专利名称：竹黄菌发酵制备天然蒽醌类色素的方法
技术领域：
本发明涉及生物发酵领域，具体的说，本发明涉及竹黄菌的液体深层发酵技术，以及应用该发酵技术制备发酵液和式(I)的天然蒽醌类色素1，5-二羟基-3-甲氧基-7-甲基蒽醌的方法。本发明还涉及由该工艺制备的竹黄菌发酵液和式(I)的蒽醌类色素。
本发明首次实现了由竹黄菌发酵技术制备天然色素，对于竹黄的产业开发具有重要的意义。
背景技术：
色素也称着色剂，以食品着色为主要目的的食品添加剂称着色剂。由于来源不同，一般分为天然色素和合成色素两大类。合成色素的优点是颜色鲜艳，着色力强，不易褪色，用量较低，性能稳定，但由于合成色素主要属于苯胺类色素，其中有的在人体内可以形成致癌物质β-萘胺和α-氯基萘酚。因而天然色素开始重新为人们所重视。
随着人们崇尚天然，追求健康和安全第一等生活方面的要求。食用天然色素的发展迅速。据资料统计，1971-1981年世界公开发表的食用色素专利数为126个，其中87.5％是食用天然色素。
食用天然色素迅猛发展，除了由于合成色素本身存在的安全性问题外，食用天然色素重新被人们所重视，还主要因为它具有以下的优点(1)绝大多数天然色素无毒和无副作用，安全性高。
(2)很多天然色素中含有人体必需的营养物质唯或其本身就是维生素或具有维生素性质的物质。如核黄素，β-胡萝卜素等。
(3)有的天然色素具有一定的药理功效，对某些疾病有预防治疗作用，如芸香苷天然食用黄色素具有使人维持毛细管正常抵抗能力和防止动脉硬化等功能，在医学上一直作为治疗心血管系统疾病的辅助药物和营养增补剂。
(4)天然色素的着色色调比较自然，更接近于天然物质的颜色。
食用天然色素的获得或生产主要有三条途径一是直接提取，二是人工合成，三是利用生物技术生产。为此，人们在努力去寻找新的天然色素资源，主要集中在动植物，矿物质及微生物等方面。目前绝大多数品种的天然色素是采取直接提取的方法生产的。人工合成的方法只能生产极个别的具有天然色素化学组成和分子结构的物质，如胡萝卜素等。由于生物合成代谢的复杂性，许多天然色素物质还难以在人工控制下化学合成，生产受到极大的限制。
近年来随着生物技术的发展，利用生物技术生产天然色素已为人们开阔了广泛的领域。利用微生物发酵的方法生产红曲色素，类胡萝卜素等多种天然色素已成为现实。目前也有人在研究利用植物细胞和组织培养合成技术来生产食品添加剂。其中包括天然色素的生产，特别是基因工程技术的运用，使得该领域的研究充满了诱人的前景。天然色素一般都是植物或微生物的次级代谢产物，含量很低。通过生物技术手段和措施提高产量也是人们研究的内容之一。甚至有人在研究构建一菌株中可产生多种色素的高效菌。
竹黄(Shiraia bambusicola P.Hennigs)又名赤团子、苦竹花、竹花、竹三七等，为药用真菌竹黄的子座。该菌隶属于子囊菌亚门，核菌纲，球壳目，肉座菌科，竹黄属真菌。竹黄多生于衰败或即将衰败的竹林中，外观形状为不规则的多角形的块状或片状，表面乳白色、灰白色或灰蓝色相杂，质轻、松脆、易破碎，药用部分为其子座，尤其是苦竹的茎上，为名贵中药。它主要寄主于箭竹属(Fargesia Franch)和短惠竹属(Brachystachyum)植物，主要分布在江西、浙江、江苏、湖北、湖南、安徽、贵州、福建和云南等我国南方各省以及亚洲的日本。竹黄的药用价值来源已久，早在明代李时珍的巨著《本草纲目》中就有如下记载“竹黄，又名天竺黄，味甘，寒，无毒。主治小儿惊风、去诸风热、镇心明目、滋养五脏…”，民间多用竹黄浸酒，用于治疗风湿性关节炎、坐骨神经痛、腰肌劳损、跌打损伤及虚寒胃痛、小儿惊风、急性肝炎等等。竹黄的提取物中含有许多活性成分，具有很大的药用价值。它具有清热化痰、清心定惊、舒筋活络、祛痛散淤等功效，现代的医学研究表明，竹黄的药用价值主要体现在抗炎、镇痛，抗菌、抗肿瘤及毒副作用等方面。近年来，国内外学者对竹黄的生物学特性、化学成分、临床应用等方面进行了一系列的研究，取得了一些进展，竹黄独特的生理生化性质在医药、食品领域越来越受到人们的关注。
作为一种已知的菌种，涉及竹黄菌的分离和鉴定文献例如魏景超，《真菌鉴定手册》，上海科学技术出版社，上海市，1979年出版，p238；刘天惠，《食用菌概论》，中国展望出版社，北京市，1987出版，p26；和张灏、邓丹，“竹红菌素产生菌的筛选与鉴定“，生物技术，2002，12(4)，p19-20。
竹黄因其具有的药用价值，以及其活性成分的生理生化性质的进一步被研究，使得人们对这种名贵的中药感到极大的兴趣，它所包含的活性成份也逐渐被人们所发现。竹黄含有多种单体化合物，从福建仙游县出产的竹黄中，经醇提、硅胶柱色谱分离，得到10种结晶，已经鉴定的除常见的化合物如甘露醇、硬脂酸等外，还有醌类衍生物，如竹红菌甲素(Hypocrelline A，HA)、竹红菌乙素(Hypocrelline B，HB)、羟基蒽醌等，并在其中还得到了头孢素和硬脂酸乙脂。沈云修等人(竹黄的化学成分研究，中国中药杂志，2002，127(9)，p674)通过柱色谱等方法从竹黄中分离纯化得到了麦角甾醇，过氧麦角甾醇。其中属于天然色素的活性成分的有竹红菌素和1，8-二羟基蒽醌。
