专利名称：重组氨基糖苷类双功能修饰酶体外代谢模型的建立及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及修饰酶对抗生素的体外代谢模型，具体地涉及重组氨基糖苷类双功能修饰酶对氨基糖苷类抗生素的体外代谢模型及其应用。
背景技术：
氨基糖苷类抗生素是一大类在临床上具有重要意义的纯天然或半合成的多价阳离子化合物。随着此类抗生素在临床上的应用，细菌对其耐药性逐渐增强，其主要机制是细菌产生修饰酶，通过O-磷酸化，N-乙酰化和O-腺苷化共价修饰抗生素，使此类抗生素的抗菌活性大大降低，甚至失效。
氨基糖苷类双功能修饰酶AAC(6′)-APH(2″)是革兰氏阳性菌(主要是肠球菌和金葡菌)中最常见的修饰酶，它同时具有乙酰化和磷酸化转移酶活性，使几乎所有种类的氨基糖苷类抗生素对含该双功能酶的菌株高度耐药，并且使之与青霉素等作用于细胞壁的抗生素的协同作用消失。该双功能修饰酶基因通常与转座子(如粪肠球菌中的Tn5281和金葡菌中的Tn4001)相连，加速耐药基因在菌种之间的传播。
对粪肠球菌和金葡菌中的aac(6′)-aph(2″)基因进行的克隆和测序发现，其开放阅读框包括1475个碱基，编码479个氨基酸。双功能修饰酶N端表现乙酰化酶(AAC，aminoglycoside acetyltransferases)活性，C端表现磷酸化酶(APH，aminoglycoside phosphotransferases)活性。Daigle DM的研究发现，双功能修饰酶具有强大的底物修饰功能，可通过N-乙酰化，O-乙酰化或O-磷酸化修饰抗生素，并且磷酸化反应可发生于多个位点。
常用的检测氨基糖苷类抗生素被修饰酶修饰的方法有磷酸纤维素试纸粘贴法，偶联检测系统(因氨基糖苷类抗生素大多数无明显紫外吸收)，以及采用质谱、核磁等分析方法检测修饰后产物。磷酸纤维素试纸粘贴法需要用到放射性物质，毒性大且价格贵；偶联检测系统因需要偶联另一个反应，最终检测结果受偶联反应的影响，此外，如果反应发生在两个或多个部位，产生多个产物，也无法区分；而质谱、核磁等分析方法需要昂贵的仪器和专业人员操作，不便于普及，仅适合用于后续验证阶段。高效液相色谱检测法曾被Lovering AM用于氨基糖苷类乙酰化酶和磷酸化酶的分型。本发明的发明人首次提出用高效液相色谱的方法来评价氨基糖苷类抗生素的双功能修饰酶稳定性，该方法在国内外未见到相关的报道。
发明内容
(一)要解决的技术问题本发明的目的是提供一种重组大肠埃希氏菌及由其诱导表达得到的重组氨基糖苷类双功能修饰酶。本发明的又一目的是提供一种重组氨基糖苷类双功能修饰酶的体外代谢模型，本发明还公开了这种模型在筛选氨基糖苷类双功能修饰酶稳定性抗生素和氨基糖苷类双功能修饰酶抑制剂中的应用。
(二)技术方案本发明所述的重组大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC1667含有重组质粒pET-30a-aac(6′)-aph(2″)，该质粒上插有氨基糖苷类双功能修饰酶基因aac(6′)-aph(2″)。该菌株的保藏日期为2006年04月05日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号CGMCC1667。
由本发明所述的重组大肠埃希氏菌CGMCC1667诱导表达得到的氨基糖苷类双功能修饰酶。
本发明所述的氨基糖苷类双功能修饰酶体外代谢模型，包括以下步骤(1)用重组大肠埃希氏菌CGMCC1667诱导表达氨基糖苷类双功能修饰酶，制备酶提取物；(2)酶提取物和氨基糖苷类抗生素在孵育体系中进行磷酸化或乙酰化反应；(3)取步骤(2)中得到的反应混合物用衍生化试剂进行衍生化，离心，取上清进行高效液相色谱检测，计算氨基糖苷类抗生素的被修饰百分率，评价其对双功能修饰酶的稳定性。
