专利名称：双链结构的聚乙二醇衍生物的制备及其与药物分子的结合的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有双链结构的聚乙二醇活性衍生物、其制备方法以及与药物分子的结合物，所述药物分子特别是蛋白质和多肽等大分子，本发明还涉及包含所述结合物的药物组合物。
背景技术：
众多具有生物活性的药物分子，尤其是蛋白质和肽类等生物大分子，已在治疗中广泛应用，并获得成功。但这些生物大分子在临床应用中也有许多不利之处，例如易产生免疫排斥反应、稳定性及可溶性较差、清除速率较快。因此，人们采用了各种方法消除上述不利因素，其中聚乙二醇化技术是近年来发展起来的一种非常有效的改善生物大分子药代动力学性质的方法。
聚乙二醇化技术(PEGylation PEG化)又称为化学修饰，是目前分子变构化学(moleculealtering structure chemistry，MASC)中最重要的技术之一。PEG化技术的研究始于20世纪80年代，Abuchowski等第一次将聚乙二醇共价结合到蛋白质上，以保护蛋白质免遭破坏，结果发现聚乙二醇修饰不仅可以增加蛋白质的水溶性，还能减少肾脏的清除，改变了蛋白质的药代动力学和药效学性质。经过近几十年的发展，PEG化技术不仅在蛋白质类药物的开发中得到普遍的应用，而且已扩展到新型药物载体、控释制剂等各个领域。
在聚乙二醇化技术中，需要对聚乙二醇的端基进行活化，引入适当的活性基团，此活性基团对要结合的药物分子中的至少一个官能团具有活性，能与之形成稳定的化学键。
许多制备聚乙二醇活性衍生物的方法已被报道，Davis等人在美国专利4,179,337种公开了将聚乙二醇结合到蛋白质上，从而得到一种免疫原性较低，且能保持大部分生理活性的结合物。Nakagawa等人公开了将PEG结合到小岛活化蛋白质上以减少其副作用和免疫原性。Veronese等人在Applied Biochem.And Biotech，11141-152(1985)上公开了用氯甲酸苯酯类活化聚乙二醇以修饰核糖核酸酶和超氧化物歧化酶。Katre等人在美国专利4,766,106和4,917,888上也公开了通过聚合物结合使蛋白质增溶，将聚乙二醇同重组蛋白质结合以减弱蛋白质的免疫原性和提高他们的半衰期。
目前，聚乙二醇衍生物广泛的用于与蛋白质、多肽以及其他治疗药物的结合以延长所述药物的半衰期，降低其免疫原性和毒性。在临床使用中，PEG及其衍生物作为药物制剂的载体已经在很多商业药品中得到了广泛的应用，而将PEG结合到药物分子上的技术也在许多批准药品中被广泛的使用。如PEG-intron，一种干扰素和聚乙二醇的结合物就表现出了更长的半衰期和更好的治疗效果。紫杉醇与聚乙二醇的结合物也相应的降低了毒性和延长了生物活性。
上述形成PEG-蛋白质结合物的方法以及由所述方法得到的结合物存在几个问题，其一是形成这些结合物的方法会使蛋白质失活。另外，在形成这些PEG-蛋白质结合物时所用的某些连接基团易在体内水解，断裂，当给药以后发生这样的断裂时，这些结合物便失去了由PEG带来的有利性能。
发明内容
本发明提供一种新型的，以硫辛酸作为连接体，具有双链结构的聚乙二醇活性衍生物，具有以下结构通式 其中R1，R2为PEG本身的羟基或一个官能团，选自由C1~C12烷氧基、环烷氧基和芳烷基组成的基团。F为活性功能基团，选自由琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基或醛基组成的基团，可以与药物或基体上的氨基或巯基形成共价键连接。
根据本发明，这种活性衍生物优选分子具有以下结构，但不仅限于以下结构 结构1 结构2
