一种聚乙二醇修饰的蛋白质药物的修饰位点的测定方法
【专利摘要】本发明属于药物分析【技术领域】，具体而言涉及一种聚乙二醇修饰的蛋白质药物的修饰位点的测定方法，其中所述修饰位点为氨基修饰位点，所述氨基选自多肽链N末端的α氨基或多肽链中赖氨酸残基的ε氨基。本测定方法操作简单，适应性好，结果准确，可广泛用于聚乙二醇修饰的蛋白质药物中氨基修饰位点的确证，从而充分满足质量控制的要求。
【专利说明】一种聚乙二醇修饰的蛋白质药物的修饰位点的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物分析【技术领域】，具体而言涉及一种聚乙二醇修饰的蛋白质药物的 修饰位点的测定方法，其中所述修饰位点为氨基修饰位点。
【背景技术】
[0002] 聚乙二醇化技术（PEGylation)是20世纪70年代后期逐渐发展起来的一种热门 技术，是用水溶性聚合物修饰药用物质的方法之一，它可以解决化合物、蛋白和多肽等物质 在临床应用过程中存在的许多问题。研究证实，通过用聚乙二醇（PEG)来修饰蛋白质表面 的氨基酸残基可以有效提高血浆半衰期，减少给药次数，还可以降低蛋白质的免疫原性。过 去三十年，聚乙二醇化技术发展迅速，目前已有十余种聚乙二醇修饰的蛋白质药物上市，此 外还有多种聚乙二醇修饰的蛋白质药物处于临床研究阶段。
[0003] 早期的聚乙二醇修饰的蛋白质药物（如聚乙二醇腺苷脱氨酶、聚乙二醇天门冬酰 胺酶）采用分子量为5kDa的聚乙二醇对目标蛋白进行多位点修饰，因此，早期开发的产品 一般为多修饰的混合物，其中修饰位点的测定较为困难。
[0004] 随着聚乙二醇化技术的不断发展，出现了针对游离氨基（包括N末端的游离α氨 基和赖氨酸侧链的ε氨基）进行修饰的聚乙二醇琥珀酰亚胺酯修饰法，例如罗氏的派罗 欣、先灵葆雅的佩乐能均为此种修饰的成功应用实例，尽管制品为单修饰制品，但是制品中 仍存在多种位置异构体，而不同的位置异构体可能在理化性质、药理活性与安全性特征方 法存在较大差异，因此需对修饰位点进行测定，两家公司均采用了液质联用测定法对修饰 位点进行测定，该法的主要步骤是：采用酶切液对未修饰的干扰素及修饰后的干扰素进行 酶切，然后比较修饰前后干扰素液质图中发生改变的肽段，从而间接推测修饰位点。由于 聚乙二醇修饰后存在较大的空间位阻作用，使得酶切液难以充分酶切，难以获得与理论完 全一致的修饰液质图，导致修饰位点难以判断。此外，该测定方法对样品纯度要求较高，需 95%以上的样品纯度才能获得较理想的结果，因此，该方法在适用性和准确性方法仍不能满 足要求。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种聚乙二醇修饰的蛋白质药物的修饰位点的测定方法，其中修饰位 点为氨基，所述方法包括以下步骤： (1) 以聚乙二醇修饰的蛋白质药物的位置异构体为原料，制备均一化修饰的多肽片段， 其中所述多肽片段与聚乙二醇共价连接，且具有3-50个氨基酸残基； (2) 采用Edman降解法测定步骤（1)中的均一化修饰的多肽片段的氨基酸序列； (3) 将步骤（2)中的氨基酸序列对应至相应的蛋白质药物序列，若步骤（2)中出现两个 或多个无法正常测出的氨基酸，那么除半胱氨酸外的那个氨基酸所对应的位点即为修饰位 点；若步骤（2)中仅出现一个无法正常测出的氨基酸，那么该氨基酸所对应的位点即为修 饰位点。
[0006] 其中步骤（1)的多肽片段优选具有3-30个氨基酸残基；更优选的，步骤（1)的多 肽片段具有3-20个氨基酸残基；最优选的，步骤（1)的多肽片段具有4-15个氨基酸残基。 当蛋白质药物的氨基酸序列较短时，也可以聚乙二醇修饰的蛋白质药物的位置异构体直接 作为均一化修饰的多肽片段直接投入步骤（2)的Edman降解。
[0007] 其中步骤（2)中经过Edman降解获得的PTH氨基酸由柱前衍生的高效液相色谱进 行分析。
[0008] 其中步骤（3)中无法正常测出的氨基酸指，在柱前衍生的高效液相色谱图中无明 显氨基酸衍生物信号被检出的氨基酸。
[0009] 术语"蛋白质药物"指具有医药用途的蛋白质，其包括但不限于腺苷脱氨酶、天门 冬酰胺酶、干扰素（例如干扰素 a -2a、a _2b等）、粒细胞集落刺激因子、促红细胞生成素、 尿酸酶、凝血因子（例如因子VII、因子VIII等）、胰岛素、胰岛血糖素样肽-1、白细胞介 素、生长因子受体拮抗剂、胸腺肽、降纤酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶、蛇毒凝血酶、抑肽酶、 抗体。这些蛋白质可从其天然来源处（例如人）经由分离、提纯而获得，亦可通过固相化学 合成技术或重组DNA技术进行制备。获得这些蛋白质的方法是本领域公知的，技术人员可 根据具体情况（例如多肽序列的长短、产率等）选择适宜的方法。