本发明所述的氨基糖苷类双功能修饰酶体外代谢模型，其中氨基糖苷类抗生素包括天然的和半合成的氨基糖苷类抗生素。
本发明所述的氨基糖苷类双功能修饰酶体外代谢模型，其中步骤(2)中孵育体系为磷酸化反应测试组每100μL体系中含1～100μmolTris.Cl(pH7.5～8.0)，0.1～10.0μmol MgCl2，0.1～10.0μmol Na2HPO4，0.1～10.0μmolATP，5～500nmol氨基糖苷类抗生素，1～20μL酶提取物；磷酸化反应对照组每100μL体系中含1～100μmol Tris.Cl(pH7.5～8.0)，0.1～10.0μmol MgCl2，0.1～10.0μmol Na2HPO4，5～500nmol氨基糖苷类抗生素，1～20μL酶提取物；乙酰化反应测试组每100μL体系中含1～100μmol Tris.Cl(pH7.0～7.8)，0.1～10.0μmol MgCl2，10～500nmol acetyl CoA，5～500nmol氨基糖苷类抗生素，1～20μL酶提取物；乙酰化反应对照组每100μL体系中含1～100μmolTris.Cl(pH7.0～7.8)，0.1～10.0μmol MgCl2，5～500nmol氨基糖苷类抗生素，1～20μL酶提取物；孵育温度为30～40℃，孵育时间为0.5～24小时。
本发明所述的氨基糖苷类双功能修饰酶体外代谢模型，其中衍生化试剂选自邻苯二甲醛、丹磺酰氯、1-氟-2，4-二硝基苯、9-芴基甲基氯甲酸酯、异硫氰酸苯酯中的一种或多种。优选地，所述的衍生化试剂为邻苯二甲醛衍生化试剂。
本发明所述的氨基糖苷类双功能修饰酶体外代谢模型，其中高效液相检测条件为色谱柱为C8或C18反相色谱柱(150～250×3.9～4.6mm，4～10μm)；流动相为甲醇∶水∶冰醋酸＝50～75∶20～45∶5(体积/体积)，其中加入庚烷磺酸钠1～5g/L，或为甲醇∶10～500mM醋酸盐(pH3.0～7.5)＝80～20∶20～80(体积/体积)；流速为0.5～2.0mL/min；柱温为30～50℃；检测波长为300～400nm。
本发明所述的氨基糖苷类双功能修饰酶体外代谢模型，在高效液相色谱检测后，分别比较磷酸化反应测试组和磷酸化反应对照组，乙酰化反应测试组和乙酰化反应对照组，计算抗生素的被修饰百分率，评价氨基糖苷类抗生素对双功能修饰酶的稳定性。相同条件下，被修饰百分率越高，稳定性越差。
在本发明中，通过如下公式计算氨基糖苷类抗生素的被修饰百分率
M%=(Ac-At)AC×100%]]>其中M为抗生素的被修饰百分率，Ac为对照组中测得的抗生素峰面积，At为测试组中测得的抗生素峰面积。
本发明所述的氨基糖苷类双功能修饰酶体外代谢模型在筛选氨基糖苷类双功能修饰酶稳定性抗生素和氨基糖苷类双功能修饰酶抑制剂中的应用。
(三)有益效果本发明所述的氨基糖苷类双功能修饰酶体外代谢模型具备以下优点(1)本发明应用PCR和DNA重组技术，得到含氨基糖苷类双功能修饰酶基因aac(6′)-aph(2″)的重组大肠埃希氏菌，可以快速、大量制备高含量的重组氨基糖苷类双功能修饰酶，该酶同时具有乙酰化和磷酸化两种修饰作用，满足研究抗生素体外代谢的需要；(2)本发明建立的氨基糖苷类双功能修饰酶体外代谢模型具有方法简便、快速、准确、自动化程度高的特点，并可区分原型和代谢产物，根据抗生素代谢与结构的关系，可以为抗生素结构修饰提供依据。
(3)本发明建立的氨基糖苷类双功能修饰酶体外代谢模型既可用于高通量筛选对双功能修饰酶稳定的氨基糖苷类抗生素和双功能修饰酶抑制剂，又可用于评价新药对双功能修饰酶的稳定性。
本发明所述的重组大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC1667，保藏日期为2006年04月05日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC1667。