在竹黄的众多活性成分中，竹红菌素很早就被人们所认识，因此对它的研究也较多。随着竹黄的药效成分被进一步的深入研究，更多的活性成分被人们所发现。如上文所述沈云修等人首次从竹黄中分离得到蒽醌类化合物。蒽醌类化合物通常包括蒽醌衍生物及其不同程度的还原产物，分子内具有不饱和环二酮结构(醌式结构)的一类天然色素有机化合物。由于不饱和环二酮结构与二酚类结构容易发生氧化还原反应而互相转变，所以作为生物体代谢物的某些醌类，易于参加生物体内一些重要氧化还原反应，在反应过程中起到传递电子的作用，从而促进或干扰了这些生化反应，表现出抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、泻下、解痉、凝血等多种生物活性。蒽醌类化合物及其衍生物是天然产物中一类重要的化合物，他们通常具有显著的生理活性，是大黄，芦荟，虎杖，何首乌，茜草等中草药的主要活性成分。它们是潜在的、重要的、巨大的天然药物来源。由于蒽醌类化合物具有的营养价值功能，并且具有鲜艳的颜色，所以在食用色素方面也具有非常重要的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供了一种制备下述式(I)的天然蒽醌色素的方法，所述蒽醌色素的化学名称是1，5-二羟基-3-甲氧基-7-甲基蒽醌(1，5-dihydroxy-3-methoxy-7-methylanthraquinone)，是棕红色固体粉末，该方法利用了大规模液体深层发酵技术，用已知的竹黄菌进行液体深层发酵，制备得到式(I)的天然蒽醌色素。式(I)化合物的结构如下 所述方法包括以竹黄菌为出发菌株的发酵步骤和将发酵步骤获得的发酵液进行分离纯化的步骤，所述的发酵步骤包括对竹黄菌进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养和发酵培养，得到竹黄发酵液，将该发酵液经分离纯化后得到式(I)的蒽醌类色素。
本发明所使用的竹黄菌(Shiraia bambusicola P.Hennigs)是一种已知的菌种，可由菌种保藏机构买到，其分离和鉴定的文献例如魏景超，《真菌鉴定手册》，上海科学技术出版社，上海市，1979年出版，p238；刘天惠，《食用菌概论》，中国展望出版社，北京市，1987出版，p26；以及张灏和邓丹，“竹红菌素产生菌的筛选与鉴定“，生物技术，2002，12(4)，p19-20。本申请引用上述现有技术文献作为参考。
具体地，本发明方法中所述发酵步骤的液体摇瓶培养是将竹黄菌的斜面菌种转接入装有摇瓶培养基的三角瓶中，培养温度22～30℃，转速120～160转每分钟，培养时间120～140小时，然后进行摇瓶扩大培养。
其中所述摇瓶培养的培养基组成为(单位为克/升)葡萄糖15～35，土豆100～250。所述培养基的使用量是摇瓶培养基与三角瓶容积之比为3∶10左右。
本发明方法中所述发酵步骤的液体摇瓶扩大培养是将上述液体摇瓶培养得到的摇瓶菌种按5～10％的接种量转接入装有摇瓶扩大培养基的三角瓶中进行扩大培养，培养温度22～30℃，转速120～160转每分钟，90～96小时后转接入一级种子罐进行培养。
其中所述扩大培养的培养基组成为(单位为克/升)葡萄糖15～35，土豆100～250，起始pH值为5.5～7.0。所述培养基的使用量是扩大培养基与三角瓶容积之比为3∶10左右。
本发明方法中所述发酵步骤的一级种子培养是将上述步骤得到的摇瓶菌种按5～10％的接种量转接入装有一级种子培养基的种子罐中，培养温度22～30℃，种子罐压力0.05Mpa，搅拌速率90～150转每分钟，通风量1∶0.3～1v/v/m，培养80～90小时后接入发酵罐进行发酵。
其中所述一级种子培养的培养基组成为(单位为克/升)葡萄糖15～35，土豆100～250，加水至适当体积，起始pH值为5.5～7.0。所述培养基的使用量是当一级种子培养的一级种子罐的容积为50～100L时，其中装有的一级种子培养基的量相应为30～70L。
本发明方法中所述发酵步骤的发酵培养是将上述步骤获得的于种子罐中的菌种按5～10％的接种量转接入装有发酵培养基的发酵罐中，培养温度22～30℃，发酵罐压力0.05Mpa，搅拌速率90～125转每分钟，通风量1∶0.3～0.8v/v/m，培养90～120小时。
所述发酵培养的培养基组成为(单位为克/升)乳糖15～35，硝酸钠1.0～3.0，K2HPO40～1.5，MgSO40～0.75，起始pH值为4～8.0。所述培养基的使用量是当发酵培养的发酵罐的容积为500～2000L时，其中装有的发酵培养基的量相应为300～1400L。
本发明方法中，在进行上述摇瓶培养之前，首先将竹黄菌菌种的斜面菌种接入新配制的斜面培养基中进行培养，培养温度22～30℃，培养时间140～240小时。
