一种抗蓖麻毒素的中和性单克隆抗体4c13,其制备方法和用途的制作方法

专利名称：一种抗蓖麻毒素的中和性单克隆抗体4c13,其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗蓖麻毒素中和性单克隆抗体4C13，还涉及该单克隆抗体的制备方法以及在制备蓖麻毒素疫苗和蓖麻毒素检测、诊断、治疗药物中的应用。
背景技术：
蓖麻毒素(Ricin)是一种核糖体失活蛋白，它几乎可以和所有真核细胞结合，呈细胞毒作用。一分子蓖麻毒素进入细胞内，就足以使整个细胞蛋白质合成停止而死亡。其毒性是氰化物的6000倍。蓖麻毒素气溶胶进入体内，可引起严重的肺泡炎症和肺水肿，最后因肺阻塞缺氧而导致死亡(1.GriffithsGD，Lindsay CD，Allenby AC，et al.Protection against inhalation toxicity of ricinand abrin by immunisation.Hum Exp Toxicol 1995；14155-64.2.Brown RFR，White DE.Ultrastructure of rat lung following inhalation of ricin aerosol.Int JExp Pathol 1997；78267-76.)。静脉给药每公斤体重3-5微克即可致命。迄今为止，国内外还没有适用于人的、针对蓖麻毒素中毒的专用特效药。蓖麻毒素生产原料蓖麻籽来源广泛，提取制备方法简便，很容易被恐怖分子利用，因此研究其拮抗剂具有重要的现实意义。
抗体自19世纪末报道可以用来治疗疾病以来，一直用于治疗毒蛇、毒蝎咬伤，具有良好的疗效。大量研究表明用蓖麻毒素的中和抗体治疗突发性蓖麻毒素中毒效果良好。Furukawa-Stofferdeng等报道给小鼠腹腔注射含蓖麻毒素中和抗体的培养上清并同时注射0.5g蓖麻毒素(致死剂量)，可保护受试小鼠抵抗毒素攻击(T.Furukawa-Stoffer，D.C.W.Mah，J.Cherwonogrodzky etal.A novel biological-based assay for the screening of neutralizing antibodies toricin.Hybridoma，1999，18(6)505-511)。抗体治疗的成败依赖于蓖麻毒素被吸收的多少和进入体内的路径(B.M.J.Foxwell，S.I.Detre，T.A.Donovan.et al.The useof anti-ricin antibotied to protect mice intoxicated with ricin.Toxicology，1985，3479-8834.)。在针对蓖麻毒素活性链的单克隆抗体与毒素的分子比为4∶1时，抗体在体外可中和蓖麻毒素对EL-4淋巴瘤细胞的细胞毒作用。甘露醇具有增加大分子物质通过血脑屏障的功能，使用甘露醇后蓖麻毒素的毒性作用比静脉注射增加两倍，针对Ricin的神经中毒，颅内注射抗体后具有和静脉注射同样的保护效果。
目前，国内外针对蓖麻毒素单克隆抗体的报道，主要为检测用的单克隆抗体和具有中和活性的两类。具有中和活性单克隆抗体的报道主要为抗蓖麻毒素A链、B链和A、B链三种形式(1.P.V.Lemley，P.Amanatides，D.C.Wright.Identification and characterization of a monoclonal antibody thatneutralizes ricin toxicity in vitro and in vivo.Hybridoma，1994，13(5)417-421.2.Maddaloni M，Cooke C，Wilkinson R，Stout AV，Eng L，Pincus SH.Immunological characteristics associated with the protective efficacy of antibodiesto ricin.J Immunol.2004，15；172(10)6221-8.)。