图1重组质粒pET-30a-aac(6′)-aph(2″)的图谱，其中黑色的部分表示氨基糖苷类双功能修饰酶基因aac(6′)-aph(2″)；图2威大霉素(VDM)磷酸化反应测试组高效液相色谱检测图谱，对应实施例10，其中横坐标表示时间，纵坐标表示电压，1为威大霉素峰，2为威大霉素磷酸化反应后的产物峰；图3威大霉素(VDM)磷酸化反应对照组高效液相色谱检测图谱，对应实施例10，其中横坐标表示时间，纵坐标表示电压，1为威大霉素峰；图4威替米星(VTM)磷酸化反应测试组高效液相色谱检测图谱，对应实施例10，其中横坐标表示时间，纵坐标表示电压，1为威替米星峰，2为威替米星磷酸化反应后的产物峰；图5威替米星(VTM)磷酸化反应对照组高效液相色谱检测图谱，对应实施例10，其中横坐标表示时间，纵坐标表示电压，1为威替米星峰；图6威大霉素(VDM)乙酰化反应测试组高效液相色谱检测图谱，对应实施例11，其中横坐标表示时间，纵坐标表示电压，1为威大霉素峰，2、3为威大霉素乙酰化反应后的产物峰；图7威大霉素(VDM)乙酰化反应对照组高效液相色谱检测图谱，对应实施例11，其中横坐标表示时间，纵坐标表示电压，1为威大霉素峰；图8威替米星(VTM)乙酰化反应测试组高效液相色谱检测图谱，对应实施例11，其中横坐标表示时间，纵坐标表示电压，1为威替米星峰，2、3为威替米星乙酰化反应后的产物峰；图9威替米星(VTM)乙酰化反应对照组高效液相色谱检测图谱，对应实施例11，其中横坐标表示时间，纵坐标表示电压，1为威替米星峰。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1双功能修饰酶基因aac(6′)-aph(2″)的克隆(1)从临床分离E.faecalis HH22中提取总DNA将E.faecalis HH22接种于含15μg/mL庆大霉素的脑心汤培养基中，200rpm振荡培养过夜，离心2.5mL菌液富集菌体，用500μLSTE洗涤沉淀2次，而后加入500μL STE重悬菌体，加入溶菌酶至终浓度2mg/mL，37℃保温1h，然后加入250μL的2％SDS溶液，振荡混匀，加入终浓度为200μg/mL的蛋白酶K溶液，55℃温浴30min，酚/氯仿/异戊醇抽提至无变性蛋白存在。上清加入1/10体积的3M NaAc、等体积异丙醇，常温下沉淀基因组DNA。
(2)PCR扩增目的基因将步骤(1)所获得的E.faecalis HH22的基因组DNA作为PCR的模板。根据基因组数据库中双功能修饰酶基因的序列数据，设计引物引物15’-TCCCAT ATG AAT ATA GTT GAA ATG-3’；引物25’-CCT CGA GAT CTT TATAAG TCC TTT-3’，扩增得到双功能修饰酶基因aac(6′)-aph(2″)，同时引入酶切位点NdeI(CATATG)和XhoI(CTCGAG)。
实施例2目的DNA片段的克隆、测序分析(1)将所得的双功能修饰酶基因aac(6′)-aph(2″)TA克隆于pGEM-T载体用DNA纯化试剂盒将实施例1所获得的双功能修饰酶基因aac(6′)-aph(2″)纯化，并用Taq酶对回收的PCR产物进行末端加A反应，然后将加A产物与pGEM-T载体进行连接反应，得到连接产物。
(2)制备感受态细胞挑单菌落接种于2mL LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜；将0.5mL过夜培养物接种于50mL LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养至OD600＝0.3；培养物冰浴10min，4℃、4100rpm离心10min，沉淀用0.6倍体积的冰预冷的CaCl2洗一次，而后加入0.04倍体积的冰预冷的CaCl2悬浮，置于冰上待用。