[0010] 术语"聚乙二醇修饰的蛋白质药物"指蛋白质与聚乙二醇在适宜的反应条件下得 到的修饰产物，其中聚乙二醇与蛋白质可以多种摩尔比进行反应，从而得到单修饰或多修 饰的产物。本文使用的"聚乙二醇修饰的蛋白质药物"为单修饰的产物，其包括但不限于： 聚乙二醇腺苷脱氨酶、聚乙二醇天门冬酰胺酶、聚乙二醇干扰素、聚乙二醇人粒细胞集落刺 激因子（pegfilgrastim)、聚乙二醇人GH受体拮抗剂（pegvisomant)、聚乙二醇促红细胞生 成素、聚乙二醇尿酸酶，聚乙二醇降纤酶、聚乙二醇蛇毒凝血酶、聚乙二醇抑肽酶、聚乙二醇 超氧化物歧化酶、聚乙二醇凝血因子VIII，并优选为聚乙二醇干扰素，例如聚乙二醇干扰素 ct _2a、ct _2b 等。
[0011] 用于修饰蛋白质药物的聚乙二醇（PEG)可以是直链或分枝的PEG，其分子量为约 5, 000道尔顿（5k)到约60, 000道尔顿（60k)(术语"约"指在PEG中，某些分子具有大于 所陈述的分子量，有些分子具有小于所陈述的分子量）。优选地，PEG具有约20k到约50k 的分子量。
[0012] 用于修饰蛋白质药物的PEG优选为mPEG (单甲氧基醚PEG)，其包括但不限于 mPEG2-NHS (Y 型 mPEGN-羟基琥珀酰亚胺酯）、mPEG2-ALD (Y 型 mPEG 乙醛）、mPEG2-MAL (Y 型mPEG马来酰亚胺）、mPEG-SCM (mPEG乙酸NHS酯）、mPEG-SC (mPEG琥珀酰亚胺碳酸酯）、 mPEG-SS (mPEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯）、mPEG-NHS (mPEG N-羟基琥珀酰亚胺酯）、mPEG-MAL (mPEG 马来酰亚胺）、mPEG-NH2 (mPEG 胺）、mPEG-ALD (mPEG 丙醛）、mPEG-SPA (mPEG 琥珀 酰亚胺丙酸酸酯）、mPEG-SBA (mPEG琥珀酰亚胺丁酸酯）、mPEG-BTC (mPEG苯并三唑碳酸 醋）等。
[0013] 术语"修饰位点"指蛋白质表面上与聚乙二醇通过共价键连接的官能团，其为氨 基，所述氨基选自多肽链N末端的α氨基或多肽链中赖氨酸残基的ε氨基，更优选的，所 述氨基为多肽链中赖氨酸残基的ε氨基。
[0014] 聚乙二醇或其衍生物对蛋白质药物的修饰是本领域的常规技术，因蛋白质药物上 可能存在多个修饰位点，所得产物通常为单修饰产物和多修饰产物的混合物，基于分子量 的差异，单修饰产物可以以比较纯的方式被分离。
[0015] 术语"位置异构体"指，在聚乙二醇对蛋白质进行单修饰的过程中，与蛋白质上的 多个可修饰位点进行反应而得到的不同单修饰产物，这些单修饰产物的差别在于修饰位点 不同。基于不同位置异构体的电荷性质等性质的差异，这些位置异构体可以以比较纯的方 式被分离。例如，CN1711109A中所公开的聚乙二醇干扰素 a -2a的位置异构体及分离方法。
[0016] 术语"均一化修饰的多肽片段"与"均一化修饰片段"可交互使用，指在所述多肽片 段中，修饰位点是实质上相同的。实质上相同指至少80%相同，例如80%、81%、82%、83%、84%、 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同。优选 的，实质上相同指至少 90%相同，例如 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100% 相同。均一化程度可通过HPLC测定。
[0017] 本发明的均一化修饰的多肽片段是以基本纯的位置异构体为原料，通过多种方法 进行制备。一个典型的方法是：通过阳离子交换HPLC法将各修饰位置异构体分离，采用蛋 白内切酶对各修饰位置异构体充分水解后分离获得。多肽片段不宜过长或过短，过长的多 肽片段会增加 Edman降解的成本，而过短的多肽片段则可能无法对应至唯一的蛋白质药物 序列。
[0018] 本测定方法操作简单，适应性好，结果准确，可广泛用于聚乙二醇修饰的蛋白质药 物中氨基修饰位点的确证，从而充分满足质量控制的要求。
