具有持续高尔基体靶向成像能力的碳点及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物成像技术领域，具体涉及一种抗光漂白、具有持续高尔基体靶向成像能力的碳点及其制备方法。
【背景技术】
[0002]高尔基体(Golgi apparatus, Golgi complex)是真核细胞的细胞器之一，既是蛋白质修饰、分选、水解加工的场所，又是分泌物质的转运站。高尔基体的荧光成像对研宄细胞内生理活动及与高尔基体相关疾病的生理过程都有重要作用。自1985年Lipsky等将NBDC6-Ceramide用于高尔基体焚光成像后，神经酰胺类似物便成为高尔基体焚光革E向定位的常用染料。但是这种神经酰胺类似物随着细胞的代谢也会出现在线粒体与细胞质膜上，且实际应用表明该类物质具有细胞毒性。因此，非常有必要发展一种生物相容性好，具有长时间高尔基体靶向性能的荧光探针。
[0003]碳量子点(carbon quantum dots，简称碳点)，是继富勒稀、碳纳米管及石墨稀之后最热门的碳纳米材料之一。碳点不仅呈现出优良的光学活性与较小尺寸的特性，且生物相容性良好。从2004年碳点首次报道以来，许多研宄者通过改变碳源及合成方法制备出了一系列不同荧光颜色与量子产率的碳点。目前，碳点已广泛应用于生物成像，但是其在单个细胞中的分布较为分散，并不能对细胞中的某个细胞器进行精确定位。
[0004]因此制备一种具有良好生物相容性，且同时具有良好高尔基体靶向与成像能力的碳点是一项非常有挑战性且应用前景极好的工作。
【发明内容】
[0005]鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有持续高尔基体靶向成像能力的碳点及其制备方法，所述碳点能够精确对细胞中尚尔基体进彳丁定位，且具有良好的抗光漂白性和生物相容性。
[0006]本发明通过下述技术方案达到所述目的:
[0007]1、具有持续高尔基体革E向成像能力的碳点，制备方法包括如下步骤:
[0008]I)、按柠檬酸与L-半胱氨酸的质量比为1:0.25?1:1的比例，取柠檬酸并在150?250°C条件下加热O?20min，获得产物A ；
[0009]2)、取一定配比量的L-半胱氨酸和产物A混合，140?250°C加热3?60min，获得固体产物B ;
[0010]3)、先用氢氧化钾或氢氧化钠溶液将步骤2)所获固体产物B的pH调至6?8，然后用0.22 μ m的滤膜进行过滤，再用截留分子量500?100Da的透析袋透析12?48h，冷冻干燥即得碳点。
[0011]优选的，所述步骤I)中所述柠檬酸与L-半胱氨酸的质量比为1:1。
[0012]优选的，所述步骤I)中所述加热温度为200°C，加热时间为20min。
[0013]优选的，所述步骤2)中所述加热温度为150°C，加热时间为50min。
[0014]优选的，所述步骤3)中先用氢氧化钾或氢氧化钠溶液将步骤2)所获固体产物B的pH调至7。
[0015]2、制备具有持续高尔基体靶向成像能力的碳点的方法，包括如下步骤:
[0016]1)、按柠檬酸与L-半胱氨酸的质量比为1:0.25?1:1的比例，取柠檬酸并在150?250°C条件下加热O?20min，获得产物A ；
[0017]2)、取一定配比量的L-半胱氨酸和产物A混合，140?250°C加热3?60min，获得固体产物B ;
[0018]3)、先用氢氧化钾或氢氧化钠溶液将步骤2)所获固体产物B的pH调至6?8，然后用0.22 μ m的滤膜进行过滤，再用截留分子量500?100Da的透析袋透析12?48h，冷冻干燥即得碳点。
[0019]本发明研宄发现，L-半胱氨酸的量相对太少或者加入半胱氨酸后的温度太高都会使碳点的靶向成像能力减弱，因此，本发明通过实验研宄最终获得柠檬酸与L-半胱氨酸的最佳质量比范围，以及加热的温度范围。
[0020]另外，在本发明中，步骤2)中会产生硫化氢气体，所以需要注意废气的处理以免对人体造成伤害，在加热的过程中需要用玻璃棒将两种物质搅拌均匀。
[0021]本发明的有益效果在于:本发明首先在稍高的温度下将柠檬酸热解缩合成较小的碳点骨架，然后再在稍低温度下与L-半胱氨酸缩合，在最终形成碳点的同时也使碳点表面带上大量半胱氨酸残基，最终获得蓝色荧光强度高且具有持续高尔基体靶向能力的碳点，避免了常规方法繁冗的后续修饰步骤。通过本发明所述方法获得的蓝色碳点的绝对量子产率高达68%，且该碳点具有良好的抗光漂白性和生物相容性，为检测细胞生理过程与疾病诊断等提供了更精确的帮助。
【附图说明】
[0022]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图:
[0023]图1碳点的高分辨透射电镜图片，其中a图为在较低放大倍数下大量碳点的宏观图片，b图为较高放大倍数下碳点面内晶格图，c图为较高放大倍数下碳点面间晶格图。
