人7型腺病毒的中和性单克隆抗体及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备人7型腺病毒的中和性单克隆抗体的方法，将人3型腺病毒载体的六邻体第5高变区替换为所述人7型腺病毒的六邻体第5高变区基因，构建成嵌合病毒，将所述嵌合病毒作为所述免疫原。还提供了一种利用上述方法制备得到的鼠源人7型腺病毒中和性单克隆抗体和杂交瘤细胞株5MH5/3G5。还提供了利用上述方法制备得到的人源化和嵌合的单克隆抗体，以及一种药物组合物，包含上述人源化或人-鼠嵌合的单克隆抗体作为有效成分。本发明将外源中和表位嵌入3型腺病毒载体的高变区内，构建成展示外源中和表位的重组腺病毒，并以此为免疫原，能有效的展示外源中和表位，并增强免疫应答效应，对研制感染性疾病治疗性单抗具有重要意义。
【专利说明】人7型腺病毒的中和性单克隆抗体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于单克隆抗体制备【技术领域】，具体涉及人7型腺病毒的中和性单克隆抗 体及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 应用表位肽免疫来制备单克隆抗体，特别是治疗性单克隆抗体，是很有吸引力的 途径。表位肽代表着蛋白质抗原最小的免疫原性单位。因此表位肽免疫能使免疫反应精确 定位，能很好的控制产生所需的免疫应答。然而，应用表位肽免疫来制备单克隆抗体通常阳 性率很低。因为简单肽通常免疫原性差，不能呈现良好的空间构象，而且不能有效激活T细 胞和免疫记忆细胞。正因为如此，很多改善表位肽免疫原性的方法被开发出来，例如联合合 适佐剂应用、偶联脂肽应用、直接呈递至树突状细胞和应用微粒呈递系统。然而，由于应用 的成分过于单一、未能从根本上改善抗原的免疫原性等原因，这些方法呈递或展示表位肽 的效果差强人意，应用十分有限。
[0003] 治疗性单克隆抗体是对抗感染性疾病的非常有希望的生物药物。我们知道，有些 病毒不能在细胞系中培养或者在体外培养的产量很低。因此，用病原体颗粒免疫从而制备 针对这些病原体的中和单抗十分困难。基于表位肽的免疫方法是解决这一问题的一个方 法，但是很多病原体的中和表位是构象表位，而简单的肽和应用上述方法呈递或展示的肽 均难以呈现出空间构象。因此，仍需要开发出更有效的表位呈递或展示系统，以增强免疫应 答，提高感染性疾病中和性单克隆抗体制备的阳性率。
【发明内容】
[0004] 为克服上述技术缺陷，本发明提供了一种人7型腺病毒中和性单克隆抗体及其制 备方法和应用，该人3型腺病毒抗原表位展示载体系统能有效的展示外源表位，并增强免 疫应答效应。
[0005] 本发明目的之一是提供一种制备针对人7型腺病毒的中和性单克隆抗体的方法， 所述方法包括如下步骤：
[0006] 构建免疫原：将人3型腺病毒载体的六邻体第5高变区替换为所述人7型腺病毒 的六邻体第5高变区基因，构建成嵌合病毒，将所述嵌合病毒作为所述免疫原。
[0007] 所述人7型腺病毒的六邻体第5高变区的氨基酸序列如SEQ NO: 1所示序列，所述 氨基酸序列位于所述人7型腺病毒的六邻体的第255位到269位。
[0008] 所述人3型腺病毒载体为E3区缺失并表达有增强型绿色荧光蛋白的人3型腺病 毒载体。
[0009] 所述人3型腺病毒载体的六邻体第5高变区的氨基酸序列如SEQ N0:2所示序列， 所述氨基酸序列位于所述人3型腺病毒载体的六邻体的第264位到279位。
[0010] 本发明的目的之二是提供了一种利用上述方法制备得到的鼠源的针对人7型腺 病毒的中和性单克隆抗体。 toon] 本发明的目的之三是提供了一种分泌上述鼠源单克隆抗体的杂交瘤细胞 株5MH5/3G5,所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO. C2014104。
[0012] 本发明的目的之四是提供了一种利用上述方法制备得到的人源化的针对人7型 腺病毒的中和性单克隆抗体抗体。
[0013] 本发明的目的之五是提供了一种上述方法制备得到的针对人7型腺病毒的中和 性人-鼠嵌合单克隆抗体。
[0014] 本发明的目的之六是提供了一种药物组合物，包含上述人源化或人-鼠嵌合的单 克隆抗体作为有效成分。
[0015] 本发明将人7型腺病毒六邻体第5高变区（HAdv7HVR5)嵌入六邻体第5高变区缺 失的人3型腺病毒载体，构建成嵌合病毒rAdMHE3 ;然后以嵌合病毒rAdMHE3为免疫原，免 疫小鼠，利用杂交瘤技术，首次成功制备了针对7型腺病毒六邻体第5高变区（HAdv7HVR5) 的HAdv7中和性单抗。本发明将外源中和表位嵌入3型腺病毒载体的高变区内，构建成展 示外源中和表位的重组腺病毒，并以此为免疫原，制备针对外源表位的中和性单克隆抗体 是可行的，能有效的展示外源中和表位，并增强免疫应答效应，对研制感染性疾病治疗性单 克隆抗体具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1是荧光显微镜下观察3型腺病毒载体Ad3EGFP在HEp-2细胞中eGFP表达，图 1A是pBRAd Λ E3GFP线性化片段转染HEp-2细胞后24小时（100X)的图像；图1B是重组 腺病毒rAd_E3GFP感染HEp-2细胞后48小时（100X)的图像；