结构3 结构4 结构5 结构6本发明还提供了制备上述活性衍生物的方法，包括以下步骤取单甲氧基聚乙二醇酸溶于二氯甲烷中，加入适量氯化亚砜，室温搅拌5-7小时后，旋转蒸发除去溶剂及剩余的氯化亚砜，将所得固体物溶于二氯甲烷中，再加入硫辛酸(还原型)和吡啶，室温下搅拌回流16-24小时。过滤并将所得滤液减压蒸干，固体物溶于二氯甲烷中，再加入N-羟基琥珀酰亚胺(N-羟基马来酰亚胺)，在二甲氨基吡啶(DMAP)与二环己基碳二亚胺(DCCI)存在下，温度-20~10℃，反应4小时。用水分离器分去水分，继续回流过夜，然后真空抽去二氯甲烷，混合物经乙醚沉淀，乙醇重结晶，再经Sephadex G-25柱进一步纯化，可得可得纯品双聚乙二醇硫代S-酸酯硫辛酸琥珀酰亚胺酯(或马来酰亚胺酯)(结构1和2)，置-20℃保存。
取单甲氧基聚乙二醇溶于二氯甲烷中，加入适量氯化亚砜，室温搅拌5-7小时后，旋转蒸发除去溶剂及剩余的氯化亚砜，将所得固体物质溶于乙醇中，再加入硫辛酸(还原型)和NaOH，室温下搅拌回流18-24小时后用盐酸调节pH值至5.0。将混合物溶剂减压蒸干，固体物溶于二氯甲烷中，再加入N-羟基琥珀酰亚胺(N-羟基马来酰亚胺)，在二甲氨基吡啶(DMAP)与二环己基碳二亚胺(DCCI)存在下，温度-20~10℃，反应4小时或过夜。用水分离器分去水分，继续回流过夜，然后真空抽去二氯甲烷，混合物经乙醚沉淀，乙醇重结晶，再经SephadexG-25柱进一步纯化，可得纯品双聚乙二醇硫醚硫辛酸琥珀酰亚胺酯(马来酰亚胺酯)(结构3和4)，置-20℃保存。
取硫辛酸(还原型)和N，N-羰基二咪唑混悬于二氯甲烷中，室温搅拌反应12小时或过夜，将滤液旋转蒸干，所得固体溶于四氢呋喃中并在四氢铝锂存在下，室温反应过夜。将所得混合物过滤后旋转蒸干。所得固体溶于二氯甲烷中，加入已制备的单甲氧基聚乙二醇氯(mPEG-Cl)或单甲氧基聚乙二醇酰氯(mPEG-COCl)和适量氯化亚砜，室温搅拌5-7小时后，旋转蒸发除去溶剂及剩余的氯化亚砜，将所得固体物质溶于二氯甲烷中，硫酸钠干燥，混合物经乙醚沉淀，乙醇重结晶，再经Sephadex G-25柱进一步纯化，可得可得纯品双聚乙二醇硫代S-酸酯硫辛酸醛(或双聚乙二醇硫醚硫辛酸醛)(结构5和6)，置-20℃保存。
根据本发明的另一个方面，提供上述活性衍生物通过F基团与药物分子形成的结合物以及包含这种结合物的药物组合物。上述聚乙二醇活性衍生物可以在温和的生理条件下(反应pH值在4~9之间，反应温度0~20℃)与具有自由氨基或巯基的药物分子结合，形成大分子结合物。这种结合物具有以下结构通式 以上所述药物分子可以是蛋白质或多肽，优选但不限于干扰素、红细胞生成素、G-CSF、胸腺肽，胸腺五肽(TP-5)、胸腺肽α1、肌肽、亮丙瑞林、戈那瑞林、阿拉瑞林、舍莫瑞林、奥曲肽、生长抑素、血管紧张素、阿基瑞林等。
除了蛋白质或多肽以外，药物分子还可以是选自氨基酸、糖类、有机酸、生物碱、黄酮类、甙类、醌类、萜类等药物分子中具有自由氨基或巯基的分子。
具体实施方案实施例1双聚乙二醇硫代S-酸酯硫辛酸琥珀酰亚胺酯的制备反应式 取10g单甲氧基聚乙二醇酸5000(0.002mol)溶于50ml二氯甲烷中，加入适量氯化亚砜，室温搅拌5-7小时后，旋转蒸发除去溶剂及剩余的氯化亚砜，将所得固体物溶于75ml二氯甲烷中，再加入0.21g硫辛酸(还原型)(0.001mol)和0.40g吡啶(0.005mol)，搅拌回流16-24小时。过滤并将所得滤液减压蒸干，固体物溶于50ml二氯甲烷中，再加入0.58g N-羟基琥珀酰亚胺(0.005mol)，在二甲氨基吡啶(DMAP)与二环己基碳二亚胺(DCCI)存在下，温度-20~10℃，反应4小时或过夜。用水分离器分去水分，继续回流过夜，然后真空抽去二氯甲烷，混合物经乙醚沉淀，乙醇重结晶，再经Sephadex G-25柱进一步纯化，可得可得纯品双聚乙二醇硫代S-酸酯硫辛酸琥珀酰亚胺酯8.2g，置-20℃保存。
