抗体的稳定性试验的制作方法

专利名称：抗体的稳定性试验的制作方法
抗体的稳定性试验背景信息近年来制药工业领域在以酶、抗体和细胞因子(例如促红细胞生成素、干扰素、纤 溶酶原激活物等)为基础的产品方面取得巨大成功。全世界对蛋白质治疗药物的需求逐年 增加。治疗性单克隆抗体(mAbsnionoclonal迎tihodies)在蛋白质治疗中是重要一类。它 们被称为单克隆，因为相对于多克隆抗体，它们是由衍生自单个抗体形成细胞的免疫细胞 (细胞克隆)分泌的。单克隆抗体的特征在于它们每个仅直接对抗免疫原性物质的一个表 位，从而仅对抗一个抗原决定簇，并且因此在治疗疾病中可以非常特异地应用。蛋白质治疗 的实例是Roche Diagnostics GmbH Company(罗氏诊断有限责任公司)的单克隆抗体曲妥 单抗(商品名赫赛汀(Here印tin))、达珠单抗(商品名赛尼哌(Zenapax))和利妥昔单 抗(商品名美罗华(MabThera))，它们已经成功地用于治疗乳腺癌(曲妥单抗)、器官排斥 反应(达珠单抗)和治疗非霍奇金淋巴瘤(利妥昔单抗)。治疗性单克隆抗体是通过复杂的生物技术方法获得的。降解产物可以在它们制 备、配制和贮存过程中产生，这常常是由于例如氧化和脱酰胺反应以及蛋白酶剪切过程引 起的(Yan，B.等人，J. Chromatog.A 1164(2007) 153-161)。由于分子中结构改变，生物制品 的修饰可能导致活性和/或免疫原性的改变，即使它们仅轻微发生。除了它的作用之外，生物制药产品的质量是决定性重要的。因此，为了安全应用它 们作为治疗药物，除了详细研究作用方式之外，测定基于蛋白质的药物的同一性、纯度和活 性是完全必需的。尽管mAbs可以通过多种分离和试验技术来成功分析，但是长期以来还难以应用 和优化RP-HPLC方法(RP-HPLC，反相高效液相色谱法)来分离抗体种类。但是，抗体的 多种修饰常常同时存在于降解过程中，这使得更难以分析不同色谱和电泳条带。通过液 相色谱分离方法联用高分辨质谱仪(LC/MS，液相色谱法/质谱法)的分析获得了多种种 类准确质量的信息，并且因此便于鉴定抗体变体(Dillon，Τ. Μ.等人，J. Chromatogr. A, 1053(2004)299-305)。从人病原体化脓链球菌中获得的半胱氨酸内切蛋白酶IdeS(免疫球蛋白降 解酶S)，其也称为Mac-I或sib-38，是半胱氨酸蛋白酶，其特异性切割G型免疫球蛋 白(IgG)抗体的重链。IgG是迄今为止仅仅已知的IdeS底物(Vincents，B.等人， Biochem. 43 (2004) 15540-15549)。IdeS包含339个氨基酸，包括含29个氨基酸的信号肽 (von Pawel-Rammingen, U.等人，EMB0J. 21(2002) 1607-1615)，其中 RGD基序是由 214至 216 位氨基酸形成的。IdeS在识别序列LLGGP中的236和237位氨基酸(Gly-Gly)间切割人 IgG (G类免疫球蛋白)。人IgG2在识别基序PVAGP中的丙氨酸和甘氨酸间被切割。IgG2a 和 IgG3 型鼠抗体也被切割(Vincents, B.等人，Biochem. 43(2004) 15540-15549)。Hess, J. K.等人(Hess, J. K.等人，J. Microbiol. Meth. 70 (2007) 284-291)报道了 质谱方法，其借助SELDI-T0F质谱法测定IdeS的酶活性。在US2007/0237784中报道了从 化脓链球菌中分离并且具有IgG半胱氨酸蛋白酶活性的多肽。在欧洲专利申请EP 1 458 861中报道了形成抗体的Fc或Fab片段的方法。在WO 2006/131347中报道了来自A组链球菌的IdeS蛋白酶。发明概述本发明描述了用于检测样品中抗体和抗体片段或抗体修饰形式的方法，其特征在 于包括下列步骤a)提供包含抗体和/或其切割产物的样品，b)将a)项中提供的样品与下列物质温育i) IgG特异性半胱氨酸蛋白酶，ii)糖苷酶，iii)还原剂，c)将b)项中温育的样品通过联用的液相色谱法和质谱法进行分析以检测a)项提 供的溶液中包含的完整的抗体和检测抗体片段或修饰形式。在该方法的一个实施方案中，IgG特异性半胱氨酸蛋白酶是IdeS。在进一步的实 施方案中，半胱氨酸蛋白酶IdeS衍生自化脓链球菌或齿垢密螺旋体。在进一步的实施方案 中，IgG特异性半胱氨酸蛋白酶具有氨基酸序列SEQ ID NO :1。另一个实施方案包括与IgG 特异性半胱氨酸蛋白酶在pH范围为5. 5至8. 5之间温育。在另一个实施方案中，pH范围为 PH 7.0至8.0之间，并且在进一步的实施方案中在pH 7. 5至8.0之间。在进一步的实施方 案中，IgG特异性半胱氨酸蛋白酶与样品中包含的抗体和/或抗体片段的摩尔比为1 25 至1 2500之间、优选1 25至1 100之间。在另一个实施方案中，糖苷酶是N-糖苷 酶F(PNGase F)。另一个实施方案的特征在于N-糖苷酶F衍生自脑膜炎脓毒性黄杆菌(EC 3. 2. 2. 18、EC 3. 5. 1. 52)。在另一个实施方案中是糖苷酶Endo H并且在pH 6. 0至6. 5之 间应用。在另一个实施方案中，糖苷酶具有氨基酸序列SEQ ID NO :2。在另一个实施方案 中，该方法的特征在于将a)项提供的样品在b)项中首先与IgG特异性半胱氨酸蛋白酶 温育，随后与糖苷酶温育。在另一个实施方案中，还原剂是磷酸三氯乙酯(TCEP)。在另一 个实施方案中，还原剂与甲酸同时加入，并且温育在两种试剂的存在下进行。在进一步的实 施方案中，与还原剂的温育在温度为60°C或更高下进行。在进一步的实施方案中，质谱法 是电喷射离子化飞行时间质谱法(ESI-TOF)。在进一步的实施方案中，液相色谱法是疏水 性相互作用色谱法或η-η相互作用色谱法。在疏水性相互作用色谱法的情况中，另一个 实施方案中的色谱配体是C8或C18配体，其是键合至色谱材料上的，具有300埃的孔径，或 者在JI-Ji相互作用色谱法的情况中，色谱配体是二苯基配体。在进一步的实施方案中，将 Jupiter C18柱或Zorbax 300SB C8柱或Pursuit 二苯基柱应用于液相色谱法。在另一个 实施方案中应用Pursuit 二苯基柱。在进一步的实施方案中，步骤c)中的液相色谱法是反 相色谱法。本发明的另一个方面是检测抗体修饰形式的方法，其中步骤c)是通过疏水性相 互作用色谱法分析b)项中温育的样品。本发明还包括IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶在检测样品中的抗体或抗体片段中的 用途，其特征在于将样品与IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶温育，并且与糖苷酶温育后，将获 得的片段通过联用的液相色谱法和质谱法分析。本发明的一个方面还是用于检测抗体或抗体片段的试剂盒，其特征在于该试剂盒 包含i)来自化脓链球菌的IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶，和