[0017] 图2是嵌合体病毒构建示意图；
[0018] 图3是嵌合体病毒的复制特性检测结果图；
[0019] 图 4 是构建的嵌合病毒 rAdH7Rl、rAdH7R2、rAdH7R5(即 rAdH7R3)和 rAdH7R7(rAdH7R4)分别与3型腺病毒抗血清中和实验，检测中和滴度的实验结果图；
[0020] 图5是用重组病毒rAdMHE3免疫小鼠后获得的抗血清在体外与7型腺病毒进行中 和实验的结果图；
[0021] 图6是间接ELISA法筛选针对免疫原rAdMHE3的阳性单抗的结果图；
[0022] 图7为腺病毒结合实验结果图；
[0023] 图8为四株中和性单抗与人7型腺病毒HVR5被替换和未被替换的人7型腺病毒 与单抗的反应的活性测定实验结果图。
【具体实施方式】
[0024] 为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验 方法，通常按照常规实验方法进行。
[0025] 本说明书实施例中所述病毒株、细胞系和实验动物术语及相关说明如下：
[0026] HAdv7 :人7型腺病毒。
[0027] HAdv3 :人3型腺病毒。
[0028] _:六邻体高变区。
[0029] HVR5 :六邻体第5高变区。
[0030] HAdv7GZ08 (GenBank登录号：GQ478341)分离自急性呼吸道感染幼儿的鼻咽拭子， HEp-2细胞分离培养。
[0031] HAdv3GZ01 (GenBank登录号：DQ099432)分离自急性呼吸道感染幼儿的鼻咽拭子， HEp-2细胞分离培养。
[0032] Ad3EGFP :用作3型腺病毒载体。本发明所构建的基于人HAdv3E3区缺失
[0033] 并表达有增强
[0034] 型绿色荧光蛋白的腺病毒载体，能表达HAdv3基因组和增强型绿色荧光蛋白的重 组腺病毒。
[0035] rAdMHE3 :用作免疫原。将Ad3EGFP的六邻体高变区5 (HVR5)
[0036] (264FDGRDAVAGALAPEIV279)
[0037] 替换成 HAdv7 的 HVR5 (255FDGREAADAFSPEIV269)，成功拯救出的重组病毒 rAdMHE3。
[0038] rAdH7Rl、rAdH7R2、rAdH7R5 和 rAdH7R7 :做鉴定用。将 rAd3egf/H7 相应的 HVR基因 替换成HAdv3的HVR基因产生的嵌合病毒，其六邻体只有一个HVR区（分别是HVRUHVR2、 HVR5、HVR7)为HAdv3序列，其余部分为7型腺病毒六邻体的序列。rAd3egf/H7(Ad3/H7)是 将Ad3EGFP的六邻体基因替换成HAdv7GZ08的六邻体基因产生的嵌合体病毒。
[0039] HEd-2和AD293细朐：购自牛物咨源中心(ATCC)，用于培养上述腺病毒。
[0040] 细朐培养#用的培养某:含有100叨/1111盘尼西林，100叨/1111链霉素和10%胎牛 血清的DMEM培养基（Gibco, USA)。
[0041] BALB/c小鼠 :购自中山大学实验动物中心，并在无特定病原体条件下饲养。
[0042] 腺病毒纯化：采用标准的氯化铯梯度离心方法，纯化后病毒粒子的含量桉每 260nm下的一个吸光值含有1. IX 1012个病毒粒子（VPs)计算。
[0043] 本发明应用基于人HAdv3、E3区缺失并表达有增强型绿色荧光蛋白的 重组腺病毒载体，命名为Ad3EGFP。并将Ad3EGFP的六邻体第5高变区（HVR5) (264FDGRDAVAGALAPEIV279)替换成 HAdv7 的 HVR5 (255FDGREAADAFSPEIV269)，成功构建出 重组病毒，命名为rAdMHE3。用体外细胞培养扩增后氯化铯梯度离心纯化的rAdMHE3病毒粒 子免疫BALB/c小鼠产生的血清对HAdv7有中和作用；随后的研究也证实，HAdv7的主要的 血清型特异性中和表位位于HVR5。因此，本发明用体外细胞培养扩增后氯化铯梯度离心纯 化的rAdMHE3病毒粒子免疫BALB/c小鼠，以期用杂交瘤技术制备出HAdv7中和性抗体，并 进行鉴定。
[0044] 实施例1 :3型腺病毒载体Ad3EGFP的构建
[0045] 本发明所构建的基于人HAdv3E3区缺失并表达有增强型绿色荧光蛋白的腺病 毒载体，能表达HAdv3基因组和增强型绿色荧光蛋白的重组腺病毒。具体构建步骤为： HAdv3GZ01病毒株在HEp-2细胞培养后，提取病毒基因组，与穿梭质粒pBRALR在BJ5183 细菌内同源重组，获得带HAdv3GZ01病毒全基因组的质粒pBRAdV ;RsrII酶切线性化质 粒pBRAdV后与穿梭质粒pSKE3LCMVeGFP-SV40R在BJ5183细菌内同源重组，获得插入 EGFP基因表达框的重组质粒pBRAd Λ E3GFP，该质粒转染细胞后拯救得到重组腺病毒 rAd Λ E3GFP。