其中所述的斜面培养基可以是本领域常用的斜面培养基，例如土豆培养基，该培养基在多种教科书和论文中均有表述，例如参见檀耀辉、陶文沂、诸葛健等，《微生物学》，第二版，北京，中国轻工业出版社，p597，本申请引用该文献作为参考。
本发明应用竹黄菌发酵制备蒽醌类色素的方法中，在培养基中所述的土豆经预处理后以土豆汁的形式加入，处理方法在多种教科书和论文中均有表述，参见上文所述文献。
例如，本发明所使用土豆汁可用市场上销售的普通土豆经过处理获得，处理方法是将200克土豆切成小块，用沸水煮30min，用纱布滤去土豆渣，加水至1000mL，制成1000mL土豆汁，使用时作为液体直接加入。
本发明方法的上述发酵步骤所得到的竹黄发酵液为酒红色到红色的液体，其中的菌丝体为暗红色。
因此，本发明的另一目的是提供了由本发明的发酵方法制备的竹黄菌深层发酵液，该发酵液中含有式(I)的蒽醌类色素。本发明的竹黄菌发酵液可直接作为食品添加剂使用，主要是作为色素使用，也可以将其进行分离纯化，用于制备本发明式(I)的蒽醌类色素。
由本发明发酵步骤获得的发酵液经分离纯化步骤制备本发明式(I)的蒽醌类色素的方法包括(1)将竹黄菌深层发酵获得的发酵液离心分离，得到上清液；(2)将上述步骤获得的上清液用有机溶剂萃取；(3)柱色谱分离，和(4)合并柱色谱分离的洗脱液，经真空浓缩和冷冻干燥后，得到式(I)的蒽醌类色素。
其中用于萃取发酵液的上清液的有机溶剂可以是氯代烃，例如二氯甲烷、氯仿等；或是醚类溶剂如乙醚、甲乙醚等；或是酯类溶剂如乙酸乙酯、乙酸甲酯等，优选的溶剂是氯仿、乙醚或乙酸乙酯。
其中所述柱色谱分离纯化步骤可使用常规的柱色谱柱，优选使用的色谱柱是硅胶柱和C18柱。当使用所述的硅胶柱时，使用的洗脱液是正己烷-异丙醇。当使用所述的C18柱时，使用的洗脱液是甲醇-水。
由本发明的方法制备的目的产物式(I)的蒽醌类色素是红棕色的粉末。
本发明方法中，所述蒽醌类色素的产率可达7～10毫克/升。本文所用的术语目的产物的“产率”是指每1000ml发酵液所得到的色素的干重。
更具体地，本发明制备式(I)的蒽醌类色素的方法通过以下步骤来实现(1)将竹黄菌菌种的斜面菌种接入新配制的斜面培养基中进行培养，培养温度22～30℃，培养时间140～240小时；(2)将步骤1得到的斜面菌种转接入装有上述摇瓶培养基的三角瓶中进行培养，其中摇瓶培养基与三角瓶容积之比为3∶10左右，培养温度22～30℃，转速120～160转每分钟，培养时间120～140小时；(3)将步骤2得到的摇瓶菌种按5～10％的接种量转接入装有上述摇瓶扩大培养基的三角瓶中进行扩大培养，其中扩大培养基与三角瓶容积之比为3∶10左右，培养温度22～30℃，转速120～160转每分钟，90～96小时后转接入一级种子罐进行培养；(4)将步骤3得到的菌种按5～10％的接种量转接入装有上述一级种子培养基的种子罐中进行培养，当一级种子罐的容积为50～100L时，其中装有的一级种子培养基的量相应为30～70L，培养温度22～30℃，种子罐压力0.05Mpa，搅拌速率90～150转每分钟，通风量1∶0.3～1v/v/m，培养80～90小时后接入发酵罐进行发酵；(5)将种子罐中的菌种按5～10％的接种量转接入装有上述发酵培养基的发酵罐中进行培养，得到发酵液；当发酵罐的容积为500～2000L时，其中装有的发酵培养基的量相应为300～1400L，培养温度22～30℃，发酵罐压力0.05Mpa，搅拌速率90～125转每分钟，通风量1∶0.3～0.8v/v/m，培养90～120小时；和(6)将上述步骤5获得的发酵液进行离心分离，得到的上清液经有机溶剂萃取，萃取液经硅胶柱和C18柱进行色谱分离，得到的洗脱液经真空浓缩和冷冻干燥后得到本发明的最终产物式(I)的蒽醌类色素，为红棕色的固体粉末。
上述各步骤使用的培养基如前文所述。
本发明方法的发酵培养工艺适于在500～2000L的发酵罐规模进行，结合本领域的基本知识可以根据生产需要进一步扩大生产规模。本发明的另一目的是提供了应用竹黄菌发酵方法制备的式(I)的蒽醌类色素1，5-二羟基-3-甲氧基-7-甲基蒽醌。
本发明的式(I)的蒽醌类色素是是棕红色固体粉末，具有鲜艳的、类似天然物质的颜色，将其作为食品添加剂，特别是作为色素使用时具有很多优点，例如着色色调自然，更接近于天然物质颜色；由于该化合物是由天然的竹黄菌经发酵获得，因此不含有任何化学合成方法可能带来的、可能产生毒副作用的杂质，具有天然色素无毒和无副作用，安全性高的优点。
经试验证明，本发明的式(I)的蒽醌类色素还具有抗氧化和/或抑菌的作用，因此可作为抗氧化剂和/或抑菌剂使用。在将该化合物作为食品添加剂使用时，不仅具有色素的功能，而且还同时具有抗氧化和/或抑菌等多种有益于人体健康的功能，其应用具有广阔的前景。
图1是本发明的方法制备得到的式(I)的天然蒽醌类色素1，5-二羟基-3-甲氧基-7-甲基蒽醌的HPLC色谱图。
