专利名称：二硫键稳定的多价抗体的制作方法
ニ硫键稳定的多价抗体 本发明涉及新的双特异性抗体融合蛋白质。此类抗体包含针对目的抗原的第一特异性，和针对第二目的抗原(例如用于延长它们的体内血清半衰期的血清载体蛋白)的第 ニ特异性。还提供用于产生此类分子的方法和包含它们的药物组合物。抗体的高特异性和亲合性使得它们成为理想的诊断和治疗试剂，特别是用于调节蛋白蛋白相互作用。重组抗体技术领域的发展已导致抗体片段例如Fv、Fab、Fab' 和F(ab' )2片段及其他抗体片段的产生。这些较小的分子保留了完整抗体的抗原结合活性并且还可以呈现与完整免疫球蛋白分子相比改善的组织穿透和药物动力学性质。甚至，从最近成功的产品(例如1^(^1"0@并且11^611113 )来看，抗体片段经证明是多用途的治疗剂。虽然此类片段显现出许多优于完整免疫球蛋白的优点，但它们也受累于增加的血清清除率，因为它们缺乏赋予其体内长存在期的Fc结构域(Medasan等人，1997， J.Immunol. 158 :2211-2217)。之前已经描述了具有双特异性的抗体，即其与两个不同的抗原结合(关于综述，參见 Segal 等人，1999，Curr.Opin. Immunol. 11 :558-562 ；Pluckthun & Pack， 1997， Immunotechnology，3:83-105 ；Fischer 禾ロ Leger，2007，Pathobiology，74，3—14)。 W002/02773、US2007065440、US2006257406、US2006106203 和 US2006280734 中也描述了双特异性抗体。之前的制备异-双特异性基于抗体的分子的方法通常使用化学交联或者蛋白质工程技木。化学交联受累于异-和同ニ聚体形成的低产量以及它们随后的色谱分离的要求。蛋白工程方法已经进行了非常详细的描述(例如knobs-into-holes engineering ； Ridgway等人，1996，ProteinEng. 9 (7) :617-621)或已经用于具有不适当的稳定性特征的分子(例如双抗体(diabody)，scFv)。在一些情况下，双特异性抗体还可受累于空间位阻问题，其使得两个抗原不能同时结合到各个抗体臂。单可变结构域抗体又名单域抗体或dAb，相当于抗体的重链(VH)或轻链(VL)的可变区。Ward等人，1989，Nature，；341，讨4づ46已经描述了鼠单域抗体。也已经描述了人和〃路马它化(camelised)“人单域抗体(Holt 等人，2003，Trends in Biotechnology, 21, 484-490)。也已经从骆驼(骆驼和美洲驼)和软骨鱼(斑纹须鲨和铰ロ鲨)中获得了单域抗体。这些生物已经进化出高亲和カ单V样结构域(骆驼中称为VhH，鲨鱼中称为V-NAR)， 所述结构域装配到Fc-等价恒定结构域构架作为它们的免疫系统的完整和重要的元件(关于综述，參见 Holliger & Hudson ；2005, Nature Biotechnology, 23 (9) :1126-1136) EP0368684中已经描述了单域抗体-酶融合物，W02004/058820中也已经描述了单域效应子群融合物，其包含单可变结构域。W02007/024715中已经描述了双可变结构域免疫球蛋白。EP1517921中已经描述了包含具有不同特异性的两个单域抗体的双特异性配体。用于改进抗体片段例如Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2及其他抗体片段的半衰期的方法是已知的。ー种方法将所述片段与聚合物分子缀合。因此，通过与聚乙ニ醇(PEG;參见，例如 W098/25791、W099/64460 和 W098/37200)缀合改善动物中 Fab'、F(ab' )2 片段的短的循环半衰期。另ー种方法通过与和Fcfoi受体相互作用的试剂缀合来修饰抗体片段(參见例如W097/34631)。另ー个用于延长半衰期的方法使用结合血清白蛋白的多肽(參见例如Smith 等人，2001，Bioconjugate Chem. 12 :750-756 ；EP0486525 ；US6267964 ；W004/001064 ； W002/076489 ；和W001/45746)。然而，仍然需要产生具有长的体内半衰期的抗原结合免疫球蛋白，作为具有长的半衰期的免疫球蛋白的替代物，因为它们与Fcfoi受体相互作用，不必通过与PEG缀合进行化学修饰或与人血清白蛋白缀合。