(3)连接产物转化TG1感受态细胞向10μL连接产物中加入100μL感受态细胞混匀，冰浴20min，之后42℃水浴热击50S，再迅速移至冰浴中冷却2min，然后加入900μL LB培养基，37℃、150rpm振荡培养1.5h，取菌液涂布氨苄/IPTG/X-gal平皿，37℃过夜培养，挑取白斑，并提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确的送测序公司测序。
实施例3双功能修饰酶基因蛋白表达载体的构建(1)目的片段连接入表达载体利用目的DNA片段克隆时引入的酶切位点NdeI、XhoI，将其从pGEM-T载体上切下来，连接到经相同酶处理后的蛋白表达载体pET-30a(+)上，转化至实施例2中所述方法获得的CaCl2法制备的DH5α感受态细胞，涂布卡那霉素抗性平板，挑选阳性克隆，并提取质粒酶切鉴定，并送测序公司测序。
(2)转化表达宿主用构建好的蛋白表达质粒pET-30a-aac(6′)-aph(2″)转化用实施例2所述方法制备的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞；涂布卡那霉素抗性平板，筛选阳性克隆，并提取质粒酶切鉴定，得大肠杆菌CGMCC1667。
实施例4氨基糖苷类双功能修饰酶提取物的制备(1)目的蛋白的诱导表达将含有质粒pET-30a-aac(6′)-aph(2″)的大肠杆菌CGMCC1667接种于含50μg/mL卡那霉素的2mL TB液体培养基中，37℃活化过夜；按1∶50的比例将过夜培养物转种于50mL卡那霉素抗性TB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养至OD600＝0.6，加入终浓度为1mM的IPTG，37℃、200rpm振荡培养6h，诱导蛋白表达，并用SDS-PAGE电泳检测。
(2)制备酶提取物将诱导表达的菌液4℃离心收集菌体，用0.85％NaCl洗涤2次，加入0.4倍体积的冰冷裂解缓冲液[20mM Tris.Cl(pH7.6)，1mM EDTA(pH 8.0)，2mMDTT]悬浮菌体，加入溶菌酶至2mg/mL，冰上放置30min，超声(超声1S，间歇4S，共破碎1min，此时有少量完整细胞存在)破碎，4℃，12000g×1h离心，上清液即为酶提取物。
实施例5邻苯二甲醛衍生化试剂的配制称量邻苯二甲醛100mg，用0.5mL甲醇溶解，然后加入0.4M硼酸(调pH至10.4)9.5mL，巯基乙酸0.2mL，混匀即可。
实施例6检测威大霉素(VDM)对氨基糖苷类双功能修饰酶的稳定性(1)取实施例4制备的氨基糖苷类双功能修饰酶提取物，与威大霉素(VDM)在如下孵育体系中进行磷酸化反应磷酸化反应测试组(100μL体系)1μmol Tris.Cl(pH7.5)，0.1μmol MgCl2，0.1μmol Na2HPO4，0.1μmol ATP，5nmol威大霉素，1μL酶提取物；磷酸化反应对照组(100μL体系)1μmol Tris.Cl(pH7.5)，0.1μmol MgCl2，0.1μmol Na2HPO4，5nmol威大霉素，1μL酶提取物；孵育温度为30℃，孵育时间为0.5小时。
(2)高效液相色谱检测，计算抗生素的被修饰百分率取步骤(1)中得到的反应混合物100μL，加异丙醇100μL，邻苯二甲醛衍生化试剂100μL，在25℃衍生化5分钟，离心，取上清进行高效液相检测。
高效液相色谱检测条件为色谱柱为C8反相色谱柱(150×3.9mm，4μm)；流动相为甲醇∶水∶冰醋酸＝50∶20∶5，加庚烷磺酸钠1g/L；流速为0.5mL/min；柱温为30℃；检测波长为300nm。