ii)来自脑膜炎脓毒性黄杆菌的内切糖苷酶N-糖苷酶F。发明详述本研究关注治疗性单克隆抗体的降解产物和修饰物的分析，其是例如在抗体的生 产、抗体的贮存过程中或者通过抗体配制过程中的应激条件形成的。“多肽”是包含由肽键连接在一起的氨基酸的聚合物。其可以是通过酶解或合成产 生的。包含小于20个氨基酸的多肽也称为“肽”。“蛋白质”是大分子，其包含两个或多个多肽，或者它是包含超过100个氨基酸的多 肽。蛋白质也可以包含非肽组分，例如碳水化合物。碳水化合物和其它非肽修饰物是通过 表达蛋白质的细胞加入的，并且因此取决于细胞类型。在本申请中，蛋白质是通过它们的氨 基酸序列来定义的。修饰物(例如碳水化合物)没有明确描述，但是经常存在。本申请中同义应用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”表示包含至少两条轻多肽链 (LC)和两条重多肽链(HC)的分子。每条轻和重多肽包含可变区(通常是多肽的氨基端)， 其包含结合抗原的结合域。每条重和轻多肽包含恒定区(通常是多肽的羧基端)，其例如 负责抗体与细胞的结合。轻多肽或轻链(LC)通常包含可变域\和恒定域Q。重多肽或 重链(HC)通常包含可变域￥11和恒定区，恒定区包含结构域(^1、铰链区、Ch2、Ch3和任选的 Ch4。抗体可以以多种形式出现，例如Fv、Fab和F(ab)2以及单链(scFv)(例如Huston, J. S.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(1988)5879-5883 ；Bird, R. Ε.等人，Science 242(1988)423-426 ；和 Hood，L. Ε.等人，Immunology, Benjamin N. Y.，第 2 版(1984)以及 Hunkapi 1 Ier，Τ.和Hood，L.，Nature 323(1986) 15-16)。取决于抗体重链恒定区的氨基酸 序列，将抗体(免疫球蛋白，Ig)分为多个种类=IgA, IgD, IgE, IgG和IgM0这些种类中的 一些进一步细分为亚类(同种型)，例如IgG分为IgGl、IgG2、IgG3和IgG4 ；或者IgA分 为IgAl和IgA2。取决于抗体所属的类型，将重链恒定区称为α (IgA)、δ (IgD)、ε (IgE)、 Y (IgG)和 μ (IgM)。通用色谱方法是本领域技术人员已知的，例如Chromatography (色谱)， 第 5 版，A 部 fundamentals and Techniques (原理与技术)，Heftmann, E.(编辑)， Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992) ；AdvancedChromatographic and Electromigration Methods in Biosciences (生物科学中的高等色谱禾口电迁 移方法)，Deyl, Z.(编辑)，Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998) ；Chromatography Today (今曰色谱)，Poole, D. F.禾口 Poole，S. K.，Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991) ；Scopes, Protein Purification Principles and Practice (蛋白质纯化原理与实践)(1982) ；Sambrook, J.等人(编 辑)，Molecular Cloning =ALaboratory Manual (分子克隆实验室手册)，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N. Y. ,1989 ；或Gurrent Protocols inMolecular Biology (分子生物学最新方法)，Ausubel，F. Μ.等人(编辑)，JohnWiley & Sons, Inc. , New York。抗体是可以进行修饰和降解处理的生物大分子。这些可以基于酶(催化)或非酶 (非催化)处理(Perkins, Μ.等人，Pharm. Res. 17(2000) 1110—1117)。以下描述了经常出 现的非酶降解反应的实例。氨基酸的氧化
抗体的氧化相应于重链和轻链的氨基酸的共价修饰，其是由活性氧类别诱导的。 原则上，即使几乎所有氨基酸可以被氧化，但是甲硫氨酸(M)和色氨酸(W)是对氧化最敏感 的。这些氨基酸的氧化(参见

图1)是特别值得注意的，因为这出现在非常多的不同蛋白质 中，并且经常降低或消除它们的生物学活性，诱导聚集并且促进蛋白质水解(Houde，D.等 人，J. Chromatogr. A 1123(2006) 189-198)。对于氧化的类别，甲硫氨酸简单氧化成甲硫氨 酸亚砜产生质量差Am = +16Da。色氨酸通常被氧化两次，其产生质量差Am = +32Da。在 进一步的反应中，色氨酸的两次氧化形式常常重排为犬尿氨酸，产生质量差Δπι = +4Da。氨基酸的脱酰胺抗体分子中氨基酸的脱酰胺可以发生在天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)上。但是， 通常是天冬酰胺受到影响。另外，某些氨基酸序列和氨基酸组合(例如天冬酰胺和甘氨酸 (NG)、天冬酰胺和丝氨酸(NS)以及天冬酰胺和苏氨酸(NT))是特别易感的。天冬酰胺的脱 酰胺是贮存过程中生物分子降解的主要原因。折叠的完整抗体的脱酰胺最初仅在应激增高 的条件下缓慢发生。当抗体的三维结构被破坏后(例如还原和酶切割后)，脱酰胺将变得容 易，因为在这些情况中氨基酸更易与周围介质反应(图2)。天冬酰胺可以形成中间产物形 式的环状酰胺(琥珀酰亚胺)，该中间产物自发水解为比例约3 1的异天冬氨酰肽和天冬 氨酰肽的混合物(Chelius，D.等人，Anal. Chem. 77(2005)6004-6011)。该反应优选在碱性 PH值下发生。对于脱酰胺的类别，天冬酰胺脱酰胺成天冬氨酸(aspartate)和异天冬氨酸 (isoaspartate)的结果是出现质量差Am = +lDa。在分子量大于IOkDa的肽和蛋白质的 情况中，应用目前的质谱仪不可能或很难直接检测到Am =+IDa的质量差。另外，电荷分 布的变化出现更准确的电荷异质性。硫醚键的形成非还原性硫醚键的形成是在单克隆抗体，特别是亚类IgGl中经常观察到的现象。 这是基于二硫键中硫原子的丢失，二硫键将抗体的重链和轻链连接在一起或者稳定分子内 轻链和重链。抗体的这种修饰在应激增高的条件下和特别是在PH值升高的情况中容易发 生。认为该反应是 β -消除(Cohen, S. L.等人，J. Am. Chem. Soc.，129(2007)6976-6977)。 因为硫原子是在硫醚键形成过程中丢失的，所以对于非还原性修饰的抗体类别，这导致Am ="32Da的质量差。与之相反的是，该二硫键(S-S)在抗体的还原过程中被切割成两个SH 基团。因此，还原的抗体组分产生的质量差Am =-34Da。片段的形成应激诱导的断裂反应通常基于蛋白质的多肽链(例如抗体的重链和轻链)中肽键 的水解切割。蛋白质水解和肽键的水解原则上可以在所有的氨基酸之间发生，特别是如果 易于水解的其它氨基酸存在空间张力或侧链。抗体的特异性切割单克隆抗体是非常大的蛋白质，并且由于它们重链的糖结构，它们是非常不均一 的(微观不均一性)。为了检查抗体形成的降解产物和修饰物，在分析前将它们切割成更 小的片段，这是有利的。因此，作为样品制备的一部分，抗体的切割是进行分析研究的重要 方法。在大多数情况中，通过还原二硫键，简单地将抗体分解为其重链和轻链。但是除此之 外，还有用于切割抗体的其它方法。二硫键的切割