图2是本发明式(I)色素对黑曲霉及米曲霉的抑菌作用试验的照片。
具体实施例方式
为了进一步阐述本发明的技术，给出了下述实施例。但是，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1竹黄菌发酵液的制备1.在新鲜的斜面培养基中接入竹黄菌菌丝体，竹黄菌(Shiraiabambusicola P.Hennigs)LBR-SB6菌种由吉林农业大学菌物研究所菌种保藏中心购买。作为一种已知的菌种，其分离和鉴定可参考上文所述相关文献，例如魏景超，《真菌鉴定手册》，上海科学技术出版社，上海市，1979年出版，p238等。培养温度25℃，斜面培养基配方为(单位为克/升)葡萄糖25，土豆200，和琼脂20。
待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有75mL摇瓶培养基的250mL的三角瓶中(共5瓶)，于25.5℃、150转/分钟摇床培养130小时。其中所述摇瓶培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖25，土豆200，起始pH 6.3。
2.将上述摇瓶菌种接入装有150mL扩大培养基的500mL三角瓶中(共24瓶)进行培养，接种量为每500mL三角瓶接入11mL摇瓶种子，于25.5℃、150转/分钟摇床培养93小时。其中所述扩大培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖20，土豆200。
3.将上述扩大培养的菌种3600mL接入装有44.9L一级种子培养基的75L种子罐中进行培养，种子罐中发酵液的总体为48.5L；维持罐温25.5℃，罐压0.05MPa，搅拌速率120转每分钟，通风量1∶0.6v/v/m，发酵时间85小时。其中种子罐中的一级种子培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖20，土豆200。
4.然后将上述步骤得到的48.5L一级种子菌种接入装有600L发酵培养基的1000L发酵罐中进行培养，发酵罐中发酵液的总体为648.5L。维持罐温25.5℃，罐压0.05MPa，搅拌速率100转每分钟，通风量1∶0.5v/v/m，发酵时间96小时。其中发酵罐中的发酵培养基的配方为(单位为克/升)乳糖20，硝酸钠2.0，K2HPO41.0，MgSO40.5，KCl0.5。
得到625.7L竹黄发酵液，为酒红色到红色的液体，其中的菌丝体为暗红色。
实施例2式(I)色素的制备1.将实施例1所得到的发酵液于3000转/分钟离心，获得的上清液。
2.将100mL上述发酵上清液用旋转蒸发仪减压蒸发浓缩至约46mL，得发酵浓缩液。浓缩液用6mol/L的HCl调pH至3.0左右，加入等体积的氯仿萃取，氯仿萃取液抽滤，除去乳状物，得清液约42mL，减压蒸发浓缩至约2mL。
3.柱色谱纯化(1)硅胶柱色谱层析柱规格玻璃柱；柱长×内径30mm×20mm；填料高度20mm；柱体积400mm填料规格柱色谱硅胶，粗孔(ZCX-II)200-300目，为青岛海洋化工厂产品洗脱液正己烷—异丙醇上样量1mL浓缩样品洗脱方法待1mL浓缩样品都吸附于硅胶柱层面后，用正己烷—异丙醇体积比为98∶2的洗脱液洗脱，洗脱液流速3mL/min，洗脱体积为200mm；然后换用正己烷—异丙醇为97∶3的洗脱液洗脱，洗脱体积为300mm，洗脱结束。
组分收集浓缩样品经正己烷—异丙醇梯度洗脱，样品在硅胶柱中形成色带，收集各3个色带组分，各组分通过HPLC检测，将每次收集的相同的组分合并。第二个色带组分为目的产物。
HPLC检测条件色谱柱Lichrospher C18(Column 4.6mm×250mm)；流动相85％甲醇的水溶液；流速1mL/min；柱温30℃，检测波长440nm。
本发明目的产物的HPLC图谱见附图1，其中于15.85分钟时的峰是该化合物的标志峰。
收集获得的目的产物进行减压蒸发浓缩，浓缩物用甲醇溶解后，用C18柱按照下述方法进行处理。
(2)C18柱色谱层析柱规格特制玻璃中压层析柱；柱长×内径400mm×13mm，填料高度300mm填料规格C18填料粒径为40-63um，为江苏汉邦科技有限公司产品洗脱液甲醇-水上样量1mL样品洗脱方法待1mL浓缩样品都吸附于C18柱层面后，用甲醇-水的体积比为30∶70的洗脱液洗脱，洗脱液流速3mL/min，洗脱体积为200mL，此后采用相同的流速，依次换用甲醇-水为40∶60和45∶55的洗脱液各200mL，最后采用甲醇-水为50∶50洗脱，洗脱体积为400mL。
样品收集当用去最后的洗脱液(甲醇-水为50∶50)约150mL时色素被洗脱，开始收集洗脱液，当收集约100mL洗脱液时，色素被完全洗脱。
4.后处理将收集得到的100mL洗脱液进行减压蒸发除去甲醇，冷冻干燥剩余的色素水溶液得到目的产物，为红棕色粉末，干重为9.0毫克。