多种蛋白质存在于血浆中并且包括甲状腺素结合蛋白、转甲状腺素蛋白、α 1酸糖蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原和白蛋白，或其任何片段。体内的血清载体蛋白循环具有以天计的半衰期，例如对于甲状腺素结合蛋白，5天或对于转甲状腺素蛋白，2天(Bartalena & Robbins, 1993, Clinics in Lab. Med. 13 :583-598)，或碘化 α 1 酸糖蛋白的周转的第二阶段，65 小时(Bree 等人，1986，Clin. Pharmacokin. 11 :336-342)。来自 Gitlin 等人(1964， J.Clin. Invest. 10:1938-1951)的数据表明孕妇中，α 1酸糖蛋白的半衰期是3. 8天，转铁蛋白12天和纤维蛋白原2.5天。血清白蛋白是血管和血管外区室中丰富的蛋白，其在人体中具有大约 19 天的半衰期(Peters, 1985，Adv Protein Chem. 37 :161-245)。这与 IgGl 的半衰期(大约 21 天)相似(Waldeman & Strober, 1969，Progr. Allergy, 13 :1-110)。本发明提供了改善的双特异性抗体融合蛋白，其可以重组产生并且能够同时结合两个抗原，特別是两个不同/相异抗原。因此，本发明提供双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对目的抗原的第一特异性的免疫球蛋白部分(例如Fab或Fab'片段)，并且进一歩包含具有对第二目的抗原的特异性的单域抗体(dAb)，特別地其中第一抗原和第二抗原是不同的实体。如本文使用的，单域抗体并非指单链Fv。单链Fv特征在于彼此连接的2个可变结构域，其形成独立实体，或仅通过其中的一个可变结构域与另ー实体连接。如本文使用的，多价是指具有两个或多个结合位点例如两个或三个结合位点(例如两个结合位点)的实体。各结合位点可以结合相同抗原上的相同表位或不同表位，或可以结合不同(相异)抗原。本发明还提供双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对目的抗原的第一特异性的免疫球蛋白部分(例如Fab或Fab'片段)，并且进一歩包含至少ー个具有对第二目的抗原的特异性的单域抗体。本发明的双特异性抗体融合物将能够选择性地结合两个目的抗原。在一个实施方案中，第一和第二抗原是相同抗原。在一个实施方案中，Fab或Fab'片段所结合的目的抗原可以是细胞相关蛋白， 例如細胞(例如細菌細胞、酵母細胞、T細胞、内皮細胞或肿瘤細胞)上的細胞表面蛋白， 或其可以是可溶性蛋白。目的抗原还可以是任何医学上相关的蛋白，例如在疾病或感染期间上调的那些蛋白，例如受体和/或它们相应的配体。細胞表面蛋白的具体实例包括粘着分子例如整联蛋白例如β 1整联蛋白例如VLA-4、E-选择蛋白、P-选择蛋白或L-选择蛋白、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CDlla, CDllb, CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、 CD40、CD45、CDW52、CD69、CD134 (0X40)、I COS, BCMP7、CD137、CD27L、CDCPl、DPCRl、DPCRl、 dudulin2、FLJ20584, FLJ40787, HEK2、KIAA0634、KIAA0659、KIAA1246、KIAA1455、LTBP2、 LTK, MAL2、MRP2、连接素样 2、NKCCl、PTK7、RAIGl、TCAMl、SC6、BCMP101、BCMP84、BCMPl 1、 DTD、癌胚抗原(CEA)、人乳脂肪球蛋白(HMFG1和2)、MHC I类和MHC II类抗原、和VEGF，和当适当时，其受体。