IgG分子中出现的所有二硫键可以通过还原来切割。在还原过程中获得游离的抗 体的重链和轻链。三(2-羧基乙基)_膦(TCEP)是常用的还原剂，因为抗体所有的二硫键 在短时间内完全被切割，并且还原在整个PH范围内均可发生(参见例如Hau，J.C.和Hau， C. Y.，Anal. Biochem. 220(1994)5-10)。在一个实施方案中，pH 范围从 1. 5 至 8. 5。二硫苏 糖醇(DTT)也具有快速切割二硫键的特征。但是，DTT还原在酸性环境中进行很慢。为了 完全分离重链和轻链，变性步骤通常是必要的。变性还使得二硫基更易受影响。变性可以 例如借助盐酸胍或甲酸来进行。酶切割木瓜蛋白酶(半胱氨酸蛋白酶)相对非特异地切割精氨酸(R)、赖氨酸(K)、谷 氨酸(E)、组氨酸(H)、甘氨酸(G)和酪氨酸(Y)之后的肽键。如果温育时间足够长，木瓜 蛋白酶消化导致完全水解。但是，抗体可以在它们的铰链区通过限制性蛋白水解相对特 异地被切割(Lottspeich, F.禾口 Engels， J. W. ,"Bioanalytik Spektrum Akademischer Verlag”Munich第2版(2006)201-214)。切割发生在将两条重链连接在一起的二硫键的 N-端侧。二硫键在该过程中是得到保留的，从而在消化后获得三个片段(2个Fab片段、1 个Fc片段)。两个N-端片段被称为抗原结合片段(Fab，抗原结合片段)，C-端片段被称为 结晶片段(Fe，结晶片段)。每个Fab片段包含完整的轻链和氨基-端的半个重链。Fc片段 包含两个仍然通过二硫键连接在一起的羧基_端的半个重链。IdeS 消化IdeS (化脓链球菌的免疫球蛋白G-降解酶)是细胞半胱氨酸蛋白酶，其可以从致 病菌化脓链球菌中分离。该酶直接在识别序列GPSVFLFP前高特异性切割人IgG。该序列 位于IgG铰链区的将两条重链(HC)连接在一起的二硫键的C-端侧。切割产生两条重链的 C-末端(2个HC-Fc片段)和Fab”片段，Fab”片段来自通过二硫键连接的轻链和重链的 Fab 片段的臂(图 3) (von Pavel-Rammingen, U.等人，EMBO Journal 21(2002) 1607-1615)。如果将抗体的IdeS片段在消化之后用DTT或TCEP还原，那么获得两条抗体的轻 链(2LC)和重链的N-端片段(2HC Fab)，而不是Fab”片段。重链的C-末端(HC-Fc)不受 还原的影响。去糖基化N-糖苷酶F是所谓的内切糖苷酶并且在多肽链和近端的N-乙酰基葡糖胺残基之 间完全切割糖蛋白(例如抗体的重链)的糖结构。为了简化非常复杂的质谱图，这些质谱图通常是在分析多种蛋白质和肽类组分中 通过预分离组分获得的，通常将质谱仪与液相色谱法组合(LC/MS)操作。为了这个目的，在 质谱分析之前，根据它们的组成将高效HPLC系统用于分离溶解物质的混合物。分析混合物 的色谱分离的结果是，组分在不同时间离开分离柱，并且这样可以通过质谱法按洗脱顺序 进行分析。洗脱图每个峰的质谱图是通过色谱法与质谱法联用而获得的。这样的优势在于不 会获得分析物溶液中所有组分的复杂的整体图谱，而是在理想的情况下获得分离的组分的
单一图谱。电喷雾方法(ESI)是经常应用的电离方法，用于将溶解的分子转化为质谱法中的 气体离子。这是通过将液体分散在静电场中获得的(电喷雾)。在这个过程中形成了很多细小的带电微滴，其包含分析物分子。高度带电离子的形成是ESI方法的特征。因此，在确定的蛋白质类别的质谱图中， 观察到完整系列的离子信号，根据它的分子量每个具有Δζ = 1的电荷差(通常在正电荷 模式中加上一个质子或在负电荷模式中减去一个质子)。蛋白质的图谱表现为分子离子的 近似钟形的电荷分布的特征。最大的分布取决于ESI质谱仪的参数、溶剂的ρΗ和蛋白质的 变性状态。切割二硫键后并且作为变性的结果，蛋白质变成在空间上更展开的结构，从而分 子可以接受(或释放)更多的电荷。因此，最大的电荷分布可以变成更高(更低)的电荷。多电荷分子离子的电荷的数目η和分子量(M)可以通过电荷分布中任何两个相邻 分子离子(m2 > Hi1)的测量的m/z比值(m)来计算 在该等式中，X是电荷载体的质量，即对于加上一个质子X= 1(在正电荷模式中) 和对于减去一个质子X = -1 (在负电荷模式中)。η的数值可以通过计算出变量η并且合 并式1和2来计算 分子离子的分子量可以通过计算出式2中的M并且通过应用式3中η的计算结果 来计算式4 :Μ = η (Hi1-X)谱图通过是借助计算机程序来分析的，其可以用于测量所有信号或单独选择信号 的分子量。因此获得所谓的重构，其表示对相应的分子量范围重新计算的给定的谱图(去 卷积谱)。现在分子量可以直接从计算的峰上读出。现在令人惊讶地发现用先前应用的方法出现的问题可以通过应用本发明方法来 预防。还令人惊讶地发现应用酶IdeS对实现抗体的LC/MS分析是有利的。因此，本发明的第一方面是检测样品中抗体和抗体片段以及抗体的修饰形式的方 法，其特征在于包括下列步骤a)提供包含抗体和/或其切割产物和/或抗体的修饰形式的样品，b)将a)项中提供的样品与下列物质温育，i) IgG特异性半胱氨酸蛋白酶，ii)糖苷酶，iii)还原剂，c)将b)项中温育的样品通过联用的液相色谱法和质谱法进行分析以检测a)项提 供的溶液中包含的完整的抗体和检测抗体片段。提供的样品可以例如是包含抗体的溶液，例如冻干的抗体制剂的重构溶液。修饰 的抗体分子在贮存和冻干的过程中在该溶液中形成。其中这些修饰是单个氨基酸的氧化和脱酰胺、硫醚键的形成和抗体片段的形成。本发明的方法包括将样品与不同的试剂温育。这些试剂用于将样品中包含的抗 体分子和抗体片段分子转化为确定的片段。在该方法的一个实施方案中，第一个温育步骤 是用IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶IdeS切割分子，优选来自化脓链球菌或齿垢密螺旋体的 IdeS。在进一步优选的实施方案中，IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶具有氨基酸序列SEQ ID NO :1。在一个实施方案中，与IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶的温育在pH范围从pH 5. 5至8. 5 之间进行。在一个实施方案中，温育在PH范围从pH 7.0至8.0之间。还发现IgG-特异性 半胱氨酸蛋白酶与抗体分子(包括抗体片段分子)的摩尔比应该在1 25至1 2500之 间，在优选的实施方案中，在1 25至1 100之间。在该方法的一个实施方案中，第二个温育步骤是用糖苷酶切割抗体片段的碳水 化合物。在一个实施方案中，糖苷酶选自N-糖苷酶F、内切糖苷酶F2、内切糖苷酶H、乙酰 基_神经氨酰基(neuraminyl)水解酶或0-糖肽内-D-半乳糖基-N-乙酰基半乳糖 氨基水解酶。在一个实施方案中，糖苷酶是N-糖苷酶F，也称为PNGase F。在一个实施方 案中，N-糖苷酶F衍生自脑膜炎脓毒性黄杆菌。在一个实施方案中，糖苷酶是内切糖苷酶 F2，也称为Endo F2。在另一个实施方案中，内切糖苷酶F2衍生自脑膜炎脓毒性黄杆菌或 脑膜脓毒性金黄杆菌。在另一个实施方案中，糖苷酶是内切糖苷酶H，也称为Endo H。在另 一个实施方案中，内切糖苷酶H衍生自褶皱链霉菌(Sti^ptomyces plicatus) 0在另一个 实施方案中，糖苷酶是乙酰基-神经氨酰基水解酶，也称为神经氨酸酶。在另一个实施方案 中，乙酰基-神经氨酰基水解酶衍生自产气荚膜菌。在另一个实施方案中，糖苷酶是0-糖 肽内-D-半乳糖基-N-乙酰基-a-半乳糖氨基水解酶，也称为0-糖苷酶。在一个实施方案 中，0-糖肽内-D-半乳糖基-N-乙酰基半乳糖氨基水解酶衍生自肺炎链球菌。在另一 个实施方案中，糖苷酶是EC 3. 