2SO4 和 0. 2mol/LNaCl ;分配平衡 l_2h 后 5000-7000rpm 下离心20-30min 分相；透析除盐的步骤为将下相溶液置于透析袋中进行透析30_40h，换5-7次透析液。其中，步骤(7)为冷冻干燥制得蓝色粉末状的藻蓝蛋白成品。所述的螺旋藻优选为钝顶螺旋藻。本发明的另一目的是提供由上述方法制备的藻蓝蛋白粗提物。本发明的提取方法制得的藻蓝蛋白粗提物可于4°C下保存30日不变性，可用于藻蓝蛋白的贮存，使具有抗氧化活性及荧光特性的藻蓝蛋白长时间贮存。本发明的另一目的是提供由上述方法制备的藻蓝蛋白成品。本发明制得的藻蓝蛋白粗提液2在紫外可见光谱下检测的纯度为A620/280=3. 5-3. 94。本发明制得的藻蓝蛋白精提液在紫外可见光谱下检测的纯度为A620/280=5. 6-6. 2。本发明制得的藻蓝蛋白成品，藻蓝蛋白与螺旋藻藻粉的比得率为14. 59-16. 32mg/g°本发明所得藻蓝蛋白提取物溶液相关抗氧化活性测定指标有三点DPPH清除率、羟自由基清除率、超氧阴离子清除率；所用方法分别为DPPH体系、Feton体系、邻苯三酚自氧化体系。本发明所得藻蓝蛋白提取物溶液相关荧光活性测定有两点荧光分光光度计检测和荧光显微镜照片。本发明制得的藻蓝蛋白能够很好的保持藻蓝蛋白的抗氧化活性，对DPPH自由基、羟自由基(-0H)的清除率随藻蓝蛋白纯度的增加而显著增大，制得的藻蓝蛋白成品的羟自由基半清除率IC5tl=O. 19lmg/mL，DPPH半清除率IC5tl=O. 296mg/mL ;荧光显微镜下其荧光强度与计量成比例关系，荧光分光光度计检测650nm有最大荧光发射峰。本发明的螺旋藻藻蓝蛋白及其贮存和提取方法具有的优点(I)本发明依次采用硫酸铵分级盐析、PEG20000-NaCl聚合物沉淀、双水相萃取和透析除盐，避免了传统层析技术的成本高、收率低(〈1%藻蓝蛋白/藻粉)等弊端，提取工艺简单、成本低，适于间歇性和规模化生产加工高纯度、高收率的螺旋藻藻蓝蛋白成品。 (2)本发明制得的藻蓝蛋白粗提物可于4°C下保存30日不变性，可用于藻蓝蛋白的贮存，使具有抗氧化活性及荧光特性的藻蓝蛋白长时间贮存。(3)本发明制得的藻蓝蛋白成品纯度高、具有良好的抗氧化自由基清除效果和荧光强度，将本发明不同步骤所得的藻蓝蛋白样品实施相关抗氧化活性和荧光活性测定，均未随提取步骤的增加而明显损失。
图1是本发明的螺旋藻藻蓝蛋白提取工艺流程图；图2是本发明实施例不同提取步骤中藻蓝蛋白的收率、纯度和外观图；其中，图Ca)为不同提取步骤中藻蓝蛋白的收率；图(13)为不同提取步骤中藻蓝蛋白的纯度；图((3)为不同提取步骤中藻蓝蛋白的外观图，从左到右依次是细胞破碎液、藻蓝蛋白粗提液1、藻监蛋白粗提液2、操监蛋白精提液；图3是本发明实施例藻蓝蛋白精提液的紫外可见扫描光谱及样品外观图；其中，图(a)为藻蓝蛋白精提液的紫外可见扫描光谱；图(13)为藻蓝蛋白精提液的样品外观图；图4是本发明实施例不同提取步骤中藻蓝蛋白溶液的抗氧化活性效果图；其中，图(a)为不同提取步骤中藻蓝蛋白对DPPH自由基的清除率；图(b)为不同提取步骤中藻蓝蛋白对羟自由基的清除率；图((3)为不同提取步骤中藻蓝蛋白对超氧阴离子的清除率；图5是本发明实施例中藻蓝蛋白成品的荧光显微照片及荧光光谱图，其中，图(a)为藻蓝蛋白成品的荧光显微照片；图(13)为藻蓝蛋白成品的荧光光谱图。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1制备藻蓝蛋白提取物(I)制备螺旋藻粉悬浊液称取5g钝顶螺旋藻藻粉溶解于IOOmL磷酸盐缓冲液中(0. 01mol/L, pH=7),制得螺旋藻粉悬池液；(2)制备螺旋藻细胞破碎液将螺旋藻粉悬浊液置于4°C下静置4h后至-20°C冰冻，将冰块绞碎，再次4°C至-20°C反复冻融与机械破碎直至反复操作三次，9000rpm离心30min，制得螺旋藻细胞破碎液；(3)制备藻蓝蛋白粗提液1:先将17. 6g硫酸铵加入至螺旋藻细胞破碎液，充分搅拌，溶解至30%饱和度，4 °C静置12小时，9000rpm下离心30min取上清，再向上清中加入12. 7g硫酸铵，充分搅拌，溶解至50%饱和度，4°C静置12小时，9000rpm下离心30min弃上清，取沉淀，将得到的沉淀用20mL 0. Olmol/L、pH=7. 0的磷酸盐缓冲液溶解后于IL容器中透析36h (换6次透析液)，得到溶液定容至IOOmL,制得藻蓝蛋白粗提液I ;(4)制备藻蓝蛋白粗提物将20gPEG20000和4. 64gNaCl加入到藻蓝蛋白粗提液1，充分搅拌至溶解，配制成PEG20000-NaCl沉淀体系，4°C静置12小时，9000rpm下离心30min弃上清,取沉淀,得到藻蓝蛋白粗提物；