比较磷酸化反应测试组和磷酸化反应对照组，用如下公式计算威大霉素的被修饰百分率M%=(Ac-At)AC×100%]]>结果被修饰百分率为67.87％。
实施例7检测威大霉素(VDM)对氨基糖苷类双功能修饰酶的稳定性(1)取实施例4制备的氨基糖苷类双功能修饰酶提取物，与威大霉素(VDM)在如下孵育体系中进行乙酰化反应乙酰化反应测试组(100μL体系)1μmol Tris.Cl(pH7.0)，0.1μmol MgCl2，10nmol acetyl CoA，5nmol威大霉素，1μL酶提取物；乙酰化反应对照组1μmol Tris.Cl(pH7.0)，0.1μmol MgCl2，5nmol威大霉素，1μL酶提取物；孵育温度为40℃，孵育时间为24小时。
(2)进行高效液相色谱检测，计算抗生素的被修饰百分率取步骤(1)中得到的反应混合物100μL，加入异丙醇100μL和邻苯二甲醛衍生化试剂100μL，在25℃衍生化5分钟，离心，取上清进行高效液相色谱检测。
高效液相色谱检测条件为色谱柱为C8反相色谱柱(150×3.9mm，4μm)；流动相为甲醇∶水∶冰醋酸＝50∶20∶5，加庚烷磺酸钠1g/L；流速为0.5mL/min；柱温为30℃；检测波长为300nm。
比较乙酰化反应测试组和乙酰化反应对照组，用如下公式计算威大霉素的被修饰百分率M%=(Ac-At)AC×100%]]>结果被修饰百分率为46.32％。
实施例8检测奈替米星(NTM)对氨基糖苷类双功能修饰酶的稳定性(1)取实施例4制备的氨基糖苷类双功能修饰酶提取物，与奈替米星(NTM)在如下孵育体系中进行磷酸化反应磷酸化反应测试组(100μL体系)100μmol Tris.Cl(pH8.0)，10.0μmolMgCl2，10.0μmol Na2HPO4，10.0μmol ATP，500nmol奈替米星(NTM)，20μL酶提取物；磷酸化反应对照组(100μL体系)100μmol Tris.Cl(pH8.0)，10.0μmolMgCl2，10.0μmol Na2HPO4，500nmol奈替米星(NTM)，20μL酶提取物；孵育温度为30℃，孵育时间为10小时(2)高效液相色谱检测，计算抗生素的被修饰百分率取步骤(1)中得到的反应混合物20μL，加入异丙醇20μL和邻苯二甲醛衍生化试剂20μL，在70℃衍生化30分钟，离心，取上清进行高效液相检测。
高效液相色谱检测条件为色谱柱为C18反相色谱柱(250×4.6mm，10μm)；流动相为甲醇∶500mM醋酸钠(pH3.0)＝80∶20；流速为2.0mL/min；柱温为50℃；检测波长为400nm。
比较磷酸化反应测试组和磷酸化反应对照组，用如下公式计算奈替米星的被修饰百分率M%=(Ac-At)AC×100%]]>结果被修饰百分率为18.22％。
实施例9检测奈替米星(NTM)对氨基糖苷类双功能修饰酶的稳定性(1)取实施例4制备的氨基糖苷类双功能修饰酶提取物，与奈替米星(NTM)在如下孵育体系中进行乙酰化反应乙酰化反应测试组(100μL体系)100μmol Tris.Cl(pH7.8)，10.0μmolMgCl2，500nmol acetyl CoA，500nmol奈替米星，20μL酶提取物；乙酰化反应对照组100μmol Tris.Cl(pH7.8)，10.0μmol MgCl2，500nmol奈替米星，20μL酶提取物；孵育温度为30℃，孵育时间为10小时。
(2)高效液相色谱检测，计算抗生素的被修饰百分率取步骤(1)中得到的反应混合物20μL，加入异丙醇20μL和邻苯二甲醛衍生化试剂20μL，在70℃衍生化30分钟，离心，取上清进行高效液相检测。
高效液相色谱检测条件为色谱柱为C18反相色谱柱(250×4.6mm，10μm)；流动相为甲醇∶500mM醋酸钾(pH3.0)＝80∶20；流速为2.0mL/min；柱温为50℃；检测波长为400nm。