最终目的产物式(I)蒽醌色素的产率为9.0mg/L。
5.色素纯度检测HPLC检测条件色谱柱Lichrospher C18(Column 4.6mm×250mm)；流动相0％-100％甲醇的水溶液梯度洗脱；流速1mL/min；柱温30℃，检测波长440nm。用此方法测得的该色素的纯度为97.01％。
实施例3式(I)色素的制备此实施例所用的菌种及斜面培养基与实施例1相同。
1.在新鲜的斜面培养基中接入竹黄菌菌丝体，培养温度25℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有75mL摇瓶培养基的250mL三角瓶中(共3瓶)，于22℃、120转/分钟摇床培养140小时；2.将上述摇瓶菌种接入装有150mL扩大培养基的500mL三角瓶中(共10瓶)，接种量为每500mL三角瓶接入15mL摇瓶种子，于22℃、120转/分钟摇床培养96小时；3.将上述扩大培养的菌种1500mL接入装有28.5L一级种子培养基的50L种子罐中进行培养，种子罐中发酵液的总体为30L；维持罐温22℃，罐压0.05MPa，搅拌速率90转每分钟，通风量1∶1v/v/m，发酵时间90小时；4.将上述步骤得到的30L上述一级种子菌种接入装有320L发酵培养基的500L发酵罐中进行培养，发酵罐中发酵液的总体为350L；维持罐温22℃，罐压0.05MPa，搅拌速率90转每分钟，通风量1∶0.8v/v/m，发酵时间120小时；得到342L发酵液。
5.按照与实施例2相同的方法，对上述步骤得到的1000L发酵液进行分离纯化，得到目的产物，为红棕色的粉末，干重为7.5毫克，产率7.5毫克/升。
本实施例使用的各种培养基的配方如下摇瓶培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖15，土豆100，起始pH值为5.8。
扩大培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖15，土豆100，起始pH值为5.8。
一级种子培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖15，土豆100，起始pH值为5.8。
发酵培养基的配方为(单位为克/升)乳糖15，硝酸钠1.5，K2HPO41.0，MgSO40.5，KCl0.5。
按照与实施例2所述最终产物蒽醌色素的纯度测试方法测得其纯度为96.9％。
实施例4式(I)色素的制备此实施例所用的菌种及斜面培养基与实施例1相同。
1.在新鲜的斜面培养基中接入竹黄菌丝体，培养温度30℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有75mL摇瓶培养基的250mL三角瓶中(共3瓶)，30℃、160转每分钟摇床培养120小时；2.将上述摇瓶菌种接入装有300mL扩大培养基的1000mL三角瓶中(共12瓶)，接种量为每1000mL三角瓶接入15mL摇瓶种子，30℃、160转每分钟摇床培养90小时；3.将上述扩大培养的菌种3600mL接入装有66.4L一级种子培养基的100L种子罐中进行培养，种子罐中发酵液的总体为70L；维持罐温30℃，罐压0.05MPa，搅拌速率90转每分钟，通风量1∶0.3v/v/m，发酵时间80小时；4.将上述步骤得到的70L一级种子菌种接入装有1330L发酵培养基的2000L发酵罐中进行培养，发酵罐中发酵液的总体为1400L；维持罐温30℃，罐压0.05MPa，搅拌速率125转每分钟，通风量1∶0.3v/v/m，发酵时间90小时；得到1302.2L发酵液。
5.按照与实施例2相同的方法，对上述步骤得到的1000mL发酵液进行分离纯化，得到目的产物，为红棕色的粉末，干重为7.0毫克，产率7.0毫克/升。
本实施例使用的各种培养基的配方如下摇瓶培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖35，土豆150，起始pH值为7.0。
扩大培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖35，土豆150，起始pH值为7.0。
一级种子培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖35，土豆150，起始pH值为7.0。
发酵培养基的配方为(单位为克/升)乳糖15，硝酸钠1.5，K2HPO40.75，MgSO40.25，KCl0.5。
按照与实施例2所述最终产物蒽醌色素的纯度测试方法测得其纯度为96.5％。
实施例5式(I)色素的制备此实施例所用的菌种及斜面培养基与实施例1相同。