2. 218或EC 3. 5. 1. 52或EC 3. 2. 1. 96或EC 3. 2. 1. 18或EC 3. 2. 1. 97。在进一步的实施方案中，糖苷酶具有氨基酸序列SEQ ID NO :2。首先将提供的样品与IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶温育，随后用糖苷酶处理，这是 有利的。在第三步中，将二硫键通过加入还原剂并且优选加入磷酸三氯乙酯(TCEP)来切 割。在一个实施方案中，甲酸是与还原剂同时加入的。液相色谱法和质谱法的组合用于分析获得的确定的抗体片段。单个片段是通过液 相色谱法分离的，随后可以通过质谱法测定。在一个实施方案中，质谱法是电喷雾电离_飞 行时间质谱法(ESI-TOF)。在一个实施方案中，液相色谱法是疏水相互作用色谱法或π-π 相互作用色谱法。在疏水相互作用色谱法的情况中，在一个实施方案中，色谱配体是C8或 C18配体，其位于300埃孔径的色谱材料上；或者在JI-Ji相互作用色谱法的情况中，将 二苯基配体用作色谱配体。在一个实施方案中，Jupiter C18柱或Zorbax300SB C8柱或 Pursuit 二苯基柱，在优选的实施方案中，Pursuit 二苯基柱用于液相色谱法。本发明还关注IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶在检测样品中的抗体或抗体片段中的 用途，其特征在于将样品与IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶温育，并且在与糖苷酶温育后将获 得的片段通过联用的液相色谱法和质谱法分析。本发明的另一个方面是用于检测抗体或抗体片段的试剂盒，其特征在于该试剂盒 包含
i)来自化脓链球菌的IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶IdeS，和ii)来自脑膜炎脓毒性黄杆菌的内切糖苷酶N-糖苷酶F。为了优化IdeS消化的温育条件，首先试验减小酶抗体比例和温育时间。对于实 际的原因，最短可能的温育时间和最小可能的酶抗体比例是需要的，因为消化的抗体分 析物溶液中存在的酶组分可能在获得的质谱图中引起干扰信号。为了避免这种情况，用于 抗体消化的酶的量应该尽可能少。同时必须确保抗体分子在消化后完全被切割。为了另外 获得最高可能的样品处理量和优化试验时程，应该缩短温育时间同时确保完全消化。消化 制备物的凝胶电泳分离的结果(参见图7)显示相应于IdeS切割的预期产物的两条主带 (约IOOkDa和约25kDa)在所有消化条件下都能形成。分子量约IOOkDa的更大的主带相应 于预期的抗体Fab”部分，其包含两条轻链(LC)和重链(HC)的Fab片段。分子量约25kDa 的更小的主带是预期的HC的Fc片段。消化制备物的凝胶电泳分离的结果显示酶抗体的 比例对IdeS消化具有更显著的影响。关于多种制备物的IdeS消化的效率，SDS-PAGE的结 果显示在1 50的酶抗体比例以及0.5小时和1小时的温育时间下仍然出现极小强度 的完整抗体(2HCV2LC)的带(参见图7A，泳道6和9)。在相同的酶抗体比例以及2小时 和5小时的温育时间下(参见图7B，泳道6和9)，完整抗体分子的带已经消失。因此优选 的温育时间是在2小时至5小时之间，并且特别优选2小时。结果还显示18小时的温育时 间和1 50、1 500,1 2500,1 10000的酶抗体比例与在相同酶抗体比例下5小 时的温育相比没有差异。因此优选1 25至1 100的酶抗体比例。特别优选1 50 的酶抗体比例。基于LC/MS的方法包括样品制备方法，该方法特别适于分离和检测应激诱导的降 解产物。原则上存在四种可能的样品制备变通实施方案1.仅还原抗体；2.去糖基化，随后还原抗体；3. IdeS消化，随后还原抗体；4.去糖基化，随后IdeS消化和还原抗体。结果表明仅还原抗体的制备(变通实施方案1)和IdeS消化并且还原的抗体的 制备(变通实施方案3)不适合抗体溶液的LC/MS分析，因为重链的糖结构而获得异质 (heterogeneous)的图谱，这降低了 LC/MS测量的灵敏度并且使得分析更加困难。令人惊讶地发现IdeS-消化、去糖基、还原的样品制备优于去糖基、还原的样品制 备，因为获得了更小的抗体片段，这些更小的抗体片段对LC/MS测量的质量分辨率具有正 面影响，并且允许另外存在位于并归属为抗体的HC-Fc或HC-Fab部分的修饰。另外，由于 重链的切割，可能放大应激诱导的修饰的作用，这可能发生在片段的色谱行为上，以便改善 它们彼此的分离。同时应用两种酶IdeS和N-糖苷酶F不会产生任何问题。由于实际原因，首先用IdeS消化抗体，然后去糖基化，这是特别有利的。由于实际 原因，以该方式改变方法并且对分析结果没有显著影响。在加入TCEP溶液的同时加入甲 酸，即甲酸和TCEP溶液均是在温育前加入的，因此两种组分存在于单个温育过程中。为了明确并且简单地检测和定量形成的抗体溶液的降解产物，分离各自的降解类 别是有利的。分析物溶液的分离质量特别受到固定相色谱性能的显著影响。色谱分离的质 量是根据各自柱子的峰分辨率和峰锐度来评估的。
当选择柱时，为了分离，除了柱基质的极性之外其它重要参数必需考虑，例如粒度 应当尽可能小，以获得最高可能的塔板数。另外，应当记住的是，抗体是非常大的分子。因 此，当选择适合的柱时，基质颗粒的孔径也发挥决定性作用。基质颗粒的孔越大，越易于抗 体组分扩散到孔里，从而改善分离。与用作参比柱的Jupiter C18柱相比，在所用的色谱条件下，应用Vydac C4柱没 有获得降解产物有效的分离改善。与Jupiter C18柱相比，Zorbax 300SB C8具有不同的 色谱选择性，同时对于分离多种抗体片段获得较好的结果。相反，Pursuit 二苯基柱表现出 改善的分离结果。与JupiterClS柱的分离图相比，该柱的分离图显示出更多的峰和肩峰， 这些峰在洗脱图中具有良好的分辨率和可接受的峰锐度。因此，该柱优选用于分离根据本 发明方法获得的抗体的降解产物。通过下列实施例、文献参考和图进一步说明本发明。实际的保护范围来自本发明 附属的权利要求。本发明是通过下列基于抗体实例(mAb IGF-1R)的实施例来描述的。这不构成本 发明的限制，而仅旨在说明。 抗体(优选单克隆抗体)的实例是抗IGF-I受体的抗体(mAb IGF-1R)，例如 WO 02/053596、WO 2004/071529、WO 2005/016967W0 2006/008639、US 2005/0249730、 US 2005/0084906、WO 2005/058967、WO 2006/013472、WO 2006/00181、US 2003/0165502、 WO 2005/082415、WO 2005/016970、WO 03/106621、WO 04/083248、WO 2003/100008、WO 2004/087756、WO 2005/005635、WO 2005/094376 和 WO 2007/115814 中所描述的。附图描述图1 作为实例的甲硫氨酸(a)和色氨酸(b)的氧化反应(参见例如Taylor，S.等 人，J. Biol. Chem. 278 (2003) 19587-19590)。图2 天冬酰胺的脱酰胺并且异构化为天冬氨酸；在碱性条件下(pH > 8)优选途 径I，在酸性条件下(PH < 5)优选途径II。图3 =IgGl抗体的IdeS消化的示意图。图4 在40°C下温育并且在-80°C下贮存的抗体的凝胶电泳分离结果泳道1-样品缓冲液；泳道2-分子量标准；泳道3-样品缓冲液；泳道4-未还原的标准；泳道5-未还原的抗体(_80°C )；泳道6-未还原的抗体(30天/40°C )；泳道7-样品缓冲液；泳道8-还原的标准；泳道9-还原的抗体(-80 V )；泳道10-还原的抗体(30天/40°C )；泳道11-样品缓冲液；泳道12-样品缓冲液。图5 应激的抗体(1 :40°C,30天)和未应激的抗体(2 :-80°C )以及在40°C下温