(5)制备藻蓝蛋白粗提液2 :用0. 01mol/L、pH=7. 0的磷酸盐缓冲液溶解藻蓝蛋白粗提物，定溶至IOOmL,制得藻蓝蛋白粗提液2 ；(6)制备藻蓝蛋白精提液采用PEG20000/Na2S04双水相体系双水相萃取藻蓝蛋白粗提液2，双水相萃取条件为IOOg双水相体系(包含0. 2mol/LNaCl)，其中各组分质量分数分别为10. 5%PEG20000、5. 9%Na2S04,分配平衡Ih后在20°C下、6000rpm离心30min分相，取下相，置于透析袋中进行透析除盐，透析时间36h，换6次透析液，制得藻蓝蛋白精提液；(7)冷冻干燥制备蓝色粉末状藻蓝蛋白成品。螺旋藻藻蓝蛋白提取工艺流程图如图1所示。通过测定不同提取步骤中溶液的紫外可见吸光光度值A620、A652和A280，可得到藻蓝蛋白浓度及纯度，计算公式如下所示藻蓝蛋白浓度(mg/mL)=0.187XA620-0. 089XA652 ；藻蓝蛋白纯度=A620/A280。同时对不同提取步骤中藻蓝蛋白的收率进行统计分析，并观察不同提取步骤中藻蓝蛋白的外观。上述不同提取步骤中藻蓝蛋白的收率、纯度和外观图如图2所示，其中，图(a)为不同提取步骤中藻蓝蛋白的收率；图(b)为不同提取步骤中藻蓝蛋白的纯度；图(c)为不同提取步骤中藻蓝蛋白的外观图，从左到右依次是细胞破碎液、藻蓝蛋白粗提液1、藻蓝蛋白粗提液2、操监蛋白精提液。对藻蓝蛋白精提液进行紫外可见扫描光谱分析，并观察其外观，藻蓝蛋白精提液的紫外可见扫描光谱及样品外观图如图3所示，其中，图(a)为藻蓝蛋白精提液的紫外可见扫描光谱；图6)为藻蓝蛋白精提液的样品外观图。上述实施例的步骤中各条件可以根据说明书的内容进行适应性的变动，得到如下数据其中，藻蓝蛋白粗提液2在紫外可见光谱下检测的纯度为A620/280=3. 5-3. 94。藻蓝蛋白精提液中藻蓝蛋白的纯度为A620/280=5. 6-6. 2 ;冷冻干燥后制得的藻蓝蛋白成品，藻蓝蛋白与螺旋藻藻粉的比得率为14. 59-16. 32mg/g，均优于传统层析技术分离得到的藻蓝蛋白纯度为4. 0-5. O、比得率低于10mg/g的分离结果。实施例2抗氧化活性测定指标评定本实施例中样品溶液为不同提取步骤中的藻蓝蛋白提取液。DPPH体系分别取2mL样品溶液，加入2mL的I X 10_4mOl/LDPPH溶液，混匀后在室温下避光反应2min,并在4000rpm下离心IOmin,取上清液待测。以等体积的去离子水代替样品溶液作对照组，以等体积的95%乙醇代替DPPH溶液作空白组。在517nm下测定吸光度A，并以等体积样品提取溶剂(磷酸盐缓冲液或PEG20000/Na2S04双水相体系下相溶剂)和95%乙醇混合液为空白调零，做六组平行实验，取其平均值。清除率(%) = [1 — (A样品组一A空白组)/A对照组]X 100%Feton体系按顺序分别取pH值为7. 4，0. 15mol/L的磷酸盐缓冲液1. OmL,520 V- g/mL 的番红溶液 0. 2mL, 6mmol/L 的 EDTANa2-Fe2+L OmL,样品溶液 7. OmL,最后加入0. 3%的H2O2O. 8mL启动反应，混匀后于40°C水浴保温30min，在波长520nm处测吸光度A。空白组以等体积的去离子水代替样品溶液；对照组以等体积的去离子水代替样品溶液和H2O2溶液。以甲醇作为空白调零，做六组平行实验，取其平均值。清除率(%) = (A样品一A空白)/(A对照一A空白)X 100%