1.在新鲜的斜面培养基中接入竹黄菌菌丝体，培养温度26℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有75mL摇瓶培养基的250mL三角瓶中(共4瓶)，26℃、150转每分钟摇床培养136小时；2.将上述摇瓶菌种接入装有300mL扩大培养基的1000mL三角瓶中(共18瓶)，接种量为每1000mL三角瓶接入24mL摇瓶种子，26℃、150转每分钟摇床培养94小时；3.将上述扩大培养的菌种5.25L接入装有47.25L一级种子培养基的75L种子罐中进行培养，种子罐中发酵液的总体为52.5L；维持罐温26℃，罐压0.05MPa，搅拌速率125转每分钟，通风量1∶0.5v/v/m，发酵时间80小时；4.将上述步骤得到的52.5L一级种子菌种接入装有547.5L发酵培养基的1000L发酵罐中进行培养，发酵罐中发酵液的总体为600L；维持罐温26℃，罐压0.05MPa，搅拌速率100转每分钟，通风量1∶0.5v/v/m，发酵时间108小时，得到588.5L发酵液；5.按照与实施例2相同的方法，对上述步骤得到的1000mL发酵液进行分离纯化，得到目的产物，为红棕色的粉末，干重为10.0毫克，产率10.0毫克/升。
本实施例使用的各种培养基的配方如下摇瓶培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖30，土豆200，起始pH值为6.8。
扩大培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖30，土豆200，起始pH值为6.8。
一级种子培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖30，土豆200，起始pH值为6.8。
发酵培养基的配方为(单位为克/升)乳糖30，硝酸钠30，K2HPO40.5，MgSO40.25，KCl0.5。
竹黄菌发酵获得蒽醌色素产量测试方法与实施例1相同。
按照与实施例2所述最终产物蒽醌色素的纯度测试方法测得其纯度为97.4％。
实施例6式(I)色素的制备此实施例所用的菌种及斜面培养基与实施例1相同。
1.在新鲜的斜面培养基中接入竹黄菌菌丝体，培养温度28℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有75mL摇瓶培养基的250mL三角瓶中(共3瓶)，28℃、135转每分钟摇床培养128小时；2.将上述摇瓶菌种接入装有150mL扩大培养基的500mL三角瓶中(共10瓶)，接种量为每500mL三角瓶接入15mL摇瓶种子，28℃、140转每分钟摇床培养92小时；3.将上述扩大培养的菌种1500mL接入装有28.5L一级种子培养基的50L种子罐中进行培养，种子罐中发酵液的总体为30L；维持罐温28℃，罐压0.05MPa，搅拌速率130转每分钟，通风量1∶0.4v/v/m，发酵时间84小时；4.将上述步骤得到的30L一级种子菌种接入装有270L发酵培养基的500L发酵罐中进行培养，发酵罐中发酵液的总体为300L；维持罐温28℃，罐压0.05MPa，搅拌速率120转每分钟，通风量1∶0.35v/v/m，发酵时间96小时；得到294.3L发酵液；
5.按照与实施例2相同的方法，对上述步骤得到的1000mL发酵液进行分离纯化，得到目的产物，为红棕色的粉末，干重为9.1毫克，产率9.1毫克/升。
本实施例使用的各种培养基的配方如下摇瓶培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖35，土豆200，起始pH值为6.5。
扩大培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖35，土豆200，起始pH值为6.5。
一级种子培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖35，土豆200，起始pH值为6.5。
发酵培养基的配方为(单位为克/升)乳糖35，硝酸钠3.5，K2HPO40.5，MgSO40.25，KCl0.5。
按照与实施例2所述最终产物蒽醌色素的纯度测试方法测得其纯度为97.3％。
实施例7式(I)色素的制备此实施例所用的菌种及斜面培养基与实施例1相同。
1.在新鲜的斜面培养基中接入竹黄菌菌丝体，培养温度28℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有75mL摇瓶培养基的250mL三角瓶中(共5瓶)，26℃、130转每分钟摇床培养132小时；2.将上述摇瓶菌种接入装有300mL扩大培养基的1000mL三角瓶中(共14瓶)，接种量为每1000mL三角瓶接入25mL摇瓶种子，26℃、150转每分钟摇床培养92小时；3.将上述扩大培养的菌种4200mL接入装有55.8L一级种子培养基的100L种子罐中进行培养，种子罐中发酵液的总体为60L；维持罐温24℃，罐压0.05MPa，搅拌速率110转每分钟，通风量1∶0.8v/v/m，发酵时间80小时；4.将上述步骤得到的60L一级种子菌种接入装有1140L发酵培养基的2000L发酵罐中进行培养，发酵罐中发酵液的总体为1200L；维持罐温24℃，罐压0.05MPa，搅拌速率100转每分钟，通风量1∶0.6v/v/m，发酵时间110小时，得到1810.2L发酵液。