12育的安慰剂缓冲液(3)叠加的SEC色谱图。图6 应激的抗体(1 :40°c,30天)和未应激的抗体(2 :-80°C )溶液以及在40°C 下温育的安慰剂缓冲液(3)的离子交换色谱法的色谱图。图7 在多种酶与抗体比例(1 50-1 1250)和多种温育时间(0.5小时-5小 时)下IdeS消化的抗体的分离泳道编号-凝胶A-凝胶B 1-样品缓冲液-样品缓冲液；2"分子量标准-分子量标准；3-标准-标准；4-未消化的抗体_未消化的抗体；5-样品缓冲液-样品缓冲液；6-1:50,0. 5 小时-1:50，2. 0 小时；7-1:125，0. 5 小时-1:125，2. 0 小时；8-1:1250，0. 5 小时-1:1250，2. 0 小时；9-1:50，1.0 小时-1:120，5.0 小时；10-1:125，1.0 小时-1:125，5.0 小时；11-1:1250，1.0 小时-1:1250，5.0 小时；12-样品缓冲液-样品缓冲液。图8 应激的抗体和未应激的抗体在Jupiter C18标准柱(A)和Pursuit 二苯基 柱(B)上的叠加洗脱图。图9 应激的抗体(1)和未应激的抗体(2)在Pursuit 二苯基柱上的叠加洗脱图。实施例1材料与方法本研究中用于试验的抗体是IgGl型人重组抗体。该抗体在CHO细胞中表达并且 通过亲和色谱法和多种离子交换色谱法步骤纯化。热应激将约22mg的IgGl抗体通过在IOmM Tris/HCl缓冲液(pH 8. 5)中透析来更换缓 冲液。将一部分更换缓冲液的抗体溶液在40°C下温育30天。将其它部分冻存在-80°C下 作为对照。透析为了透析，将1. 5mL抗体溶液(c = 14. 6mg/mL)转移至slide A-Lyzer透析盒(容 量0.5-3mL，分子量排阻大小10kDa)并且悬挂在透析缓冲液中。透析过程中连续搅拌缓 冲液并且保持在约8°C下。为了确保最完全可能的缓冲液交换，在透析过程中数次更新透析 缓冲液。表1显示更换缓冲液的时间表。表1 更换抗体溶液的缓冲液的透析表
13 完全透析后，将抗体溶液从slide A-Lyzer透析盒转移至5mL反应容器中。透析 的抗体溶液的体积通过在分析天平(AT261 Delta Range,Mettler-Toledo)上称重来测量。灭菌过滤透析后，将抗体溶液在低微生物水平条件下经Minisart单个注射器式滤器 (0.2 μ m，Sartorius)过滤灭菌。测定样品浓度的取样页在低微生物水平条件下进行。抗体浓度的测定抗体浓度通过在Uvikon XL型分光光度计(Goebel Company)上测量280nm处的 吸收来测定。所用的抗体的消光系数是1. 55mL · mg-1 · cnT1并且是根据Pace，C. N.等人 (Protein Sci. 4 (1995) 2411-2423)的方法来计算的。SDS-PAGE抗体溶液通过凝胶电泳分离，应用Power Ease 300电泳仪和InvitrogenCompany 的凝胶、缓冲液和其它试剂。将Tris-甘氨酸4-20%梯度凝胶用于分离。将Tris-甘氨酸 SDS运行缓冲液(IOX)用作运行缓冲液，应用前将其用二次蒸馏水按1 10(v/v)稀释。将已经在40°C下温育和在-80°C下贮存的抗体溶液在还原和未还原的条件下应 用。为了测定待测样品的相对分子量，将5yL的Mark 12 蛋白质标志物也应用于凝胶中 作为参考。电泳分离在125V电压下进行并且运行时间约95分钟。凝胶电泳后，根据供应 商的说明将凝胶在Simply BlueSafe Stain (考马斯G 250染色液)中染色。随后，将凝胶 在二次蒸馏水中脱色。将染色的凝胶用Dry-Ease微型玻璃纸和干燥溶液(10%甘油(ν/ν)、40%甲醇(ν/ ν)、10%乙酸(ν/ν)、40%水(ν/ν))保存。为了这个目的，将凝胶在干燥溶液中温育5分钟， 并且加入两张玻璃纸后再温育10分钟。然后将除去气泡的凝胶放置在玻璃纸之间并且在 固夹框中干燥。对于未还原SDS-PAGE，将抗体溶液用IOmM Tris/HCl缓冲液(pH 8. 5)稀释至浓度 约Img · mL—1。随后，将10 μ L(相应于10 μ g抗体)的稀释的抗体溶液与10 μ L的SDS样 品缓冲液(2Χ)以1 2(ν/ν)的比例混合，混合并且最后短暂离心。将样品在70°C下变性 10分钟。然后将它们再次短暂离心。为了电泳分离，将16yL(相应于Syg抗体)的变性 的样品应用于凝胶中。除了蛋白质标志物之外，应用稀释至浓度Img ^r1并且随后用与抗 体样品相同的方法处理的抗体参考标准品(c = 16. 5mg · mL-1)作为参考。对于还原SDS-PAGE，也将抗体溶液用IOmM Tris/HCl缓冲液(pH 8. 5)稀释至浓 度lmg·!!^1。DTT(二硫苏糖醇)用于还原溶液。为了确保抗体的完全还原，将DTT溶液 以IOOmM的浓度配制在SDS样品缓冲液(2 X)中。随后将10 μ L (相应于IOyg抗体)的 稀释的溶液与IOyL 2 X SDS样品缓冲液+IOOmM DTTWl 2 (ν/ν)的比例混合，混合并且短暂离心。将样品在70°C下变性10分钟。然后将它们再次短暂离心。为了电泳分离， 将16yL(相应于Syg抗体)的变性的样品应用于凝胶中。除了蛋白质标志物之外，应 用稀释至浓度Img · mL-1并且随后用与抗体样品相同的方法处理的抗体参考标准品(c = 16. 5mg · ι Γ1)作为参考。尺寸排阻色谱法(SEC)根据组分的大小将Tosoh Bioscience Company的TSK凝胶G3000SWXL凝胶过滤 柱(7. 8 X 300mm ;5 μ m，250人)用于色谱分离抗体溶液的组分。分离在Shimadzu-HPLC系 统上进行。将样品组分用200mM磷酸钾、250mM氯化钾缓冲液(pH 7. 0)以0. 5mL · mirT1的 流速并且历经30分钟等度洗脱。将TSK凝胶G3000 SWXL凝胶过滤柱的温度在分离过程中 维持在25°C不变。自动进样器的温度是6°C。将样品组分在280nm波长下用二极管阵列检 测器检测。离子交换色谱法(IEC)将Agilent Company 的弱阳离子交换柱 SynChropak WCX(4. 6X 250mm，6 μ m, 300 Α )用于离子色谱分离抗体溶液的组分。分离在ShimadzuHPLC系统上进行。将样品组 分通过洗脱液A (IOmM磷酸钠缓冲液，pH 7.0)和洗脱液B (IOmM磷酸钠缓冲液，750mM氯化 钠缓冲液，PH 7. 0)的二元梯度系统在ImL · mirT1的流速并且55分钟的运行时间下洗脱。 洗脱分布如表2所示。将SynChropak WCX阳离子交换柱的温度在分离过程中维持在25°C 不变。自动进样器的温度是6°C。将样品组分在280nm波长下用二极管阵列检测器检测。Ml 通过IEC分离抗体溶液的梯度分布 实施例2热应激为了加速单克隆抗体的降解产物和修饰物的形成，将其在温育器(Venticell， MM-Medcenter)中进行规定的热应激。对于温育，将透析的抗体溶液在40°C下温育30天。 另外，将250 μ L的抗体溶液分成10 μ L等份并且在-80°C下贮存。这些用作零点对照。