[0024]图2碳点的X射线光电子能谱图，其中a图为碳点总体的X射线光电子能谱，b图为Cls的X射线光电子能谱，c图为N Is的X射线光电子能谱，d图为S 2p的X射线光电子能谱；a图中位于285eV左右的峰归属于碳元素，399eV左右的峰归属于氮元素，531eV左右的峰归属于氧元素，163eV左右的峰归属于硫元素；b图中键能为288.0eV的峰归属于羰基碳，键能为285.2eV的峰归属于与氮氧硫等以单键相连的碳，键能为284.6eV的峰归属于与其他碳原子单键相连的碳；c图中键能为399.3eV的峰为吡啶型N的峰，400.1eV的峰为吡咯型N的峰；(1图中可分别得到S 2pl/2与S 2p3/2的电子结合能，它们分别位于164.5eV与 162.8eV ；
[0025]另图中符号代表如下:C:碳元素；N:氮元素；0:氧元素；S:硫元素；1，2:主量子数；s，P:原子轨道；1/2，3/2:磁量子数和自旋量子数的和，其中自旋量子数取得是1/2和 _1/2。
[0026]图3碳点的傅立叶转换红外吸收光谱，图中符号代表如下:
[0027]-OH:羟基；-NH:氨基；-SH:巯基；C = O:羰基；C00-:酯；_CH⑴:烷基;_CH(2):烧基;
[0028]34300^^3240011^2978011^25260^^17080^^15810^^13880^1分别表示碳点中轻基、氣基、烧基(I)、疏基、幾基、醋、烧基(2)的红外特征吸收峰。
[0029]图4碳点的荧光光谱与紫外可见吸收光谱及其在自然光和紫外光下的图片；碳点的焚光最大发射位于420nm处，最大激发位于350nm处；碳点在350nm处有良好的紫外吸收，在245nm左右有良好的紫外吸收肩峰；a图为自然光下图片，b图为紫外光下图片。
[0030]图5碳点的细胞毒性实验结果。
[0031]图6碳点靶向高尔基体在转盘共聚焦显微成像系统下的照片；其中，a图为共聚焦显微镜下与碳点共同孵育的喉癌细胞(HEP2)明场图，b图为共聚焦荧光显微镜下碳点的荧光图片(蓝色)，c图为共聚焦荧光显微镜下高尔基体特异性荧光染料NBD C6-ceramide的荧光图，d图为明场与荧光通道下图片的重合图。
[0032]图7以D-半胱氨酸、硫代乙酰胺、L-丙氨酸、S-甲基-L-半胱氨酸为碳源获得的碳点的细胞成像图；其中，图ai_a3依次为D-半胱氨酸碳点的细胞成像图，图b i_b3依次为硫代乙酰胺碳点的细胞成像图，图C1-C3依次为L-丙氨酸碳点的细胞成像图，图d「屯依次为S-甲基-L-半胱氨酸碳点的细胞成像图，其中，I为细胞的明场图，2为荧光成像图，3为明场图和荧光图的叠加图，标尺为20 μm。
[0033]图8碳点长时间靶向高尔基体的转盘共聚焦显微成像系统拍摄图片涸士-屯为不同时间下碳点在荧光通道下的图片，a2-d2S细胞在明场通道与荧光通道下的叠加图。
[0034]图9碳点抗光漂白性能研宄结果叫-屯为碳点在荧光显微镜激光下连续激发60min的图片，a2-d2为高尔基体荧光染料NBD C6-ceramide在荧光显微镜激光下连续激发60min的图片，a3-d#激发不同时间点明场与荧光通道重合后的图片。
【具体实施方式】
[0035]下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0036]所用试剂包括:柠檬酸(上海晶纯生化科技股份有限公司，上海)，氢氧化钾(重庆川东化工(集团)有限公司，重庆)，实验中所用试剂均为分析纯，所用水均为超纯水(18.2M，Mil1-Q)。
[0037]所用仪器包括:MILIP0RE(美国)超纯水机；QL_901型漩涡混匀器(海门市其林贝尔器材制造有限公司)；DF-101S即热式恒温加热磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司)；95-2定时双向磁力加热搅拌器(金坛市友联仪器研宄所)；ΚΧΗ2-02-1ΑΒ恒温干燥箱(中国上海科析试验仪器厂，成都科析试验成套公司)；透析袋MD31 (500-1000)(上海易佰聚经贸有限公司)；0.22μπι滤头(重庆市钛新化工有限公司)；FTIR-8400S傅立叶转换红外光谱仪(日立，日本)；高倍透射电镜(Tecnai G2F20S-TWIN microscopy) ；ESCALAB250X-rayphotoelectron spectrometer ;紫外可见分光光度计(Shimadzu, Japan);焚光分光光度计(Hitachi, Japan) ；Absolute PL Quantum yield Spectrum Cl1347(HAMAMATSU, Japan);奥林巴斯转盘共聚焦显微成像系统(奥林巴斯，日本)。
[0038]本发明所述碳点的制备方法包括如下步骤:
[0039]I)、柠檬酸热解:按柠檬酸与L-半胱氨酸的质量比为1:0.25?I的比例，取柠檬酸加入圆底烧瓶，在150?250°C加热O?20min ；
[0040]2)、混合物热解:步骤I)完毕后，向圆底烧瓶中继续加入配比量的L-半胱氨酸，140?250°C继续加热3?60min，获得固体产物；
[0041]3)、酸碱中和:向步骤2)获得的固体产物中加入氢氧化钠或氢氧化钾溶液，至整个溶液pH呈6-8为止；
[0042]4)、纯化:将步骤3)得到的中性溶液用0.22 μπι的滤膜过滤，然后用截留分子量为500?100Da的透析袋透析12?48小时，透析后冷冻干燥即得碳点。
[0043]实施例1碳点的制备
[0044]碳点的制备方法如下:
[0045]I)、柠檬酸热解:将2