5.按照与实施例2相同的方法，对上述步骤得到的1000mL发酵液进行分离纯化，得到目的产物，为红棕色的粉末，干重为9.5毫克，产率9.5毫克/升。
本实施例使用的各种培养基的配方如下摇瓶培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖35，土豆250，起始pH值为6.0。
扩大培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖35，土豆250，起始pH值为6.0。
一级种子培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖35，土豆250，起始pH值为6.0。
发酵培养基的配方为(单位为克/升)乳糖35，硝酸钠3.0，K2HPO41.5，MgSO40.5，KCl0.75。
实施例8式(I)色素的制备此实施例所用的菌种及斜面培养基与实施例1相同。
1.在新鲜的斜面培养基中接入竹黄菌菌丝体，培养温度22℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有75mL摇瓶培养基的250mL三角瓶中(共5瓶)，26℃、130转每分钟摇床培养132小时；2.将上述摇瓶菌种接入装有300mL扩大培养基的1000mL三角瓶中(共14瓶)，接种量为每1000mL三角瓶接入25mL摇瓶种子，26℃、150转每分钟摇床培养92小时；3.将上述扩大培养的菌种4200mL接入装有55.8L一级种子培养基的100L种子罐中进行培养，种子罐中发酵液的总体为60L；维持罐温24℃，罐压0.05MPa，搅拌速率110转每分钟，通风量1∶0.8v/v/m，发酵时间80小时；4.将上述步骤得到的60L一级种子菌种接入装有1140L发酵培养基的2000L发酵罐中进行培养，发酵罐中发酵液的总体为1200L；维持罐温24℃，罐压0.05MPa，搅拌速率100转每分钟，通风量1∶0.6v/v/m，发酵时间110小时，得到1851.6L发酵液；5.按照与实施例2的方法，对上述步骤得到的1000mL发酵液进行分离纯化，得到目的产物，为红棕色的粉末，干重为7.2毫克，产率7.2毫克/升。
本实施例使用的各种培养基的配方如下摇瓶培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖35，土豆250，起始pH值为5.5。
扩大培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖35，土豆250，起始pH值为5.5。
一级种子培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖35，土豆250，起始pH值为5.5。
发酵培养基的配方为(单位为克/升)乳糖2.0，硝酸钠3.5，K2HPO41.5，MgSO40.75，KCl0.25。
实施例9本发明式(I)色素的抗氧化性采用已知的DDPH(2，2-二苯基苦味肼，2，2-diphenyl-1-picrylhyrazyl)法进行测定(参见王威，常用天然色素抗氧活性的研究，食品科学，2003，24(6)，p96-100)。
测定方法在试管中加入0.01％的DDPH溶液2ml和2ml浓度为0.1mg/ml的色素样品溶液，摇匀，于37℃水域中恒温30min，在517nm下测定吸光度值。2ml甲醇代替色素样品溶液，加入0.01％的DDPH溶液2ml，摇匀，以此为空白对照。
结果计算按下式计算羟自由基的清除率羟自由基的清除率＝[(Ao-As)/Ao]×100％式中Ao为空白吸光度，As为样品吸光度。
按照上述DDPH法测得0.1mg/ml的色素溶液的羟基自由基清除率为22.3％。
根据上述文献公开的内容可知，采用同样的测定方法，0.1mg/ml的紫胶红素的自由基清除率为37.0％；上述数据表明本发明的式(I)的蒽醌类色素具有一定的自由基清除作用。
实施例10本发明式(I)色素的抑菌作用采用双层培养基，上下层培养基相同，均为察氏培养基。
察氏培养基组成为(单位为克/升)蔗糖3，NaNO30.2，K2HPO40.1，MgSO47H2O0.05，KCl0.05，FeSO4·7H2O0.1在上述培养基中对黑霉菌和米曲霉分别进行斜面培养活化后，用5ml的无菌水将孢子洗下，制成孢子悬液备用。