可溶性抗原包括白細胞介素(例如IL-I、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、 IL-12、IL-16或IL-17)，病毒抗原(例如呼吸道合胞病毒或巨細胞病毒抗原)，免疫球蛋白 (例如IgE)，干扰素(例如干扰素α、干扰素β或干扰素Y)，肿瘤坏死因子-α，肿瘤坏死因子-β，集落刺激因子(例如G-CSF或GM-CSF)和血小板源性生长因子(例如PDGF- α 和PDGF-β)和当适当时，其受体。其他抗原包括細菌細胞表面抗原、細菌毒素、病毒(例如流感病毒、EBV, H印A、B和C)、生物恐怖试剂、放射性核素和重金属、及蛇和蜘蛛毒和毒素。在一个实施方案中，本发明的抗体融合蛋白质可以用于功能性地改变目的抗原的活性。例如，抗体融合蛋白质可以直接或间接地中和、拮抗或激动(agonise)所述抗原的活性。在一个实施方案中，被本发明的双特异性抗体融合蛋白中的单域抗体结合的第二目的抗原可以是细胞相关蛋白，例如細胞(例如細菌細胞、酵母細胞、T細胞、内皮細胞或肿瘤細胞)上的細胞表面蛋白，或其可以是可溶性蛋白。目的抗原还可以是任何医学上相关的蛋白，例如在疾病或感染期间上调的那些蛋白，例如受体和/或它们相应的配体。細胞表面蛋白的特別的实例包括粘着分子例如整联蛋白例如β 1整联蛋白例如VLA-4、E-选择蛋白、P-选择蛋白或 L-选择蛋白、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CDlla, CDllb, CD18、CD19、 CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD45、CDW52、CD69、CD134 (0X40)、ICOS、BCMP7、CD137、 CD27L、CDCPU DPCRU DPCRU dudulin2、FLJ20584, FLJ40787, HEK2、KIAA0634、KIAA0659、 KIAA1246、KIAA1455、LTBP2、LTK、MAL2、MRP2、连接素样 2、NKCCl、PTK7、RAIGl、TCAMl、SC6、 BCMP101、BCMP84、BCMP11、DTD、癌胚抗原(CEA)、人乳脂肪球蛋白(HMFG1 和 2)、MHC I 类和 MHC II类抗原、和VEGF，和当适当时，其受体。可溶性抗原包括白細胞介素(例如IL-I、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、 IL-12、IL-16或IL-17)，病毒抗原(例如呼吸道合胞病毒或巨細胞病毒抗原)，免疫球蛋白 (例如IgE)，干扰素(例如干扰素α、干扰素β或干扰素Y)，肿瘤坏死因子-α，肿瘤坏死因子-β，集落刺激因子(例如G-CSF或GM-CSF)和血小板源性生长因子(例如PDGF- α 和PDGF-β)和当适当时，其受体。其他抗原包括細菌細胞表面抗原、細菌毒素、病毒(例如流感病毒、EBV, H印A、B和C)、生物恐怖试剂、放射性核素和重金属、及蛇和蜘蛛毒和毒素。可以被单域抗体结合的其他抗原包括血清载体蛋白，允许细胞介导的效应子功能招募的多肽，和核素螯合蛋白。因此，在一个实例中本发明提供了双特异性抗体融合蛋白，所述蛋白包含具有针对目的抗原的第一特异性的免疫球蛋白部分，并且进一歩包含具有针对第二蛋白的特异性的单域抗体，后者提供招募效应子功能的能力，例如补体途径激活和/或效应子細胞招募。 此外，本发明的融合蛋白可以用于通过与核素螯合蛋白结合的单域抗体螯合放射性核素。 此类融合蛋白用于成像或用于治疗的放射性核素靶向方法。因此，在一个实例中，提供分离的双特异性抗体融合蛋白质，其包含具有针对目的抗原的特异性的抗体Fab或Fab'片段，所述片段与至少ー个dAb融合，所述dAb具有针对招募多肽的特异性，所述dAb通过与所述招募多肽结合，直接或间接地提供招募細胞介导的效应子功能的能力。可以直接招募效应子功能(effector function)，因为效应子功能与細胞相关，所述细胞在它的表面上具有招募分子。当dAb与招募分子的结合引起例如可以直接或间接地招募效应子功能或可以经由信号传导途径活化的因子的释放吋，可发生间接招募。实例包括TNFa、IL2、IL6、IL8、IL17、IFN γ、组胺、Clq、调理素及经典的和可选择的补体活化级联的其他成员，例如C2、C4、C3-转化酶，和C5至C9。如本文使用的，“招募多肽〃包括Fc γ R(例如Fc γ RI、Fc YRII和Fc γ RIII)、 补体途径蛋白(例如但不限于Clq和C3)、CD标志物蛋白(分化标志物群)(例如但不限于 CD68、CDl 15、CDl6、CD80、CD83、CD86、CD56、CD64、CD3、CD4、CD8、CD28、CD45、CD19、CD20 和⑶22)。