实施例2双聚乙二醇硫代S-酸酯硫辛酸马来酰亚胺酯的制备反应式
取16g单甲氧基聚乙二醇酸8000(0.002mol)溶于50ml二氯甲烷中，加入适量氯化亚砜，室温搅拌5-7小时后，旋转蒸发除去溶剂及剩余的氯化亚砜，将所得固体物质溶于75ml二氯甲烷中，再加入0.21g硫辛酸(还原型)(0.001mol)和0.40g吡啶(0.005mol)，搅拌回流16小时。过滤并将所得滤液减压蒸干，固体物溶于50ml二氯甲烷中，再加入0.57g N-羟基马来酰亚胺(0.005mol)，在二甲氨基吡啶(DMAP)与二环己基碳二亚胺(DCCI)存在下，温度-20~10℃，反应4小时或过夜。用水分离器分去水分，继续回流过夜，然后真空抽去二氯甲烷，混合物经乙醚沉淀，乙醇重结晶，再经Sephadex G-25柱进一步纯化，可得可得纯品双聚乙二醇硫代S-酸酯硫辛酸马来酰亚胺酯14.1g，置-20℃保存。
实施例3双聚乙二醇硫醚硫辛酸琥珀酰亚胺酯的制备反应式
取20g单甲氧基聚乙二醇10000(0.002mol)溶于50ml二氯甲烷中，加入适量氯化亚砜，室温搅拌5-7小时后，旋转蒸发除去溶剂及剩余的氯化亚砜，将所得固体物质溶于75ml二氯甲烷中，再加入0.21g硫辛酸(还原型)(0.001mol)和0.20g NaOH(0.005mol)的乙醇溶液20ml，搅拌回流18-24小时后用盐酸调节pH值至5.0。将混合物溶剂减压蒸干，固体物溶于50ml二氯甲烷中，再加入0.58g N-羟基琥珀酰亚胺(0.005mol)，在二甲氨基吡啶(DMAP)与二环己基碳二亚胺(DCCI)存在下，温度-20~10℃，反应4小时或过夜。用水分离器分去水分，继续回流过夜，然后真空抽去二氯甲烷，混合物经乙醚沉淀，乙醇重结晶，再经SephadexG-25柱进一步纯化，可得纯品双聚乙二醇硫醚硫辛酸琥珀酰亚胺酯18.3g，置-20℃保存。
实施例4双聚乙二醇硫醚硫辛酸马来酰亚胺酯的制备反应式
取40g单甲氧基聚乙二醇20000(0.002mol)溶于100ml二氯甲烷中，加入适量氯化亚砜，室温搅拌5-7小时后，旋转蒸发除去溶剂及剩余的氯化亚砜，将所得固体物溶于150ml二氯甲烷中，再加入0.21g硫辛酸(还原型)(0.001mol)和0.2g NaOH(0.005mol)的乙醇溶液30ml，室温下搅拌回流18-24小时后用盐酸调节pH值至5.0。将混合物溶剂减压蒸干，固体物溶于100ml二氯甲烷中，再加入0.57g N-羟基马来酰亚胺(0.005mol)，在二甲氨基吡啶(DMAP)与二环己基碳二亚胺(DCCI)存在下，温度-20~10℃，反应4小时或过夜。用水分离器分去水分，继续回流过夜，然后真空抽去二氯甲烷，混合物经乙醚沉淀，乙醇重结晶，再经Sephadex G-25柱进一步纯化，可得纯品双聚乙二醇硫醚硫辛酸马来酰亚胺酯35.4g，置-20℃保存。
实施例5双聚乙二醇硫代S-酸酯硫辛酸醛的制备反应式