比较乙酰化反应测试组和乙酰化反应对照组，用如下公式计算奈替米星的被修饰百分率M%=(Ac-At)AC×100%]]>结果被修饰百分率为34.58％。
实施例10威大霉素(VDM)和威替米星(VTM)对氨基糖苷类双功能修饰酶的稳定性比较(1)取实施例4制备的氨基糖苷类双功能修饰酶提取物，分别与威大霉素(VDM)和威替米星(VTM)在如下孵育体系中进行磷酸化反应磷酸化反应测试组的组成为
磷酸化反应对照组不加ATP，用1.4μL的ddH2O代替。
孵育温度为37℃，孵育时间为13h。
(2)高效液相色谱检测，计算抗生素的被修饰百分率取步骤(1)中得到的反应混合物50μL，加入异丙醇50μL和邻苯二甲醛衍生化试剂50μL，在60℃衍生化10分钟，离心，取上清进行高效液相检测。
高效液相色谱检测条件为色谱柱为C18反相色谱柱(150×3.9mm，4μm)；流动相为甲醇∶50mM醋酸铵(pH5.0)＝60∶40；流速为1.0mL/min；柱温为35℃；检测波长为330nm。
比较磷酸化反应测试组和磷酸化反应对照组，用如下公式计算抗生素的被修饰百分率M%=(Ac-At)AC×100%]]>结果如下
由结果可见，对氨基糖苷类双功能修饰酶磷酸化活性的稳定性顺序为
威替米星＞威大霉素。
观察高效液相检测的图谱发现，威大霉素测试组(附图2)与对照组(附图3)相比，威大霉素峰1显著降低，并且出现大的磷酸化反应后产物峰2，说明威大霉素被磷酸化的百分率大，稳定性差；而威替米星测试组(附图4)与对照组(附图5)相比，威替米星峰降低的幅度小，并且只出现了很小的磷酸化反应后产物峰2，说明威替米星被磷酸化的百分率很小，稳定性好。
实施例11威大霉素(VDM)和威替米星(VTM)对氨基糖苷类双功能修饰酶的稳定性比较(1)取实施例4制备的氨基糖苷类双功能修饰酶提取物，与威大霉素(VDM)和威替米星(VTM)在如下孵育体系中进行乙酰化反应乙酰化反应测试组的组成为
乙酰化反应对照组不加acetyl CoA，用6.5μL ddH2O代替。
孵育温度为37℃，孵育时间为13h。
(2)高效液相色谱检测，计算抗生素的被修饰百分率取步骤(1)中得到的反应混合物50μL，加入异丙醇50μL和邻苯二甲醛衍生化试剂50μL，在60℃衍生化10分钟，离心，取上清进行高效液相检测。
高效液相色谱检测条件为色谱柱为C18反相色谱柱(150×3.9mm，4μm)；流动相为甲醇∶50mM醋酸铵(pH5.0)＝60∶40；流速为1.0mL/min；柱温为35℃；检测波长为330nm。
比较乙酰化反应测试组和乙酰化反应对照组，用如下公式计算抗生素的被修饰百分率
M%=(Ac-At)AC×100%]]>结果如下
由结果可见，对氨基糖苷类双功能修饰酶乙酰化活性的稳定性顺序为威替米星＞威大霉素。
观察高效液相检测的图谱发现，威大霉素测试组(附图6)与对照组(附图7)相比，威大霉素峰1明显降低，并且出现较大的乙酰化反应后产物峰2和3，说明威大霉素被乙酰化的百分率较大，稳定性较差；而威替米星测试组(附图8)与对照组(附图9)相比，威替米星峰降低的幅度小，并且只出现了很小的乙酰化反应后产物峰2和3，说明威替米星被乙酰化的百分率小，稳定性好。