其为CD标志物蛋白的其他招募多肽包括CDl，CDld, CD2, CD5, CD8, CD9,⑶10， CDl 1, CDlla, CDllb, CDllc, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD40, CD43, CD44, CD45, CD46, CD49, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD58, CD59, CD61, CD62, D62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64, CD66e, CD68, CD70, CD71, CD72, CD79, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85, CD86, CD88, CD89, CD90, CD94, CD95, CD98, CD106, CD114, CD116, CD117, CD118, CD120, CD122, CD130, CD131, CD132, CD133, CD134, CD135, CD137, CD138, CD141, CD142, CD143, CD146, CD147, CD151, CD152, CD153, CD154, CD155, CD162, CD164, CD169, CD184, CD206, CD209, CD257, CD278, CD281, CD282, CD283 和 CD304，或保留直接或间接地招募細胞介导的效应子功能的能力的任何其片段。招募多肽还包括具有效应子功能的免疫球蛋白分子，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgE和IgA。在一个实施方案中，dAb对其具有特异性的第二蛋白是补体途径蛋白，特別优选的
定 Clq0在优选实施方案中，dAb对其具有特异性的第二蛋白是CD标志物蛋白，特別优选的是 CD68、CD80、CD86、CD64、CD3、CD4、CD8、CD45、CD16 和 CD35。因此，还提供分离的双特异性抗体融合蛋白质，其包含对目的抗原具有特异性的抗体片段，所述片段与至少ー个dAb融合，所述dAb对选自CD68、CD80、CD86、CD64、CD3、CD4、 ⑶8、⑶45、⑶16和⑶35的⑶分子具有特异性。在一个实施方案中，单域抗体为具有第一特异性的免疫球蛋白部分提供延长的半衰期。因此，在一个实施方案中，提供双特异性抗体融合蛋白质，其包含对目的抗原具有特异性的抗体Fab或Fab ‘片段，所述片段与至少ー个单域抗体融合，所述单域抗体对血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子、或CD35/CR1具有特异性，所述单域抗体通过与所述血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子或CD35/CR1结合，为对所述目的抗原具有特异性的抗体片段提供延长的半衰期。在一个实施方案中，提供分离的双特异性抗体融合蛋白质，其包含对目的抗原具有特异性的抗体Fab或Fab ‘片段，所述片段与至少ー个单域抗体融合，所述单域抗体对血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子、或CD35/CR1具有特异性，所述单域抗体通过与所述血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子或CD35/CR1结合，为对所述目的抗原具有特异性的抗体片段提供延长的半衰期。如本文使用的，“血清载体蛋白"包括甲状腺素结合蛋白、转甲状腺素蛋白、α 酸糖蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原和白蛋白、或任何其片段。如本文使用的，“循环免疫球蛋白分子〃包括IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM和IgD、或任何其片段。⑶35/CR1是在红細胞上存在的蛋白，其半衰期为36天(正常范围为观至47天； Lanaro 等人，1971，Cancer, 28 (3) :658-661)。在优选实施方案中，dAb对其具有特异性的第二蛋白是血清载体蛋白，特別优选的是人血清载体蛋白。在非常优选的实施方案中，血清载体蛋白是人血清白蛋白。因此，提供了双特异性抗体融合蛋白质，其包含对目的抗原具有特异性的抗体Fab 或Fab'片段，所述片段与对人血清白蛋白具有特异性的至少ー种单域抗体融合。在一个实施方案中，本发明提供分离的双特异性抗体融合蛋白质，其包含对目的抗原具有特异性的抗体Fab或Fab'片段，所述片段与对人血清白蛋白具有特异性的至少一种单域抗体融合。