用大口吸管吸取20ml已加热熔化的察氏培养基注入无菌平皿中，均匀铺满皿底待凝固作为底层培养基，用移液管吸取1ml备用的孢子悬液，加至48℃保温的50ml察氏培养基中，轻轻摇匀再用无菌大口吸管吸取10ml加至已凝固的底层培养基上，立即摇匀，制成含菌薄层平板。
结果如图2所示，图2说明了本发明式(I)色素对黑曲霉及米曲霉的抑菌结果。在图2中，左图为该色素对黑曲霉的抑菌照片，照片中上面两个圈为抑菌圈，抑菌圈的大小为2.5cm；右图为该色素对米曲霉的抑菌照片，照片中上面的圈为抑菌圈，抑菌圈的大小为1.2cm；图2两幅照片中下方的圈为空白对照，没有产生抑菌圈。
本实施例的实验说明式(I)的蒽醌类色素具有一定的抑菌作用。
以上已详细描述了本发明的实施方案，对本领域技术人员来说很显然可以做很多改进和变化而不会背离本发明的基本精神。所有这些变化和改进都在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.制备下述式(I)的天然蒽醌色素的方法，所述蒽醌色素的化学名称是1，5-二羟基-3-甲氧基-7-甲基蒽醌，其化学结构如下 所述方法包括以竹黄菌为出发菌株的发酵步骤和将发酵步骤获得的发酵液进行分离纯化的步骤，所述的发酵步骤包括对竹黄菌进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养和发酵培养，得到竹黄发酵液，将该发酵液经分离纯化后得到式(I)的蒽醌类色素。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述摇瓶培养的培养基组成为(单位为克/升)葡萄糖15～35，土豆100～250；摇瓶培养的培养条件是培养温度24～30℃，转速120～160转/分钟，培养时间120～140小时。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述扩大培养的培养基组成为(单位为克/升)葡萄糖15～35，土豆100～250，加水至适当体积，起始pH值为5.5～7.0；扩大培养的培养条件是接种量5～10％(体积百分比)，培养温度22～30℃，转速120～160转/分钟，培养时间90～96小时。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述一级种子培养的培养基组成为(单位为克/升)葡萄糖15～35，土豆100～250，加水至适当体积，起始pH值为5.5～7.0；一级种子培养的培养条件是接种量5～10％(体积百分比)，培养温度22～30℃，搅拌速率90～150转/分钟，通风量1∶0.3～1v/v/m，培养时间80～90小时。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述发酵培养的培养基组成为(单位为克/升)乳糖15～35，硝酸钠1.0～3.0，K2HPO4 0～1.5，MgSO4 0～0.75，KCl 0～0.75加水至适当体积，起始pH值为4～8.0；发酵培养的培养条件是接种量5～10％(体积百分比)，培养温度22～30℃，搅拌速率90～125转/分钟，通风量1∶0.3～0.8v/v/m，培养时间90～120小时。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述发酵液的分离纯化步骤包括将发酵步骤得到的发酵液离心分离，得到的上清液经有机溶剂萃取、柱色谱分离和真空浓缩，然后将浓缩液冷冻干燥得到式(I)的蒽醌类色素。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其中用于萃取上清液的有机溶剂选自氯仿、乙醚和乙酸乙酯。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其中所述柱色谱分离步骤使用的色谱柱是硅胶柱和C18柱。
9.由权利要求1所述制备方法得到的发酵液和式(I)天然蒽醌色素1，5-二羟基-3-甲氧基-7-甲基蒽醌。
10.权利要求9的发酵液和式(I)天然蒽醌色素作为食品添加剂的应用。
全文摘要
本发明涉及生物发酵领域，具体的说本发明涉及竹黄菌深层发酵制备蒽醌类色素的方法，以及由该方法获得的深层发酵液和式(I)的蒽醌类色素1，5－二羟基－3－甲氧基－7－甲基蒽醌。该方法包括以竹黄菌为出发菌株，进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养和深层发酵培养，和将所获得的发酵液进行分离纯化的步骤。本发明首次实现了通过竹黄菌深层发酵技术生产式(I)的蒽醌类色素，该化合物是棕红色固体。由本发明的方法得到的发酵液和蒽醌类色素可用作色素作为食品添加剂，本发明的色素还具有抗氧化和/或抑菌作用。
文档编号C12P7/24GK1884386SQ200610083188
公开日2006年12月27日 申请日期2006年6月9日 优先权日2006年6月9日
发明者石贵阳, 丁重阳, 张梁, 蔡宇杰, 楼志华 申请人:江南大学