30天后，将进行热应激的各等份从温育器中取出并且目测微生物感染。将取出的 各等份倾倒入在反应容器中，以获得均勻的应激的分析溶液。均一化通过仔细混合抗体溶 液来进行(MS2微型混合器，IKA, Staufen)。将均勻的抗体溶液分成20 μ L等份并且在_80°C 下贮存。为了液相色谱法和质谱法分析，将约22mg抗体(c = 14. 6mg -πιΓ1)在IOmM Tris/ HCl缓冲液(ρΗ 8. 5)中更换缓冲液并且随后在40°C下温育30天。热温育的安慰剂缓冲液的制备为了在随后分析中确定因在40°C下贮存引起的抗体溶液观察到的变化不是归因 于缓冲液的变化，将两个15mL等份的IOmM Tris/HCl缓冲液在低微生物水平条件下通过过 滤灭菌，并且也在40°C的温育器(Venticell,MM-Medcenter)中温育30天。随后的操作如 抗体溶液那样进行。热温育溶液的凝胶电泳分析在40°C下温育并且在-80°C下贮存的抗体的凝胶电泳分离结果如图4中所示。在 40°C下温育导致聚集物和抗体分子片段的形成(泳道6和10)。未温育的抗体样品在非还 原条件下表现出典型的IgGl分子带型(参见泳道4和5)。主带相应于包含两条重链(HC) 和两条轻链(LC)的完整抗体。对于没有完全保持结构的抗体类别，还能观察到其它条带。 这些条带是缺乏轻链的2HC/LC类别、半抗体(HC/LC)、游离的重链(HC)和游离的轻链(LC) (参见泳道4和5)。该典型的带型还主要出现在40°C下温育的非还原的抗体样品中(参见泳道6)。主 带也是完整抗体(2HC/2LC)。在比-80°C下贮存的抗体样品更高的强度下，其它条带还出现 在多种非完整抗体类别中(2HC/LC、HC/LC、HC、LC)。在应激的样品中还形成范围从约90kDa 至> 200kDa的其它条带(参见泳道6)。低于主带出现的类别是抗体片段，并且高于主带的 那些是聚集物。对于LC/MS分析特别有意义的两条带出现在约21kDa区域(参见泳道6)。这是非 共价的Fab片段，其中HC Fab片段(AA 1_220)和LC不是通过二硫键连接在一起的，而是 通过非共价相互作用(离子相互作用、氢键、偶极_偶极相互作用、范德华力)连接在一起。 由于样品是在变性条件下应用于凝胶的，HC Fab和LC在凝胶中以单带出现(参见泳道6)。 在该组合中，凝胶中较高带是LC (LCf)并且较低带是HC Fab片段(Cohen，S. L.等人，J. Am. Chem. Soc. ,129(2007)6976-6977)。包含第二个Fab片段和Fc片段的残留的抗体可以归属 为在97kDa和116kDa区域中弱强度出现的条带(参见泳道6)。在还原条件下分离的主带是重链(HC)和轻链(LC)(参见泳道8、9和10)。除了两 条主带之外，在未应激的抗体样品中，在范围约97kDa和120kDa之间出现较低强度的两条 其它条带。这些是共价、未还原的聚集物(参见泳道8和9)。在40°C下温育的抗体溶液显示出与未温育的抗体溶液相同的带型(参见泳道 10)。在未应激的样品的情况中归属为未还原的类别的两条带在应激的样品中没有出现非 常高的强度(参见泳道10)。在应激的抗体溶液中，除了已经提到的类别(HC、LC和两条共 价、未还原的条带)之外，在约30kDa至200kDa范围内出现大量的其它条带。这些是还原 的共价聚集物、未还原的类别和还原类别的片段(参见泳道10)。在凝胶约90kDa至95kDa处出现并且可以归属为半抗体的未还原的聚集物类别的条带对于LC/MS分析是特别有意义。温育的结果是该条带的强度显著增加。该条带强度增 加最可能是由于硫醚类别的形成。该类别是实际质量75kDa的半抗体分子，它的HC和LC 不是通过二硫键连接在一起的，而是通过未还原的硫醚键连接的(Tous，G. I.等人，Anal. Chem. 77(2005)2675-2682)。热温育溶液的SEC分析尺寸排阻色谱法(SEC)给出了应激诱导的片段和聚集物形成的概观。由于SEC是 在天然条件下进行的，在分析中检测共价以及非共价聚集物。为了建立降解产物的形成和 在40°C下温育之间的关系，除了应激抗体溶液之外，还分析在-80°C下贮存的未应激样品。图5显示了在40°C下温育的安慰剂缓冲液、在40°C下温育的抗体和在_80°C下贮 存的抗体的SEC结果。在每种情况中，将50yL或50yg抗体用于分析。分子量标准的分 析结果作为测定抗体溶液组分的分子量大小的参考。它们列于表4中。表3显示了洗脱图 中多种抗体类别的百分数。计算的百分数是基于某个类别的不同峰面积占出现的所有峰的 面积总和的比例。表3 应激和未应激抗体的SEC评价 表4分子量t示准的SEC卢Λ普分离结果 应激抗体类别的洗脱图与SDS-PAGE的结果相关。SEC的结果也显示聚集物已经形 成并且抗体在温育过程中已经降解(参见图5)。保留时间约15-16. 5分钟的主要类别(其可以归属为完整的抗体)在40°C下温 育过程中从占总面积的约96%减少至72% (参见表3)。根据分子量标准，主要类别的保
17留时间(RT 15-16. 5分钟)相应于分子量约150kDa(参见表4)。分子量> 158kDa的聚集 物(参见表4)在约12-14. 5分钟的时间窗口中洗脱。在40°C下温育的结果是，具有该洗脱 时间的峰从占总面积的约3%增加至约12% (参见表3)。明显的肩峰在应激抗体洗脱图 的主要类别峰的减少区域(RT约16. 5-18分钟)中形成，其具有约11%的面积比例并且其 在-80°C下贮存的抗体溶液中不会出现这种情况(参见图5)。在肩峰区域洗脱的抗体类别 具有分子量约70kDa至120kDa(参见表4)。这些是例如半抗体(HC/LC)、失去轻链的抗体 (2HC/LC)和Fab+Fc片段的类别。在保留时间约19-20分钟处还看到另一个峰，其可以归属 为分子量在约20kDa至40kDa之间(参见表4)。非共价Fab片段的重链(HC)和轻链(LC) 以及HCFab在这个时间窗口内洗脱。在40°C下温育的结果是，该峰从占总面积的约增 加至5% (参见表3)。在40°C下温育的安慰剂缓冲液与在40°C下温育的抗体溶液的洗脱图的比较表明 缓冲液的温育没有出现峰。热温育溶液的IEC分析离子交换色谱法(IEC)适用于检测由于抗体分子的修饰引起的电荷变化。为了能够鉴定抗体中应激相关的变化，除了在40°C下温育的抗体之外，还应用 在_80°C下贮存的未应激的抗体。图6表示在40°C下温育的应激和未应激抗体溶液以及安慰剂缓冲液的离子交换 色谱法中获得的色谱图。在每种情况中将50yL或25yg抗体用于分析。洗脱图中多种类 别的百分数显示在表5中。计算的百分数表示某个类别的不同峰面积占出现的所有峰的面 积总和的比例。 表5 应激和未应激抗体的IEC评价
在-80°C下贮存的抗体与在40°C下温育的抗体的洗脱图的比较表明电荷显著位 移至酸性范围是由温育诱导的(参见图6)。因此主要类别(保留时间RT约22-25分钟，其 可以归属为完整抗体)的峰强度从占总面积的约61%显著地减少至约40% (参见表5)，然 而洗脱图中酸性范围(RT 12-18分钟)的峰强度显著增加(从占总面积的约8%增加至约 44%)。在未应激抗体样品的碱性范围(RT 26-32分钟)内看到的肩峰在40°C温育的过程 中完全消失(参见图6)。相反，在应激抗体溶液的情况中，主峰(RT 19-22分钟)酸性部 分的肩峰强度增加。在该情况中，面积从占总面积的约5%增加至约17% (参见表5)。在 40°C下温育的安慰剂缓冲液与在40°C下温育的抗体溶液的洗脱图的比较表明缓冲液的温 育没有出现峰。抗体温育诱导的电荷位移至酸性范围通常主要是由于脱酰胺反应。在脱酰胺中，