我国对蓖麻毒素生物战剂的侦检和医学防护等研究领域刚刚起步(1.宋云扬，刘娟，应天翼，等.夹心免疫PCR方法检测蓖麻毒素.免疫学杂志，2002，18(3)229-231.2.郝兰群，郭胜清，郭振泉，等.抗蓖麻毒素单克隆抗体的制备及应用.细胞与分子免疫学杂志，2003，19(5)517-518)，针对蓖麻毒素的恐怖袭击尚无配套诊断试剂和有效免疫治疗和防护手段，尚无针对蓖麻毒素的中和性单克隆抗体，因此迫切需要建立和发展具有自主知识产权的以抗体为基础的检测和防护用品。目前未见有同时识别蓖麻毒素A链和B链线性表位中和性单克隆抗体的报道。

发明内容
为了提供一种蓖麻毒素中毒的检测或治疗手段，本发明公开了一种抗蓖麻毒素的单克隆抗体4C13。
本发明公开的抗蓖麻毒素中和性单克隆抗体4C13的轻、重链蛋白质分子，其氨基酸序列分别如序列表中序列3、序列4所示，其编码基因分别如序列表中序列1、序列2所示。该单克隆抗体的轻、重链蛋白质分子可变区的氨基酸序列分别如序列表中序列5、序列6所示。该单克隆抗体的轻链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，分别如序列表中序列7、序列8、序列9所示。该单克隆抗体的重链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如序列表中序列10、序列11、序列12所示。
本发明还公开了上述单克隆抗体4C13的制备方法，主要内容如下1.抗蓖麻毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株4C13的构建首先对蓖麻毒素用甲醛进行减毒处理，然后免疫Balb/c小鼠，常规方法进行细胞融合。用间接ELISA法筛选，阳性细胞克隆再反复亚克隆，直到所有杂交瘤细胞培养上清检测为100％阳性。对杂交瘤细胞4C13进行了染色体核型分析，杂交瘤细胞4C13染色体平均数目为102条，用双相琼脂扩散实验证明4C13杂交瘤细胞所分泌的免疫球蛋白亚型为IgG1。
2.抗蓖麻毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株4C13的筛选和鉴定用MTT法，就蓖麻毒素对小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行了细胞毒实验，结果算出蓖麻毒素对Sp2/0细胞的半数致死剂量IC50＝0.31ng/ml。依照IC50，筛选出中和性抗体4C13，Western-blotting对特异性作了评价。结果显示4C13为蓖麻毒素中和性抗体，可在体外实验中，中和蓖麻毒素对SP2/0细胞的毒性作用，中和性单克隆抗体4C13可特异性识别蓖麻毒素的A、B链线性表位。
3.单克隆抗体4C13对BALB/C小鼠的保护作用亲和柱纯化Balb/c小鼠杂交瘤细胞腹水，紫外分光光度计测量，计算蛋白质含量。给小鼠注射不同剂量蓖麻毒素，计算半数致死剂量LD50。给小鼠注射不同剂量蓖麻毒素，不同时间段后，注射中和性单克隆抗体4C13记录生长情况。结果显示蓖麻毒素对小鼠的LD50为10.4μg/kg，蓖麻毒素中和性单克隆抗体4C13在小鼠注射10倍致死计量的蓖麻毒素30分钟后仍对小鼠具有保护作用。
4.蓖麻毒素中和性单克隆抗体杂交瘤细胞4C13轻、重链基因的钓取取对数生长期的中和性单克隆抗体4C13细胞，提取RNA，经RT-PCR，用两对特异性引物PHs1，PHs2；PLs1、PLs2钓取抗体的轻重链基因。常规法连接入载体，转化感受态细菌，培养后挑取单个菌落，提取质粒PCR鉴定后进行DNA测序分析。通过本部分实验，构建了含有蓖麻毒素中和抗体4C13轻、重链基因的载体，经序列分析、比对，编码序列为小鼠免疫球蛋白轻、重链基因(序列表中序列1和序列2)。