在一个实施方案中，对目的抗原具有特异性的抗体片段是Fab片段。在另ー个实施方案中，对目的抗原具有特异性的抗体片段是Fab'片段。因此，在一个优选的实施方案中，本发明的抗体融合蛋白是翻译融合蛋白，即基因融合物，其各个序列通过表达载体编码。可选地，已经使用化学方法(即通过化学缀合或化学交联)来将抗体融合蛋白的组分融合。所述化学方法是本领域已知的。在一个实例中，抗体片段是具有天然或经修饰的绞链区的Fab'片段。当用于制备本发明的双特异性抗体融合蛋白质的抗体片段是Fab'片段吋，通常在重链的C末端将所述片段延伸一个或多个氨基酸。因此，本发明的抗体融合物可以包括直接或经由连接体与dAb翻译融合(或化学融合)的!^ab'片段。此外，适当的抗体Fab'片段的实例包括 W02005003170 和 W02005003171 中描述的那些。在另ー个实例中，抗体片段是Fab片段。因此，本发明的抗体融合物可以包括与连接体序列翻译融合(或化学融合)的Fab片段，所述连接体序列又与dAb翻译融合(或化学融合)。优选地，Fab片段是以链间半胱氨酸终止的Fab片段，如W02005/003169中描述的。因此，在一个实例中，Fab片段在IgGl的位置233处终止。 本发明中使用的抗体Fab或Fab ’片段可以来自任何物种，优选来源于单克隆抗体、人抗体，或是人源化片段。本发明所用的抗体片段可以来源于免疫球蛋白分子的任何种类(例如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA)或亚类并且可以从任何物种(包括例如小鼠、大鼠、鲨鱼、兔子、猪、仓鼠、骆驼、美洲驼、山羊或人)获得。在一个实施方案中，抗体Fab或Fab'片段是单克隆、完全人、人源化或嵌合抗体片段。在一个实施方案中，抗体Fab或Fab'片段是完全人的或人源化的。可以通过本领域已知的任何方法制备单克隆抗体，例如杂交瘤技术(Kohler & Milstein, Nature，1975，256，495-497)，三体杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor 等人，Immunology iToday, 1983，4，72)和 EBV-杂交瘤技术(Cole 等人，“Monoclonal Antibodies and CancerTherapy" , pp. 77-96, Aian R. Liss,Inc.,1985)。还可以使用单淋巴細胞抗体法，通过克隆和表达免疫球蛋白可变区cDNA产生本发明使用的抗体，所述cDNA从选择用于产生特异性抗体的单淋巴细胞产生，通过例如 Babcook，J.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996,93 (15), 7843-7848, WO 92/02551， W02004/051268 和 W02004/106377 描述的方法。人源化抗体是具有来自非人物种的ー个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的构架区的来自非人物种的抗体分子(參见例如US 5，585，089)。还可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法产生本发明使用的抗体，并且此类方法包括 Brinkman 等人，J. Immunol. Methods, 1995,182,41-50 ；Ames 等人，J. Immunol. Methods 1995，184，177-186 ；Kettleborough 等人 Eur. J. Immunol.，1994，24952-958 ； Persic 等人，Gene，1997187，9—18 ；禾ロ Burton 等人，Advances in Immunology,1994, 57,191-280 ；WO 90/02809 ；WO 91/10737 ；WO 92/01047 ；W092/18619 ；WO 93/11236 ； WO 95/15982 和 WO 95/20401 ；和 US 5, 698, 426 ；5,223, 409 ；5, 403, 484 ；5,580, 717 ； 5，427，908 ；5，750，753 ；5，821，047 ；5，571，698 ；5，427，908 ；5，516，637 ；5，780，225 ； 5，658，727 ；5, 733，743 ；和5，969，108中公开的方法。