邻苯三酚自氧化体系取50mol/L, pH8. 2的Tris-HCl缓冲液4. 5mL(其中含有2mmol/L EDTANa2)，加入0.1mL样品溶液，于25°C保温lOmin，然后加入25°C预温的5mmol/L的邻苯三酚0. 3mL，空白组以等量去离子水代替样品溶液混匀后迅速加入干燥的比色皿中，在320nm每隔半分钟测定一次吸光度值A，以等体积的lOmmolHCI代替邻苯三酚空白调零。样品与邻苯三酚混合液在320nm处吸光度随时间变化曲线的回归方程的斜率作为邻苯三酚的自氧化速率V ( A A/min)。清除率(%) = (V空白一V样品)/V空白X 100%如图4所示，由不同步骤提取得到的藻蓝蛋白能够较好的保持其抗氧化活性，其中，如图(a)所示，不同提取步骤中藻蓝蛋白样品(0. 13mg/mL蛋白浓度)对DPPH自由基的清除率增大，由53. 02%上升至60. 47% ;如图(b)所示，不同提取步骤中藻蓝蛋白样品(0. 13mg/mL蛋白浓度)对羟自由基(-0H)的清除率增大，由53. 13%上升至76. 67% ;如图(c)所示，不同提取步骤中藻蓝蛋白样品(0. 13mg/mL蛋白浓度)对超氧阴离子(02_)的清除率减小，由67. 11%下降至Ij 54. 84%。其中，藻蓝蛋白成品的羟自由基半清除率IC5tl=O. 19lmg/mL，DPPH半清除率IC50=O. 296mg/mL ;半清除率定义为以样品浓度与清除率作图，根据拟合方程求出50%清除率所需要的样品浓度。实施例3荧光活性测定指标评定突光显微镜观察法DEAE_SephadexA50预处理称取5g DEAE-Sephadex A50悬浮于500mL蒸馏水中，浸泡Ih后倾去上层细粒，按I (g) : 15 (mL)的比例加入0. 5M NaOH浸泡30min,抽虑,用蒸懼水洗至pH=7,再以0.1M HCl重复上述过程。取5mL 0. lmg/mL分离纯化后的藻蓝蛋白成品溶液(0. Olmol/L pH=7. 0磷酸盐缓冲液为溶剂)，加入IOOmg预处理后抽虑的DEAE-S^hadex A50吸附介质，于4°C条件下分别静态吸附4h和12h，分别用分光光度计测量溶液中紫外可见吸光光度值A620和A652值，可计算出IgDEAE-S^hadexA50吸附介质吸附藻蓝蛋白分别为7. 9Img和15. 76mg。蒸懼水洗漆吸附藻蓝蛋白的DEAE-SephadeXA50，至洗涤液无色后将吸附介质于荧光显微镜下观察，显示出显著的荧光强度。藻蓝蛋白成品的荧光活性通过静态吸附，吸附到DEAE-S印hadexA50上，置于荧光显微镜下发现样品有红色荧光(如图5 (a)所示)，选定一个吸附有藻蓝蛋白的DEAE-SephadexA50颗粒,用Quantity-one软件分析得到的灰度值,该值可反应藻蓝蛋白样品的突光强度。藻蓝蛋白吸附量分别为7. 91mg/g吸附介质和15. 76mg/g吸附介质的两种吸附介质所得到的灰度值分别为42. 311和83. 027，表明藻蓝蛋白所显示的荧光强度随蛋白量的增加而增强，并成计量关系。荧光光谱扫描法将纯化后的藻蓝蛋白成品溶液置于石英比色皿中，调节激发光波长为590nm，用荧光光谱仪扫描，显示藻蓝蛋白样品在650nm处出现最大荧光发射峰(如图5 (b)所示)。虽然，上文中已经用一般性说明具体实施方式
及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见 的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种螺旋藻藻蓝蛋白的提取方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 (1)制备螺旋藻粉悬浊液取螺旋藻粉溶解于磷酸盐缓冲液中，制得螺旋藻粉悬浊液； (2)制备螺旋藻细胞破碎液将螺旋藻粉悬浊液采用反复冻融法结合机械破碎法处理，离心取上清，得到螺旋藻细胞破碎液； (3)制备藻蓝蛋白粗提液1:采用30%和50%硫酸铵溶液分级盐析沉淀螺旋藻细胞破碎液，透析除盐，得到藻蓝蛋白粗提液I ; (4)制备藻蓝蛋白粗提物将PEG20000和NaCl溶解至藻蓝蛋白粗提液1，配制成PEG20000-NaCl沉淀体系，静置、离心取沉淀，得到藻蓝蛋白粗提物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括以下步骤 (5)制备藻蓝蛋白粗提液2:用磷酸盐缓冲液溶解藻蓝蛋白粗提物，制得藻蓝蛋白粗提液2 ； (6)制备藻蓝蛋白精提液采用PEG20000/Na2S04双水相体系双水相萃取藻蓝蛋白粗提液2，分配平衡、离心分相，取下相，透析除盐，制得藻蓝蛋白精提液； (7)冷冻干燥制备藻蓝蛋白成品。