18氨基被羟基代替，而羟基将额外的负电荷引入至分子中。IEC色谱图的结果表明由于在 40 V下温育，脱酰胺和其它的电荷变化高度发生。实施例3IdeS消化的优化酶IdeS以lmg/mL的浓度存在于50mM Tris/HCl缓冲液(pH 8. 0)中。制备包含 三个不同IdeS浓度的稀释系列，用于将酶加入至消化溶液中。预稀释液(V)中IdeS的终 浓度是 0. Img · mL—1 (Vl)、0. Olmg · mL—1 (V2)和 0. OOlmg · mL—1 (V3)。稀释应用 50mM Tris/ HCl缓冲液(pH 8. 0)实现。待分析的抗体是以15. 5mg/mL的浓度存在于组氨酸-缓冲液，pH 6. 0中。将抗体 溶液用50mM Tris/HCl缓冲液(pH 8. 0)稀释至浓度为c = 5mg · mL—1，用于加入至消化溶 液中。制备消化溶液的吸量流程在表6中列出。制备IdeS消化溶液的吸量流程 将制备的消化溶液在37°C下温育0. 5,1. 0,2. 0和5. 0小时。制备没有加入酶的抗 体溶液，作为零对照。对于对照溶液，将10 μ L (50 μ g)抗体通过移液管加入至40 μ L 50mM Tris/HCl缓冲液(pH 8. 0)中。温育在37°C下进行5. 0小时。另外，将抗体参考标准溶液(抗体在20mM组氨酸、240mM海藻糖、0. 02%吐温20， pH = 6. 0，c = 16. 5mg .mL-1)用 50mM Tris/HCl 缓冲液(pH 8. 0)稀释至浓度为 Img ·πι Λ 作为另一个对照。参考标准溶液没有先前的温育而应用。多种抗体消化溶液是在非还原条件下应用的。实施例4不同样品制备方法的比较仅还原将43 μ g浓度为c = Img · mL—1的抗体用0. 43M磷酸三氯乙酯(0. 5M，在H2O中) 还原。为了这个目的，将38μ L TCEP溶液(0. 511，在吐0中)加入至51^未应激的抗体溶液 (c = 8. 55mg · πιΓ1)中并且在37°C下温育30分钟。随后将抗体溶液用甲酸(1%，ν/ν)以 1 2 (ν/ν)的比例稀释。用甲酸稀释后，抗体的浓度是Ο.δπ^·!!^1。甲酸的比例是0.5% (ν/ν)。将获得的溶液以13，400rpm离心(Minispin, Eppendorf) 2分钟。将上清液用移液 管小心取出并且转移至分析管中。在LC/MS试验中，将4yL(2yg)抗体应用至柱中。IdeS消化和还原
用IdeS消化是通过与43 μ g浓度为c = Img -πιΓ1的抗体温育来实现的。为了这 个目的，将5 μ L未应激的抗体溶液(c = 8. 55mg Γ1)用34 μ L 50mMTris/HCl缓冲液(pH 8. 0)稀释，加入 4μ L IdeS 溶液(0. 25mg · ml/1，在 50mMTris/HCl 缓冲液(pH 8. 0)中)并 且将其在37°C下温育2小时。然后将其以0. 5mg · mL—1的浓度用0. 25M TCEP(0. 5皿，在H2O 中)还原。为了这个目的，将35 μ L消化的抗体溶液(c = Img · πιΓ1)加入至35 μ L TCEP 溶液(0. 511，在H2O中)中并且在37°C下温育30分钟。随后将抗体溶液用甲酸(1%，ν/ν) 以1 2 (ν/ν)的比例稀释。用甲酸稀释后，抗体的浓度是OJSmg·!!^1。甲酸的比例是 0.5%。将获得的抗体溶液以13，400rpm离心(Minispin，Eppendorf) 2分钟。将上清液用 移液管小心取出并且转移至分析管中。在LC/MS试验中，将8yL(2yg)抗体应用至柱中。实施例5LC-MS分析方法为了 LC/MS分析表征抗体的降解产物，首先将抗体用IdeS消化，然后去糖基，随后 还原。IdeS 消化为了用IdeS消化，在每种情况中将4 μ L IdeS溶液(c = 0. 25mg · ι Γ1，在50mM Tris/HCl缓冲液中，pH 8. 0)加入至7. 9 μ L应激的抗体(c = 6. 26mg · ml/1)和5. 8 μ L未 应激的抗体(c = 8. 55mg -πιΓ1)中。将该溶液用50mMTris/HCl缓冲液(pH 8. 0)稀释至抗 体浓度为Img · mL—1，并且在37°C下温育2小时。酶抗体比例是1 50。用N-糖苷酶F去糖基化抗体重链的糖结构是用酶N-糖苷酶F切割的。N-糖苷键合的糖是在IdeS消化 后通过以在50mM Tris/HCl缓冲液(pH 8. 0)中的0. 5mg -πιΓ1的抗体浓度温育切割的。切 割是通过加入0. 5 μ L(活性10U · mLlN-糖苷酶F来启动的。温育是在37°C下进行4小 时。还原_实施例1还原是在IdeS消化和去糖基化后通过加入60 μ L TCEP (磷酸三氯乙酯；0. 5Μ，在 H2O中)实现的。随后将混合物用甲酸(1%，ν/ν)以1 2(ν/ν)的比例稀释，从而获得浓 度为0. 16mg · ml/1的抗体在还原溶液中。TCEP的浓度是0. 1M，溶液中甲酸的比例是0. 5% (w/v) 0温育是在甲酸和TCEP的存在下、在37°C下进行30分钟。随后将获得的抗体溶液 以13400rpm离心(Minispin，Eppendorf) 2分钟。将上清液用移液管小心取出并且转移至 分析管中。在LC/MS试验中将13yL(2yg)抗体应用至柱中(图8)。还原_实施例2还原是在IdeS消化和去糖基化后通过加入60 μ L TCEP (磷酸三氯乙酯；0. 5Μ，在 H2O中)实现的。随后将混合物用甲酸(1%，ν/ν)以1 2(ν/ν)的比例稀释，从而获得浓 度为0. 16mg · ml/1的抗体在还原溶液中。TCEP的浓度是0. 1M，溶液中甲酸的比例是0. 5% (w/v) 0温育是在甲酸和TCEP的存在下、在70°C下进行10分钟。随后将获得的抗体溶液 以13400rpm离心(Minispin，Eppendorf) 2分钟。将上清液用移液管小心取出并且转移至 分析管中。在LC/MS试验中将13yL(2yg)抗体应用至柱中(图9)。RP-HPLC 分离方法制备物的RP分离是在安装有微脱气装置、毛细管泵、带温控单元的微自动进样器、柱温箱和多波长检测器的Agilent 1100 Cap-LC系统(Agilent，ffaldbronn)上实现 的。将3. 5 μ m粒度、300人孔径并且具有直径1. OX250mm的Jupiter C18柱(Phenomenex， Aschaffenburg)用于标准分离，其表示参考点。色谱分离是在75°C下并且以40 μ L · mirT1 的流速进行的。对于每个制备物，将2yg抗体应用至柱中。将样品组分用二元梯度洗脱， 二元梯度是将洗脱液A(0.5%甲酸，在吐0中(ν/ν))和洗脱液Β(70% 2-丙醇、20%乙腈、 9. 5% H2O和0.5%甲酸(ν/ν)) —起混合的。表7显示了洗脱所用的梯度分布。