并且，转基因小鼠或其他生物(包括其他哺乳动物)可以用来产生人源化抗体。完全人抗体是其中重链和轻链的可变区和恒定区(当存在时)全部为人来源，或与人来源的序列(不必来自相同抗体)基本上同一的那些抗体。完全人抗体的实例可以包括例如通过上述噬菌体展示方法产生的抗体和由其中鼠免疫球蛋白可变和/或恒定区基因已经被它们的人对应物取代的小鼠生产的抗体(例如，EP0M6073 BUUS 5, 545,806, US5, 569，825、US 5, 625, 126,US 5, 633, 425,US 5, 661, 016,US 5, 770, 429,EP 0438474 Bl 和EP0463151 Bl中一般性描述的)。本发明使用的抗体Fab或Fab'片段的起始材料可以使用任何适当的酶切割和/ 或消化技术(例如通过用胃蛋白酶处理)获自任何完整抗体，特別是完整单克隆抗体。可选地，或另外，可以通过使用重组DNA技术(包括操作和重表达编码抗体可变和/或恒定区的 DNA)制备抗体起始材料。标准分子生物学技术可以用于修饰、添加或缺失期望的氨基酸或结构域。如本文使用的，对可变或恒定区的任何改变仍然包括在术语"可变"和"恒定" 区内。抗体片段的起始材料可以获自任何物种，包括例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠、骆驼、美洲驼、山羊或人。抗体片段部分可以获自ー种以上的物种，例如抗体片段可以是嵌合的。在一个实例中，恒定区来自一个物种而可变区来自另ー个物种。抗体片段的起始材料还可以是经修饰的。在另ー个实例中，使用重组DNA工程技术产生抗体片段的可变区。此类工程改造的形式包括例如通过插入、缺失或改变天然抗体的氨基酸序列从天然抗体可变区产生的那些。这个类型的特別的实例包括那些工程改造的可变区结构域，所述结构域包含至少ー 个CDR和任选地，来自ー个抗体的一个或多个构架氨基酸和来自第二抗体的可变区结构域的其他部分。产生和制造这些抗体片段的方法是本领域公知的(參见，例如，Boss等人，US 4，816，397 ；Cabilly 等人，US 6，331，415 ；Shrader 等人，WO 92/02551 ；Ward 等人，1989， Nature,341, 544 ；Orlandi 等人，1989，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3833 ；Riechmann 等人，1988, Nature, 322，323 ；Bird 等人，1988，Science, 242,423 ；Queen 等人，US 5，585，089 ； Adair,W091/09967 ；Mountain 禾ロ Adair，1992Biotechnol. Genet. Eng. Rev, 10，1—142 ；Verma 等人，1998，Journalof Immunological Methods，216，165-181)。在本发明中，与Fab或Fab'片段融合的各个单域抗体可以直接或经由连接体连接。本文使用的直接连接是指，Fab或Fab'的"最后ー个"氨基酸通过肽键与单域抗体的"第一个"氨基酸相连(或反之亦然)。
用于将dAb与Fab或Fab'连接的适当的连接体区域的实例包括但不限于，柔性连接体序列和刚性连接体序列。柔性连接体序列包括在Huston等人1988，PNAS 85: 5879-5883 ；Wright & Deonarain，Mol.Immunol. ,2007,44(11) :2860-2869 ；Alfthan 等人， Prot. Eng. , 1995,8(7) :725-731 ；Luo 等人，J. Biochem. , 1995,118(4) :825-831 ；Tang 等人，1996，J. Biol. Chem. 271 (26) 15682-15686 ；和 Turner 等人，1997，JIMM 205，42-54 中公开的那些(关于代表性实例，參见表1)。表1.柔性连接体序列
权利要求
1.一种多价抗体融合蛋白，其包含对于目的抗原具有第一特异性的Fab或Fab'片段， 且进一歩包含其为对于第二目的抗原具有特异性的VH/VL对的两个单域抗体(dAb)，其中所述两个单域抗体通过在2个半胱氨酸残基之间的ニ硫键连接，所述2个半胱氨酸残基一个在VH中并且ー个在VL中，其中所述2个半胱氨酸残基的位置选自VH37和VL95、VH44和 VL100、VH44 和 VL105、VH45 和 VL87、VH100 和 VL50、VHlOOb 和 VL49、VH98 和 VL46、VHlOl 和 VL46、VH105 和 VL43 以及 VH106 和 VL57。