5.单克隆抗体4C13轻、重链可变区基因序列和氨基酸序列的确定用www.expasy.org在线软件将编码蓖麻毒素中和性单克隆抗体4C13轻、重链可变区核苷酸序列翻译为其编码的氨基酸序列，单克隆抗体4C13轻、重链氨基酸序列如序列表中序列3和序列4所示。根据Kabat数据库(ElvinA.Kabat.《Sequences of Proteins of Immunological Interest》.1991)确定轻链可变区序列如序列表中序列5所示和重链可变区序列如序列表中序列6所示。根据Kabat数据库确定轻链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3其氨基酸序列分别如序列表中序列7、序列8和序列9所示。重链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3其氨基酸序列分别如序列表中序列10、序列11和序列12所示。
6.基于蓖麻毒素中和性单克隆抗体4C13的蓖麻毒素快速检测法用另一株蓖麻毒素单克隆抗体3D74包被ELISA板，与蓖麻毒素中和性单克隆抗体4C13-HRP配伍，建立了蓖麻毒素快速ELISA检测法。并对检测方法的回收率和重复性进行了评价(图9，图10)。
本发明应用一套设计的引物成功地从培养的蓖麻毒素中和性单克隆抗体4C13杂交瘤细胞中克隆了抗体轻、重链可变区基因。所得轻链和重链可变区基因可编码正确的小鼠抗体可变区。本发明的单克隆抗体基于上述已克隆到的蓖麻毒素和中和性单克隆抗体4C13轻、重链可变区基因，可构建和表达多种小分子基因工程抗体，如单链抗体、单域抗体、嵌合抗体、Fab抗体、抗体融合蛋白等；基于上述基因所编码的多肽或蛋白质，可以交联上多种生物活性分子，制备疫苗及用于蓖麻毒素检测、蓖麻毒素和免疫毒素中毒的诊断或治疗药物，具有非常广阔的应用前景。


图1为免疫用蓖麻毒素SDS-PAGE结果图谱。其中泳道1为纯化的非还原态蓖麻毒素；泳道2为经甲醛脱毒处理的非还原态蓖麻毒素；泳道3为纯化的还原态蓖麻毒素；泳道4为经甲醛脱毒处理的还原态蓖麻毒素；泳道5为蛋白质Marker。
图2为杂交瘤细胞染色体核型分析结果图。
图3为蓖麻毒素对Sp2/0细胞的细胞毒作用图。其中横坐标为蓖麻毒素的浓度，纵坐标为蓖麻毒素Sp2/0细胞的杀伤率，依照此结果算出蓖麻毒素对Sp2/0细胞的IC50＝0.31ng/mL。
图4为蓖麻毒素中和性单克隆抗体4C13的筛选图谱。其中横坐标为蓖麻毒素的浓度，纵坐标为各种单克隆抗体作用后蓖麻毒素对Sp2/0细胞的杀伤率，依照此结果筛选到中和性单克隆抗体4C13。
图5为中和性单克隆抗体4C13培养上清中和活性检测图谱。其中横坐标为中和性单克隆抗体4C13培养上清浓度，纵坐标为中和性单克隆抗体4C13作用后蓖麻毒素对Sp2/0细胞的杀伤率，由此结果可以看到，随着4C13培养上清浓度的逐渐下降，其中和作用逐渐下降。
图6为中和性单克隆抗体4C13的结合特性鉴定图谱，其中泳道1为蓖麻毒素的SDS-PAGE结果，上面的为B链，下面的为A链，泳道2为蛋白质Marker，泳道3为中和性单克隆抗体4C13的Western-blot结果。结果显示中和性单克隆抗体4C13可识别蓖麻毒素A、B链线性表位。
图7为中和性单克隆抗体4C13经Protein A纯化的层析结果图。其中，峰1为上样峰，峰2为纯化的抗体峰。
图8为中和性单克隆抗体4C13经Protein A纯化后的SDS-PAGE结果图谱，其中泳道1、2、3为经Protein A纯化的中和性单克隆抗体4C13，泳道4为蛋白质Marker，A为重链，B为轻链。
图9为蓖麻毒素中和性单克隆抗体4C13杂交瘤细胞RNA提取结果。
图10为蓖麻毒素中和性单克隆抗体4C13杂交瘤细胞轻重链基因的PGR结果图谱，其中泳道1为轻链基因；泳道2为DL2000；泳道3为重链基因。基因大小大约为660bp。
图11为蓖麻毒素的快速ELISA检测结果图，其中横坐标表示蓖麻毒素(ricin)浓度(μg/mL)，纵坐标表示A450。以实验组的A值大于阴性对照A值的2.1倍作为判定阳性的标准，快速ELISA对ricin的最低检出浓度为175ng/L；目视比色对蓖麻毒素的最低检出浓度为625ng/L。
图12为快速ELISA的准确性评价图，横坐标表示自来水中ricin添加浓度(μg/mL)，纵坐标表示自来水中ricin测定浓度(μg/mL)。r＝0.996，F＝1172.2，P＜0.0001。曲线和直线分别表示回归前、后自来水中ricin的实际添加浓度和测定浓度之间的关系。