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(I)中螺旋藻粉与磷酸盐缓冲液的比例为ImL磷酸盐缓冲液对应0. 04-0. 05g螺旋藻粉。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)为将螺旋藻粉悬浊液采用反复冻融法结合机械破碎法反复操作三次，反复冻融法结合机械破碎法反复操作三次的步骤为将螺旋藻粉悬浊液置于4-10°C下静置4-8h后至-15-25°C冰冻，将冰块绞碎，再次4-10°C至-15-25°C反复冻融与机械破碎直至反复操作三次；离心的转速为6000-9000rpm，时间为 20_30min。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中硫酸铵溶液分级盐析沉淀的方法为先将硫酸铵溶解至螺旋藻细胞破碎液至30%饱和度，4-10°C静置12-15h，9000-12000rpm下离心20-30min取上清，再向上清中溶解硫酸铵至50%饱和度，4-10°C静置12-15h，9000-12000rpm 下离心 20_30min 取沉淀； 透析除盐的步骤为将沉淀溶解于磷酸盐缓冲液中进行透析30-40h，换5-7次透析液。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述PEG20000-NaCl沉淀体系的组分为20%(w/v)PEG20000和0. 8mol/LNaCl ;静置为4_10°C静置12_15h，离心为9000-12000rpm 下离心 20_30min。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(6)中所述PEG20000/Na2S04双水相体系的组分包含 10. 5%(w/w)PEG20000,5. 9%(w/w)Na2SO4 和 0. 2mol/LNaCl ;分配平衡 l_2h后5000-7000rpm下离心20_30min分相；透析除盐的步骤为将下相溶液置于透析袋中进行透析30-40h，换5-7次透析液。
8.由权利要求1-7任一项所述方法制备的藻蓝蛋白粗提物。
9.由权利要求2-7任一项所述方法制备的藻蓝蛋白成品。
10.根据权利要求9所述的藻蓝蛋白成品，其特征在于，所述藻蓝蛋白成品的羟自由基半清除率IC5tl=O. 191mg/mL ；DPPH半清除率IC5tl=O. 296mg/mL ;荧光显微镜下其荧光强度与计量成比例关系，荧光分光光度计检测650nm有最大荧光发射峰。
全文摘要
本发明涉及螺旋藻藻蓝蛋白的提取方法，将螺旋藻粉悬浊液采用反复冻融法结合机械破碎法处理得到螺旋藻细胞破碎液；采用30%和50%硫酸铵溶液分级盐析沉淀螺旋藻细胞破碎液得到藻蓝蛋白粗提液1；加入PEG20000和NaCl进一步沉淀出较高纯度的藻蓝蛋白粗提物；用磷酸盐缓冲液溶解藻蓝蛋白粗提物，制得藻蓝蛋白粗提液2；藻蓝蛋白粗提液2进而用PEG20000/Na2SO4双水相体系萃取，萃取后的下相经过透析除盐可得藻蓝蛋白精提液，冷冻干燥制备藻蓝蛋白成品。本发明提取工艺简单、成本低，适于间歇性和规模化生产加工高纯度、高收率的螺旋藻藻蓝蛋白成品。本发明制得的藻蓝蛋白粗提物可长时间贮存，进一步纯化制备的藻蓝蛋白成品具有良好的抗氧化自由基清除效果和荧光强度。
文档编号C07K1/30GK102993297SQ20121050102
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月28日 优先权日2012年11月28日
发明者刘杨, 虞永蕾, 钟名其, 肖湘, 赵永杰 申请人:汕头大学