2.根据权利要求1的多价抗体融合蛋白，其中VH的半胱氨酸在位置44上，并且VL的半胱氨酸在位置100上。
3.根据权利要求1或权利要求2的多价抗体融合蛋白，其中所述两个单域抗体是协同结合所述第二抗原的互补VH/VL对。
4.根据权利要求1-3中任ー项的多价抗体融合蛋白，其中所述第一抗原和第二抗原是不同的实体。
5.根据权利要求1-4中任ー项的多价抗体融合蛋白，其中所述VHdAb与所述Fab或 Fab'重链直接或间接连接。
6.根据权利要求1-5中任ー项的多价抗体融合蛋白，其中所述VLdAb与所述Fab或 Fab'轻链重链直接或间接连接。
7.根据权利要求5或权利要求6的多价抗体融合蛋白，其中所述VHdAb与所述Fab或 Fab ‘重链的C末端直接或间接连接，并且所述VLdAb与所述Fab或Fab ‘轻链的C末端直接或间接连接。
8.根据权利要求5或权利要求6的多价抗体融合蛋白，其中所述ル(^13与所述Fab或 Fab ‘重链的N末端直接或间接连接，并且所述\dAb与所述Fab或Fab ‘轻链的N末端直接或间接连接。
9.根据权利要求1-8中任ー项的多价抗体融合蛋白，其中所述VH和/或VL结构域经由具有SEQ ID NO :2 或SEQ ID NO :225中给出的序列的连接体与所述Fab或Fab ‘片段连接。
10.根据权利要求8的多价抗体融合蛋白，其中所述VHdAb经由具有SEQ ID NO 228 中给出的序列的连接体与所述Fab或Fab'重链的N末端连接，并且所述VL dAb经由具有 SEQ ID NO 229中给出的序列的连接体与所述Fab或Fab'重链的N末端连接。
11.根据权利要求1-10中任ー项的多价抗体融合蛋白，其中所述第二抗原是白蛋白。
12.根据权利要求1-11中任ー项的多价抗体融合蛋白，其中所述第二抗原是人血清白蛋白。
13.根据权利要求12的多价抗体融合蛋白，其中所述VH单域抗体包含对于CDR-Hl 具有图5(e) SEQ ID NO :56或图5 (k) SEQ ID NO :62中给出的序列的CDR，对于CDR-H2具有图5(f) SEQ ID NO :57或图5 (I)SEQ ID NO :63中给出的序列的CDR，和对于CDR-H3具有图 5(g) SEQ IDNO :58 或图 5(m)SEQ ID NO :64 中给出的序列的 CDR。
14.根据权利要求12的多价抗体融合蛋白，其中所述VL单域抗体包含对于CDR-Ll 具有图5(h) SEQ ID NO :59或图5 (n) SEQ ID NO :65中给出的序列的CDR，对于CDR-L2具有图5⑴SEQ ID NO :60或图5 (ο) SEQ ID NO :66中给出的序列的CDR，和对于CDR-L3具有图 5 (j) SEQ IDNO :61 或图 5 (ρ) SEQ ID NO :67 中给出的序列的 CDR0
15.根据权利要求12的多价抗体融合蛋白，其中所述VH单域抗体包含SEQID NO :202 中给出的序列，并且所述VL单域抗体包含SEQ IDNO :203中给出的序列。
16.根据权利要求12的多价抗体融合蛋白，其中所述VH单域抗体包含SEQID NO :204 中给出的序列，并且所述VL单域抗体包含SEQ IDNO :205中给出的序列。
17.一种结合白蛋白的Fv或scFv，其包含具有SEQ ID NO :202中给出的序列的VH结构域。
18.一种结合白蛋白的Fv或scFv，其包含具有SEQ ID NO :204中给出的序列的VH结构域。
19.根据权利要求17的结合白蛋白的Fv或scFv，其进ー步包含具有SEQID NO :203 中给出的序列的VL结构域。
20.根据权利要求18的结合白蛋白的Fv或scFv，其进ー步包含具有SEQID NO :205 中给出的序列的VL结构域。
全文摘要
多价抗体融合蛋白，其包含对于目的抗原具有第一特异性的免疫球蛋白部分，例如Fab或Fab′片段，且进一步包含其为VH/VL对的对于第二目的抗原具有特异性的两个单域抗体(dAb)，其中所述两个单域抗体通过二硫键连接。还提供的是通过二硫键稳定的特定双特异性抗体融合蛋白及其他抗体片段。
文档编号C07K16/46GK102549018SQ201080042387
公开日2012年7月4日 申请日期2010年9月24日 优先权日2009年9月25日
发明者L·汉库克, R·亚当斯, S·P·海伍德 申请人:Ucb医药有限公司