具体实施例方式
通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明，并不意味着限定本发明的范围。
实施例一抗蓖麻毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建一、材料福氏完全佐剂及不完全佐剂，TMB为Sigma公司产品，20％胎牛血清为北京元亨圣马生物技术研究所产品，无血清RPMI 1640为Gibco公司产品，SP2/0细胞从ATCC引进，本实验室保存，Balb/c小鼠、昆明小鼠购自军事医学科学院实验动物中心。其余试剂均为市购。
二、方法结果1.蓖麻毒素的减毒处理在纯化后的蓖麻毒素(Nicolson，G.L.，Blaustein，J.，1972.The interaction of Ricinus com-munis agglutininwith normal and tumor cell surfaces.Biochim.Biophys.Acta 266，543-547.)2mg/ml中加入终浓度为1％的甲醛，37℃处理72h，PH7.20.01M PBS透析72h，SDS-PAGE检测(图1)。
2.Balb/c小鼠免疫 选用4-6周龄的雌性Balb/c小鼠6只，用100μgricin腹股沟皮下免疫，第一针加福氏完全佐剂，第2针加福氏不完全佐剂，每3周免疫1次，共免疫3次。第3次免疫后尾静脉采血，间接ELISA检测抗体产生情况，融合前3天，以100μg ricin腹腔加强免疫一次，第3天融合。
3.细胞融合将免疫的小鼠摘眼球后脱颈处死，无菌摘取小鼠脾细胞，按常规方法进行细胞融合。具体方法①将免疫的小鼠摘眼球放血后脱颈处死，75％酒精浸泡3min，无菌取出脾脏，用200目钢网研磨单个细胞悬液，无血清RPMI 1640洗两次并记数；②收集对数生长期的SP2/0细胞，用无血清RPMI1640洗两次并记数；③按SP2/0细胞∶脾细胞＝1∶5的比例混合两种细胞，用RPMI 1640洗1次，弃尽上清，轻轻将细胞打散；④在1min时间里缓慢加入1ml 50％PEG(MW 1500)溶液，置37℃水浴1min；⑤在1min、2min、2min、5min时间内加无血清RPMI1640 1ml、5ml、10ml、10ml；⑥800r/min离心7min，弃上清，尽可能轻轻将细胞悬起；⑦加含20％FCS的HAT(Sigma)-RPMI1640培养液，调整细胞浓度为2×106/ml，混匀后，滴加在铺有滋养细胞(1×104细胞/孔)96孔培养板(Gibco)中，100μl/孔，37℃5％CO2孵箱中培养。
4.间接ELISA筛选抗蓖麻毒素单克隆抗体杂交瘤细胞(1)用10μg/mlricin包被ELISA板，于4℃过夜并封闭。依次加入待测细胞培养上清液(37℃1h，PBST洗板4次)，及1∶500稀释的50μl HRP-GAM(37℃45min，PBST洗板4次)。以TMB底物显色后，于450nm波长测定A值。
5.杂交瘤细胞克隆化 间接ELISA法筛选为阳性的细胞克隆再反复亚克隆，直到所有杂交瘤细胞培养上清检测为100％阳性。杂交瘤细胞的克隆化用有限稀释法(1)在克隆化的当天或前1天制备滋养细胞脱颈处理昆明小鼠，75％酒精浸泡消毒皮肤，无菌剥离腹部皮肤，注射器抽取5ml 1640培养液注入小鼠腹腔，反复冲洗后吸出腹腔洗液，用20％胎牛血清1640培养液稀释后滴入96孔板，每孔约0.1ml。(2)取少许待作克隆化的杂交瘤细胞移至另一无菌试管中，并准确计数。(3)有限稀释法进行亚克隆。(4)将培养板置于5％CO2，37℃孵箱中培养，5天左右在显微镜下可观察到细胞克隆。适时换液，检测，取阳性单克隆细胞株进行扩大培养，及时冻存细胞株。在第一批实验中，筛选到了4株针对蓖麻毒素的单克隆抗体细胞株。