取0.21g硫辛酸(还原型)(0.001mol)和0.24g N，N-羰基二咪唑(0.0015mol)混悬于25ml二氯甲烷中，室温搅拌反应12小时或过夜，将滤液旋转蒸干，所得固体溶于20ml四氢呋喃中并在四氢铝锂存在下，室温反应过夜。将所得混合物过滤后旋转蒸干。所得固体溶于50ml二氯甲烷中，加入16g已制备的单甲氧基聚乙二醇氯8000(mPEG-Cl)(0.002mol)和适量氯化亚砜，室温搅拌5-7小时后，旋转蒸发除去溶剂及剩余的氯化亚砜，将所得固体物质溶于50ml二氯甲烷中，硫酸钠干燥，混合物经乙醚沉淀，乙醇重结晶，再经Sephadex G-25柱进一步纯化，可得可得纯品双聚乙二醇硫代S-酸酯硫辛酸醛15.0g，置-20℃保存。
实施例6双聚乙二醇硫醚硫辛酸醛的制备反应式
取0.21g硫辛酸(还原型)(0.001mol)和0.24g N，N-羰基二咪唑(0.0015mol)混悬于25ml二氯甲烷中，室温搅拌反应12小时或过夜，将滤液旋转蒸干，所得固体溶于20ml四氢呋喃中并在四氢铝锂存在下，室温反应过夜。将所得混合物过滤后旋转蒸干。所得固体溶于100ml二氯甲烷中，加入40g已制备的单甲氧基聚乙二醇酰氯20000(mPEG-COCl)(0.002mol)和适量氯化亚砜，室温搅拌5-7小时后，旋转蒸发除去溶剂及剩余的氯化亚砜，将所得固体物质溶于75ml二氯甲烷中，硫酸钠干燥，混合物经乙醚沉淀，乙醇重结晶，再经Sephadex G-25柱进一步纯化，可得可得纯品双聚乙二醇硫醚硫辛酸醛35.1g，置-20℃保存。
实施例7双链聚乙二醇-干扰素的制备取10mg/ml的干扰素硼酸缓冲液，pH＝9.0，加入双聚乙二醇硫代S-酸酯硫辛酸琥珀酰亚胺酯5000干粉500mg，4℃条件下反应8小时，经阴离子交换柱纯化，可得PEG-IFN样品。
权利要求
1.具有下列结构通式的聚乙二醇活性衍生物 或者 其中R1，R2为PEG本身的羟基或一个官能团，选自由C1~C12烷氧基、环烷氧基和芳烷基组成的基团。F为活性功能基团，选自由琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基或醛基组成的基团，可以与药物或基体上的氨基或巯基形成共价键连接。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于聚乙二醇的分子量为1000~40,000。
3.如权利要求1所述的化合物，其特征在于R1和R2选自甲氧基、乙氧基或苄基基团。
4.如权利要求1所述的化合物，其特征在于结构式为 或者
5.如权利要求1所述的化合物，其特征在于结构式为 或者
6.如权利要求1所述的化合物，其特征在于结构式为 或者
7.一种如权利要求1~6之一所述的化合物通过其活性端基与药物分子所形成的复合物，该复合物具有如下结构通式 或者 Y为连接基团，选自由烷基、酰胺基、羰基、酰肼基、酯基、醚基、硫醚基组成的基团。
8.如权利要求8所述的复合物，其中药物分子选自蛋白质、氨基酸、糖类、有机酸、生物碱、黄酮类、甙类、醌类、萜类。
全文摘要
众多具有生物活性的药物分子，尤其是蛋白质和肽类等生物大分子，已在治疗中广泛应用，并获得成功。但这些生物大分子在临床应用中也有许多不利之处，例如易产生免疫排斥反应、稳定性及可溶性较差、清除速率较快。聚乙二醇化技术是近年来发展起来的一种非常有效的改善生物大分子药代动力学性质的方法。本发明涉及一种新型的以硫辛酸作为连接体，具有双链结构的聚乙二醇活性衍生物、其制备方法以及与药物分子的结合，所述衍生物可用于连接药物分子特别是蛋白质和多肽等生物大分子的氨基、巯基等活性基团从而改善药物分子的药代动力学性质，本发明还涉及包含所述结合物的药物组合物。
文档编号A61K47/48GK1966547SQ20061009739
公开日2007年5月23日 申请日期2006年11月6日 优先权日2006年11月6日
发明者姚文兵, 田浤, 陈阳建, 宋潇达, 高向东 申请人:中国药科大学