^IjRP分离的梯度分布 将洗脱的样品组分用UV-检测器在波长280nm处检测。对于在线TOF质量分析， 将HPLC系统与micromass LCT质谱仪(Waters，Eschborn)联用。空白值通过注射IOyL 洗脱液A来记录。质谱分析LC分离的洗脱物的在线ESI-TOF质谱分析是在安装有电喷雾源的micromass LCT 质谱仪(Waters，Eschborn)上实现的。数据是在600-2000amu(原子质量单位)质量范围 内、在正离子模式(ES+)下、在80°C的锥孔温度和100°C的脱溶剂温度下记录的。毛细管电 压是3000V，锥孔电压是30V，RF透镜电压是400V并且提取锥孔电压是IV。ESI-TOF质量 分析的其它参数设置归纳在表8中。表8 =LCT质谱仪的参数设置 单点校正(LTeff测定)是应用在50 %乙腈中的0. 085% H3PO4进行的，将其借助 Hamilton泵(泵11，Harvard Apparatus)以5μ L ^mirT1的流速进入质谱仪。质量准确度 是 lOOppm。数据是借助Mass Lynx 4. 0数据记录软件来评价的。实施例6Pursuit 二苯基柱的质谱图与Tupiter C18的质谱图的比较如Jupiter C18柱，Pursuit 二苯基柱仅能部分分离氧化的HC-Fc类别(23778Da)， 在峰1的前肩峰中(参见图8)。对于抗体轻链的焦谷氨酸类别，也没有获得分离改善。在 Jupiter C18柱和Pursuit 二苯基柱中，其在具有相当分辨率的峰3a中洗脱。HC-Fab片 段(氨基酸(AA) 1-220)在两种柱子中、在洗脱图的最后一个峰中还与完整的HC-Fab类别 同时洗脱。因此在应用Pursuit 二苯基柱的分离中，以分开的峰分离该片段也是不可能的。 Jupiter C18和Pursuit 二苯基柱的质量图的比较还表明Pursuit 二苯基柱的峰3b的质 量与Jupiter C18柱的峰4相关。两个峰均显示33630Da的质量，其可以归属为IdeS酶。 另外，Pursuit DP柱的峰5与Jupiter C18柱的峰5相关。在两种情况中均出现了包含硫 醚的HC-Fab-LC复合物的质量(48918Da)、不完全还原的HC-Fab片段的质量(25377Da)和 N-糖苷酶F的质量(34783Da)。相反，Pursuit 二苯基柱的峰4不与Jupiter C18柱的任何峰相关，并且因此，对 于Jupiter C18柱的洗脱图这构成一个差异。该峰显示质量48916Da，其可以归属为硫醚类 别并且质量49118Da。该质量相应于抗体重链的分子量。因此，质量49118Da表示完整的、 未被IdeS切割的抗体重链，其已经在样品制备过程中通过还原从残留抗体分子中分离。两种柱子洗脱图比较中的差异还见于峰Ia的情况中，该峰在JupiterClS柱的洗 脱图中是检测不到的。质量20037Da的类别在Pursuit 二苯基柱的峰Ia中被分离。将其 归属为HC片段是合理的，其是由于271位天冬氨酸(D271)和272位脯氨酸(P272)之间
22的Asp-Pro切割形成的。Asp-Pro切割的C-端片段的理论质量值是20033Da。由于该质 量出现在应激和未应激的抗体的质谱图中，因此该切割产物不是在40°C下温育获得的降解 产物。尽管该片段明确地不是由40°C温育形成的，然而其是抗体的降解产物，其仅能通过 Pursuit 二苯基柱分离。在Jupiter C18柱的情况中，该片段与氧化的类别一起出现在峰1 的肩峰中，这表明Pursuit 二苯基柱具有更好的分离行为。 Pursuit 二苯基柱和Jupiter C18柱之间的比较表明Pursuit 二苯基柱在特定方 面比Jupiter C18柱具有更好的分离性质(参见峰Ia和峰4)，并且在其它方面具有相当的 结果。因此，有效地改善抗体类别的分离是可能的。
2权利要求
检测样品中的抗体和抗体片段的方法，其特征在于包括下列步骤a)提供包含抗体和/或抗体片段的样品，b)将a)项中提供的样品与下列物质温育i)IgG 特异性半胱氨酸蛋白酶，ii)糖苷酶，和iii)还原剂，c)将b)项中温育的样品通过联用的液相色谱法和质谱法分析以检测a)项提供的样品中包含的完整的抗体和/或检测抗体片段。
2.权利要求1的方法，其特征在于IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶是IdeS。
3.权利要求1的方法，其特征在于IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶具有氨基酸序列SEQID NO :1。
4.上述权利要求中任意一项的方法，其特征在于用IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶的温 育在PH范围为pH 5. 5至8. 5之间进行。
5.权利要求4的方法，其特征在于pH范围为pH6. 5至8. 5之间。
6.权利要求5的方法，其特征在于pH范围为7.0至8. 0之间。
7.上述权利要求中任意一项的方法，其特征在于IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶与样品 中包含的抗体和/或抗体片段的摩尔比为1 25至1 2500之间。
8.权利要求7的方法，其特征在于摩尔比为1 25至1 100之间。
9.上述权利要求中任意一项的方法，其特征在于糖苷酶是N-糖苷酶F或EndoF2或 Endo H或神经氨酸酶或0-糖苷酶。
10.权利要求9的方法，其特征在于糖苷酶是N-糖苷酶F。
11.权利要求10的方法，其特征在于N-糖苷酶F衍生自脑膜炎脓毒性黄杆菌。
12.权利要求1至8中任意一项的方法，其特征在于糖苷酶具有氨基酸序列SEQID NO2。
13.上述权利要求中任意一项的方法，其特征在于步骤b)-i)、b)-ii)和b)-iii)的温 育是连续地。
14.上述权利要求中任意一项的方法，其特征在于步骤b)-iii)是 iii)还原剂和甲酸。
15.上述权利要求中任意一项的方法，其特征在于还原剂是磷酸三氯乙酯。
16.上述权利要求中任意一项的方法，其特征在于液相色谱法是反相液相色谱法。
17.权利要求16的方法，其特征在于反相色谱法应用具有C8或C18残基的色谱材料。
18.权利要求1至14中任意一项的方法，其特征在于液相色谱法是疏水相互作用色谱法。
19.权利要求18的方法，其特征在于疏水相互作用色谱法应用具有二苯基残基的色谱 材料。
20.来自化脓链球菌的IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶IdeS在检测样品中的抗体或抗体 片段中的用途，其特征在于将样品与IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶温育，在与来自脑膜炎脓 毒性黄杆菌的N-糖苷酶F温育后，将获得的片段通过联用的液相色谱法和质谱法分析。
21.用于检测抗体或抗体片段的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含i)来自化脓链球菌的IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶IdeS，和 )来自脑膜炎脓毒性黄杆菌的糖苷酶N-糖苷酶F。
22.检测样品中修饰的抗体形式的方法，其特征在于该方法包括下列步骤a)提供包含抗体和/或其切割产物的样品，b)将a)项中提供的样品与下列物质温育 i) IgG-特异性半胱氨酸蛋白酶， )糖苷酶， iii)还原剂，c)将b)项中温育的样品通过疏水相互作用色谱法分析，从而检测样品中修饰的抗体 形式。
全文摘要
抗体是生物学大分子，其可能进行修饰和降解过程。本申请中描述了新的基于LC/MS的方法，该方法用于分离和表征抗体特异性降解产物，其包括酶消化步骤以应用IdeS酶切割重链。
文档编号G01N33/68GK101903401SQ200880122074
公开日2010年12月1日 申请日期2008年12月18日 优先权日2007年12月21日
发明者B·埃泽尔, H·科尔, J·T·雷古拉, P·松德尔曼 申请人:罗切格利卡特公司