6.杂交瘤细胞的染色体核型分析在对数生长期的杂交瘤细胞中加入秋水仙素，终浓度为0.02μg/ml，在孵箱中继续培养4小时后收集细胞，经低渗裂解(加入预温至37℃的0.075M KCL8ml，轻轻打匀，37℃30-40分钟)、预固定(甲醇∶冰醋酸＝3∶1新鲜配制，轻轻打匀，离心弃上清)和3次固定(第1次固定加入6ml固定液，轻轻打匀，室温30分钟，离心弃上清；第2次固定加入6ml固定液，轻轻打匀，室温15分钟，离心弃上清；第3次固定加入6ml固定液，轻轻打匀，室温15分钟，离心弃上清)处理后用少量固定液制备细胞悬液，滴于冰水浸泡的玻片上，文火烘干后10％Giemsa染色15-20分钟，水洗镜检(图2)。结果显示经30个分裂相细胞的统计平均值，杂交瘤细胞染色体数目在85-112(n＝30)之间变动，平均数目为102条，且有1-2个中部着丝粒染色体。已知Balb/c小鼠脾细胞染色体数目为40条，Sp2/0细胞染色体数目为60-70条，融合后的杂交瘤细胞染色体数目应该为90-120条，由此提示所获得的抗体分泌细胞为杂交瘤细胞。
7.杂交瘤细胞免疫球蛋白亚型的确定 用羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3，就杂交瘤细胞浓缩后的培养上清作双相琼脂扩散实验，证明4C13杂交瘤细胞所分泌的免疫球蛋白亚型为IgG1。
通过本部分工作，筛选到蓖麻毒素单克隆抗体4C13。杂交瘤细胞4C13染色体数目平均为102条，所分泌的免疫球蛋白亚型为IgG1。
实施例二抗蓖麻毒素中和性单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选和鉴定一、材料同上。
二、方法结果1.ricin对小鼠骨髓瘤细胞SP2/0半数致死剂量(IC50)的确定用RPMI-1640稀释ricin使其浓度分别为0ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.3125ng/mL、0.156ng/mL、0.078ng/mL，分别加入96孔细胞培养板中，每一浓度3复孔，100μl/孔，调整对数生长期的SP2/0细胞浓度调整为5×105/ml，100μl/孔。37℃5％CO2孵箱中培养24h，每孔加入10μl MTT，37℃5％CO2孵箱中培养6h，2000r/min离心10min，弃上清，加100μl DMSO溶解结晶，于570nm波长测定A值。按公式细胞死亡率％＝[1-(实验组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)]×100％评价细胞毒作用，并计算IC50(图3)。用MTT法，就蓖麻毒素对小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行了细胞毒实验，结果算出IC50＝0.31ng/ml。
2.蓖麻毒素中和性单克隆抗体4C13的筛选用RPMI-1640稀释ricin使其浓度分别为40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.3125ng/mL、0.156ng/mL、0.078ng/mL，分别加入96孔细胞培养板中，每一浓度3复孔，100μL/孔。依次分别加入4种待测细胞培养上清液50μL/孔。调整对数生长期的SP2/0细胞浓度调整为1×106/ml，50μL/孔。37℃5％CO2孵箱中培养24h，每孔加入10μL MTT，37℃5％CO2孵箱中培养6h，2000r/min离心10min，弃上清，加100μL DMSO溶解结晶，于570nm波长测定A值。按公式细胞死亡率％＝[1-(实验组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)]×100％评价细胞毒作用(图4)。
3.蓖麻毒素中和性单克隆抗体4C13中和活性测定 用RPMI-1640倍比稀释中和性单克隆抗体4C13杂交瘤细胞培养上清，每一浓度3复孔，100μL/孔。用RPMI-1640稀释ricin使其浓度为1.25ng/mL(IC50＝0.3125ng/mL)，50μL/孔。加于96孔细胞培养板中。调整对数生长期的SP2/0细胞浓度为1×106/ml，50μL/孔。37℃5％CO2孵箱中培养24h，每孔加入10μL MTT，37℃5％CO2孵箱中培养6h，2000r/min离心10min，弃上清，加100μL DMSO溶解结晶，于570nm波长测定A值。按公式细胞死亡率％＝[1-(实验组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)]×100％评价中和性单克隆抗体4C13的作用(图5)。