[0019] 本文可交互地使用术语"蛋白质药物"、"蛋白质"和"多肽"。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1 :聚乙二醇干扰素 a -2a的离子交换高效液相图。
[0021] 图2 :聚乙二醇干扰素 a -2a在分离前和分离后的阳离子交换HPLC图。其中曲线 "1"是分离前的HPLC图，曲线"2"、"3"、"4"和"5"分别对应于分离后各位置异构体的!^〇 图。
[0022] 图3 :位置异构体1酶切后的SE-HPLC图。
[0023] 图4 :各均一化位置异构体片段的SDS-PAGE分析。其中条带"M"是PEG的标准 分子量、条带"PI "是未酶切的PEG干扰素 a-2a、条带"PEG"是44kDa的mPEG2-NHS、条带 "1"、"2"、"3"和"4"分别对应于各位置异构体的酶切片段。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步的描述，然而，本发明中这些和其他实 施例仅用于阐明并不限制本发明的范围。本领域技术人员应该理解，对本发明技术特征所 作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
[0025] 实施例1修饰物均一度检测 (1)材料 44kDa的mPEG2-NHS修饰的干扰素 a -2a (简称修饰物） 其中干扰素 a_2a 可参照 Pestka, Arch. Biochem. Biophys. 221，1 (1993)的方法 进行制备，干扰素 a -2a的氨基酸序列如下： CDLPQTHSLG SRRTLMLLAQ MRKISLFSCL KDRHDFGFPQ EEFGNQFQKA ETIPVLHEMI QQIFNLFSTK DSSAAWDETL LDKFYTELYQ QLNDLEACVI QGVGVTETPL MKEDSILAVR KYFQRITLYL KEKKYSPCAff EVVRAEIMRS FSLSTNLQES LRSKE 其中44kDa的mPEG2-NHS由北京键凯科技有限公司提供，结构式如下所示：
【权利要求】
1. 一种聚乙二醇修饰的蛋白质药物的修饰位点的测定方法，其中修饰位点为氨基，所 述方法包括以下步骤： (1) 以聚乙二醇修饰的蛋白质药物的位置异构体为原料，制备均一化修饰的多肽片段， 其中所述多肽片段与聚乙二醇共价连接，且具有3-50个氨基酸残基； (2) 采用Edman降解法测定步骤（1)中的均一化修饰的多肽片段的氨基酸序列； (3) 将步骤（2)中的氨基酸序列对应至相应的蛋白质药物序列，若步骤（2)中出现两个 或多个无法正常测出的氨基酸，那么除半胱氨酸外的那个氨基酸所对应的位点即为修饰位 点；若步骤（2)中仅出现一个无法正常测出的氨基酸，那么该氨基酸所对应的位点即为修 饰位点。
2. 权利要求1的方法，其中步骤（1)中的多肽片段具有3-30个氨基酸残基。
3. 权利要求2的方法，其中步骤（1)中的多肽片段具有3-20个氨基酸残基。
4. 权利要求3的方法，其中步骤（1)中的多肽片段具有4-15个氨基酸残基。
5. 权利要求1-4中任一项的方法，其中聚乙二醇修饰的蛋白质药物选自聚乙二醇腺苷 脱氨酶、聚乙二醇天门冬酰胺酶、聚乙二醇干扰素、聚乙二醇人粒细胞集落刺激因子、聚乙 二醇人GH受体拮抗剂、聚乙二醇促红细胞生成素、聚乙二醇尿酸酶，聚乙二醇降纤酶、聚乙 二醇蛇毒凝血酶、聚乙二醇抑肽酶、聚乙二醇超氧化物歧化酶或聚乙二醇凝血因子VIII。
6. 权利要求5的方法，其中聚乙二醇修饰的蛋白质药物是聚乙二醇干扰素。
7. 权利要求6的方法，其中聚乙二醇修饰的蛋白质药物是聚乙二醇干扰素 a-2a或聚 乙二醇干扰素 a-2b。
8. 权利要求1-7中任一项的方法，其中用于修饰蛋白质药物的聚乙二醇是直链或分枝 的聚乙二醇，其分子量为约5k到约60k道尔顿。
9. 权利要求8的方法，其中所述聚乙二醇的分子量为约20k到约50k道尔顿。
10. 权利要求1-9中任一项的方法在聚乙二醇修饰的蛋白质药物中氨基修饰位点的确 证中的应用。
【文档编号】G01N33/50GK104120163SQ201310154747
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2013年4月28日 优先权日:2013年4月28日
【发明者】赵伟, 李国柱, 张喜全, 曹宇虹, 毕海, 秦宇, 苏贤德, 蒋丹 申请人:正大天晴药业集团股份有限公司