[0046] 实验结果见图1，图1是荧光显微镜下观察Ad3EGFP在HEp-2细胞中eGFP的表达， 其中图1A是pBRAdAE3GFP线性化片段转染HEp-2细胞后24小时（100X)的图像，图1B 是重组腺病毒rAd_E3GFP感染HEp-2细胞后48小时（100X)的图像。结果证明3型腺病 毒载体Ad3EGFP构建成功。
[0047] 实施例2 :免疫原rAdMHE3的构建
[0048] 将 Ad3EGFP 的六邻体高变区 5 (HVR5) (264FDGRDAVAGALAPEIV279)(人 3 型腺病毒载体 的六邻体第5高变区的氨基酸序列如SEQ N0:2所示序列，所述序列位于所述人3型腺病毒 载体的六邻体的第264位到279位）替换成HAdv7的HVR5 (255FDGREAADAFSPEIV269)(人7型 腺病毒的六邻体第5高变区的氨基酸序列如SEQN0:1所示序列，所述序列位于所述人7型 腺病毒的六邻体的第255位到269位），搭桥PCR扩增HVR5区突变的人3型细胞六邻体基 因，酶切连接至穿梭载体PBRLR，与载体pBRAd Λ E3GFP在BJ5183细菌内同源重组获得六邻 体突变的重组腺病毒质粒pBRAd-MHE3,转染293细胞后拯救重组病毒rAdMHE3。
[0049] 图2是嵌合体病毒构建示意图。通过定量PCR测定病毒基因组拷贝数分析病毒复 制特性。结果见图3,图3是嵌合体病毒的复制特性检测结果图，结果表明，rAdMHE3的基因 组复制未受表位置换的影响。
[0050] 实施例3 :鉴定用嵌合病毒rAdH7Rl、rAdH7R2、rAdH7R5和rAdH7R7的构建
[0051] 首先构建rAd3egf/H7(Ad3/H7)嵌合体病毒，rAd3egf/H7(Ad3/H7)嵌合体病毒是 将Ad3EGFP的六邻体基因替换成HAdv7GZ08的六邻体基因产生的嵌合体病毒。构建方法： PCR扩增HAdv7GZ08病毒株的六邻体片段，连接至穿梭质粒pBRALR上，与pBRAd Λ E3GFP骨 架质粒在BJ5183内同源重组，获得重组质粒pAd3egf/H7,转染293细胞后拯救得到重组病 毒rAd3egf/H7。对病毒免疫小鼠进行中和抗体滴度实验，实验结果见表1，表1是对腺病毒 免疫小鼠进行中和抗体滴度实验的结果表。由表1数据可见，该病毒粒子中六邻体为7型 腺病毒的六邻体蛋白，而病毒稳定性等特性没有改变。
[0052] 表 1
[0053]
【权利要求】
1. 一种制备针对人7型腺病毒的中和性单克隆抗体的方法，其特征在于，所述方法包 括如下步骤： 构建免疫原：将人3型腺病毒载体的六邻体第5高变区替换为所述人7型腺病毒的六 邻体第5高变区基因，构建成嵌合病毒，将所述嵌合病毒作为所述免疫原。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人7型腺病毒的六邻体第5高变区 的氨基酸序列如SEQ NO: 1所示序列，所述氨基酸序列位于所述人7型腺病毒的六邻体的第 255位到269位。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人3型腺病毒载体为E3区缺失并表 达有增强型绿色荧光蛋白的人3型腺病毒载体。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人3型腺病毒载体的六邻体第5高变 区的氨基酸序列如SEQ NO: 2所示序列，所述氨基酸序列位于所述人3型腺病毒载体的六邻 体的第264位到279位。
5. -种利用权利要求1-4之一所述的方法制备得到的鼠源的针对人7型腺病毒的中和 性单克隆抗体。
6. -种分泌权利要求5所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞株5MH5/3G5,其特征在于，所 述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO. C2014104。
7. -种利用权利要求1-4之一所述的方法制备得到的人源化的针对人7型腺病毒的中 和性单克隆抗体抗体。
8. -种利用权利要求1-4之一所述的方法制备得到的针对人7型腺病毒的中和性 人-鼠嵌合单克隆抗体。
9. 一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求7或8所述的单克隆抗体作为有效成 分。
【文档编号】A61P31/20GK104086650SQ201410267112
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年6月16日 优先权日:2014年6月16日
【发明者】周荣, 李晨阳, 刘铭龙, 田新贵 申请人:广州锐达生物科技有限公司