4.蓖麻毒素中和性单克隆抗体4C13特异性鉴定 将Ricin经120g/L还原SDS-PAGE并转移至硝酸纤维素膜上，滴加含5％奶粉的PBS于4℃封闭过夜，用含0.5ml/L Tween-20的PBS洗膜3次。将膜剪成相同宽度，依次滴加蓖麻毒素中和性单克隆抗体4C13交瘤细胞培养上清(37℃结合1h，PBST洗膜3次，再用含0.5ml/L Tween-20的TBS洗涤3次)及HRP-GAM IgG(37℃结合1h，洗膜3次)以DAB显色后，观察结果(图6)。结果显示4C13为蓖麻毒素中和性抗体。
5.动物体内诱生单克隆抗体制备蓖麻毒素单克隆抗体4C13接种杂交瘤细胞前10天，先给Balb/c小鼠(♂，8～12周)腹腔注射0.5ml液体石腊油。收集对数生长期的杂交瘤细胞，1500r/min离心7min，弃上清，生理盐水洗2次，最后将细胞浓度调整为4×106/ml，每只小鼠腹腔注射0.5ml。7～10天后，可见小鼠腹部明显膨大，碘酒和酒精棉球消毒腹部皮肤，抽取腹水。将抽取的腹水3000r/min离心10min，收集上清，加等量甘油，-20℃冻存备用。
通过本部分工作，获得了命名为4C13的蓖麻毒素中和性单克隆抗体交瘤细胞，在体外实验中，4C13可中和蓖麻毒素对SP2/0细胞的毒性作用，中和性单克隆抗体4C13可特异性识别蓖麻毒素A、B链线性表位。
实施例三单克隆抗体4C13的Protein A纯化及对BALB/C小鼠的保护性实验一、材料Protein A Sepharose CL 4B柱蛋白柱北京本元正阳生物技术有限公司产品；余同上。
二、方法结果
1.在2毫升小鼠腹水中加入1毫升PH8.0，0.1moL/L磷酸缓冲液并用PH9.0，1moL/L TRIS-HCL调整PH为9。把小鼠腹水加入已经用0.1moL/L磷酸缓冲液PH 8.0平衡好的Protein A Sepharose CL 4B柱蛋白柱中，用上述缓冲液洗柱子，直到流出液中测不到杂蛋白为止。用PH 3.0的柠檬酸缓冲液洗脱，收集流出液，并立即用1moL/L TRIS-HCL PH 8.5缓冲液中和，用PH7.2，0.01M PBS透析72h。取样在紫外分光光度计上测OD260，OD280，计算蛋白质含量，冻干-20℃保存(图7，图8)。
2.选用4-6周龄、体重为20g左右的Balb/c小鼠38只，分为4组，雌雄各半，按每公斤体重分别于左测腹腔注射0μg、10μg、20μg、40μg蓖麻毒素，正常饲养，每1h观察一次，记录生长情况，观察2周，计算半数致死剂量LD50，见表1。
3.选用4-6周龄、体重为20g左右的Balb/c小鼠，雌雄各半，分为抗体组、PBS组和正常对照3组，共计5批次。按每公斤体重分别于左测腹腔注射20μg、40μg、60μg、100μg、蓖麻毒素，分别于0min、10min、20min、30min后于右侧腹腔注射纯化的中和性单克隆抗体4C13 100μg，正常饲养，每1h观察一次，记录生长情况，观察2周，结果见表2。
结果显示蓖麻毒素对小鼠的LD50为10.4μg/kg，蓖麻毒素中和性单克隆抗体4C13在小鼠注射10倍致死计量的蓖麻毒素30分钟后仍对小鼠具有保护作用。
表1.蓖麻毒素对Balb/c鼠的半数致死量确定

从结果可以计算出LD50为10.4μg/kg表2.蓖麻毒素中和性单克隆抗体4C13对小鼠的保护作用

实施例四蓖麻毒素中和性单克隆抗体杂交瘤细胞4C13轻、重链基因的钓取一、材料引物PHs1见序列表中序列13；PHs2见序列表中序列14；PLs1见序列表中序列15；PLa1见序列表中序列16；PHa1见序列表中序列17。DNA片段纯化试剂盒OMEGA生物科技公司产品；T4 DNA连接酶New EnglandBiolabs产品；载体PGEM TeasyPromega公司产品；TRIzolInvitrogen公司产品；感受态细菌JM109购自Promega公司。余同上。
二、方法结果1.取对数生长期的中和性单克隆抗体4C13细胞5×106-107个，离心去除上清，将细胞均匀弹起。加1mlTRIzol反复吹打使细胞充分裂解，振荡5分钟后，加入0.2ml氯仿，振荡15秒，室温放置2-3分钟，2-8℃12000r/min，离心15分钟，取上清于另一新管中，加500μl异丙醇混匀后室温放置10分钟，2-8℃12000r/min离心10分钟。75％乙醇洗涤沉淀，干燥后，用20μl无RNA酶的去离子水溶解沉淀(图9)。
2.取含1μg总RNA的溶液，依次加入AMV 5×缓冲液4μl，0ligo(dT)(500ng/μl)0.5μl，2.5mmol/L dNTP2μl，Rnasin(50U/μl)0.5μl，去离子水补至20μl、反转录酶2-5U，42℃延伸1小时。95℃变性5分钟，置冰浴中，产物为cDNA第一链。用2对特异性引物PHs1、PHa1和PLs1、PLa1，在20μl PCR反应体系中，分别加入反转录产物2μl，Taq酶10×buffer 2μl，上下游引物各1μl，2.5mmol/L dNTP 1μl，加Taq酶1-2U，去离子水补至20μl。95℃变性2分钟，循环参数为94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共30个循环，72℃后延伸10分钟(图10)。
3.用分离出欲回收的DNA片段，在长波紫外光下切下含目的DNA片段的胶块，放入离心管中，加入三倍胶体积的化胶液，55℃水浴完全溶解胶块。用DNA片段纯化试剂盒回收DNA片段并将纯化的DNA片段在水溶液里，将回收的PCR产物在T4 DNA连接酶缓冲液中按2∶1的比例(摩尔比)和载体PGEMTeasy混合后，加入0.5U的T4 DNA连接酶于16℃连接过夜，连接反应的总体积为10μL。
4.取连接液10μl，加入200μl感受态细菌JM109中并轻柔混匀，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，迅速转入冰浴2分钟，加800μl LB培养基，转入37℃恒温摇床，以150转/分钟的速度摇动45分钟，4000r/min离心1分钟，弃去800μl上清，取沉淀涂布于含Amp(终浓度为100μg/ml)的固体LB平板，将平板倒置于37℃孵箱12～18小时。
5.在上述平板中挑取单个克隆，接种于含氨卞青霉素(100μg/ml)的LB培养基中。37℃恒温摇床170rpm，震荡培养过夜。取3ml菌液加入1.5mlEppendorf管中，10000rpm离心1min，弃上清。将沉淀菌体重悬于100μL溶液I中，加新鲜配制的溶液II 200μL，轻缓地上下颠倒数次，至液体变清澈为止。随后，再加入150μL溶液III，轻柔地上下颠倒数次使液体混匀，此时出现大量白色絮状沉淀。4℃，12000rpm离心5min，取上清加至另一Eppendorf管中，加入等体积的Tris-HCl饱和酚，剧烈震荡后，12000rpm离心5min，将上层水相移至一新管中。再加入500μL氯仿，重新抽提一次。其后，小心吸取上层水相，移至一新管中，加2倍体积的无水乙醇混匀，于-20℃放置3h。4℃，12000rpm离心10min，弃上清，用70％乙醇洗沉淀2次，室温干燥20min，以40μL无菌双蒸水溶解，进行PCR鉴定及DNA测序分析。
构建了含有蓖麻毒素中和抗体4C13轻、重链基因的载体，经测序分析、序列比对为小鼠免疫球蛋白轻、重链基因(序列表中序列1、序列2)。
实施例六基于蓖麻毒素中和性单克隆抗体4C13的蓖麻毒素快速检测法一、材料mAb 3D74本实验室构建的另一株蓖麻毒素中和性单克隆抗体，识别蓖麻毒素的空间表位。余同上。
二、方法结果用10μg/mL mAb 3D74包被ELISA板，于4℃过夜并封闭。同时加入PBS稀释的不同浓度的ricin和50μL 1∶1 600 4C13-HRP(37℃30min，PBST洗板4次)，以TMB底物显色后，于波长450nm测定A值(图11)。
通过以上实验得出的结论为快速ELISA对ricin的最低检出浓度为175ng/L；目视比色对蓖麻毒素的最低检出浓度为625ng/L。在准确性评价中，测得自来水中ricin的实际添加浓度和测定浓度之间的相关系数r＝0.996，F＝1172.2，P＜0.0001，实际添加浓度和测定浓度之间有非常显著的相关性。自来水中ricin的添加浓度分别为312.5ng/L、625ng/L、1.25μg/L、2.5μg/L和5μg/L时，回收率依次为5.5％、21.6％、31.8％、36.4％和34.5％。在重复性评价中，用快速夹心ELISA检测ricin浓度分别为125μg/L、1mg/L和5mg/L时的批内变异系数，依次为13.78％、6.8％和3.5％。
序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所<120>一种抗蓖麻毒素的中和性单克隆抗体4C13，其制备方法和用途<130>
<160>17<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>638<212>DNA<213>
<400>
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权利要求
1.一种抗蓖麻毒素中和性单克隆抗体4C13，其特征在于轻、重链蛋白质分子分别具有如序列表中序列3、序列4所示的氨基酸序列。
2.权利要求1所述单克隆抗体4C13的轻、重链蛋白质分子编码基因，其特征在于分别具有如序列表中序列1、序列2所示的核甘酸序列。
3.权利要求1所述单克隆抗体4C13的轻、重链蛋白质分子中的可变区，其特征在于分别具有如序列表中序列5、序列6所示的氨基酸序列。
4.权利要求3所述的单克隆抗体4C13的轻链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其特征在于分别具有如序列表中序列7、序列8、序列9所示的氨基酸序列。
5.权利要求3所述的单克隆抗体4C13的重链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其特征在于分别具有如序列表中序列10、序列11、序列12所示的氨基酸序列。
6.权利要求1所述抗蓖麻毒素中和性单克隆抗体4C13的制备方法，包括如下步骤(1)抗蓖麻毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建；(2)抗蓖麻毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选和鉴定；(3)单克隆抗体4C13对小鼠的保护作用；(4)杂交瘤细胞4C13轻、重链基因的钓取；(5)单克隆抗体4C13轻、重链可变区基因序列和氨基酸序列的确定。
7.权利要求1所述抗蓖麻毒素中和性单克隆抗体4C13，在制备蓖麻毒素检测、疫苗以及蓖麻毒素和免疫毒素中毒的诊断或治疗药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抗蓖麻毒素中和性单克隆抗体4C13，该单克隆抗体的制备方法及其在制备蓖麻毒素检测试剂、疫苗以及诊断和治疗蓖麻毒素或免疫毒素中毒药物中的应用。本发明从制备的蓖麻毒素中和性单克隆抗体4C13杂交瘤细胞中克隆了抗体轻、重链可变区基因，所得轻链和重链可变区基因可编码正确的小鼠抗体可变区。基于上述单克隆抗体的轻、重链可变区基因，可构建和表达多种小分子基因工程抗体，基于上述基因所编码的多肽或蛋白质，可以交联上多种生物活性分子，制备疫苗及用于蓖麻毒素检测、蓖麻毒素和免疫毒素中毒的诊断或治疗药物，具有广阔的应用前景。
文档编号C12N5/18GK1982338SQ20061008326
公开日2007年6月20日 申请日期2006年6月1日 优先权日2005年11月24日
发明者郭建巍, 沈倍奋 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所