序列表<110>中国医学科学院医药生物技术研究所<120>氨基糖苷类双功能修饰酶基因aac(6′)-aph(2″)<130>重组氨基糖苷类双功能修饰酶体外代谢模型及其应用<160>1<170>Patent In version 3.3<210>1<211>1440<212>DNA<213>Escherichia coli<400>1atgaatatag ttgaaaatga aatatgtata agaactttaa tagatgatga ttttcctttg60atgttaaaat ggttaactga tgaaagagta ttagaatttt atggtggtag agataaaaaa120tatacattag aatcattaaa aaaacattat acagagcctt gggaagatga agtttttaga180gtaattattg aatataacaa tgttcctatt ggatatggac aaatatataa aatgtatgat240gagttatata ctgattatca ttatccaaaa actgatgaga tagtctatgg tatggatcaa300tttataggag agccaaatta ttggagtaaa ggaattggta caagatatat taaattgatt360
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权利要求
1.一种重组大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC1667，其特征在于它含有重组质粒pET-30a-aac(6′)-aph(2″)，该质粒上插有氨基糖苷类双功能修饰酶基因aac(6′)-aph(2″)。
2.一种根据权利要求1所述的重组大肠埃希氏菌诱导表达得到的氨基糖苷类双功能修饰酶。
3.一种重组氨基糖苷类双功能修饰酶体外代谢模型，它包括以下步骤(1)用权利要求1所述的重组大肠埃希氏菌诱导表达氨基糖苷类双功能修饰酶，制备酶提取物；(2)酶提取物和氨基糖苷类抗生素在孵育体系中进行磷酸化或乙酰化反应；(3)取步骤(2)中得到的反应混合物用衍生化试剂进行衍生化，离心，取上清进行高效液相色谱检测，计算氨基糖苷类抗生素的被修饰百分率，评价其对双功能修饰酶的稳定性。
4.根据权利要求3所述的模型，其特征在于所述的氨基糖苷类抗生素包括天然的和半合成的氨基糖苷类抗生素。
5.根据权利要求3所述的模型，其特征在于在步骤(2)中的孵育体系为磷酸化反应测试组每100μL体系中含1～100μmol Tris.Cl，0.1～10.0μmolMgCl2，0.1～10.0μmol Na2HPO4，0.1～10.0μmol ATP，5～500nmol氨基糖苷类抗生素，1～20μL酶提取物；磷酸化反应对照组每100μL体系中含1～100μmolTris.Cl，0.1～10.0μmol MgCl2，0.1～10.0μmol Na2HPO4，5～500nmol氨基糖苷类抗生素，1～20μL酶提取物；乙酰化反应测试组每100μL体系中含1～100μmol Tris.Cl，0.1～10.0μmol MgCl2，10～500nmol acetyl CoA，5～500nmol氨基糖苷类抗生素，1～20μL酶提取物；乙酰化反应对照组每100μL体系中含1～100μmol Tris.Cl，0.1～10.0μmol MgCl2，5～500nmol氨基糖苷类抗生素，1～20μL酶提取物；孵育温度为30～40℃，孵育时间为0.5～24小时。
6.根据权利要求3所述的模型，其特征在于所述的衍生化试剂选自邻苯二甲醛、丹磺酰氯、1-氟-2，4-二硝基苯、9-芴基甲基氯甲酸酯、异硫氰酸苯酯中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的模型，其特征在于所述的衍生化试剂为邻苯二甲醛衍生化试剂。
8.根据权利要求3所述的模型，其特征在于步骤(3)中高效液相色谱检测条件为色谱柱为C8或C18反相色谱柱；流动相为甲醇∶水∶冰醋酸＝50～75∶20～45∶5(体积/体积)，其中加入庚烷磺酸钠1～5g/L，或为甲醇10～500mM醋酸盐＝80～20∶20～80(体积/体积)；流速为0.5～2.0mL/min；柱温为30～50℃；检测波长为300～400nm。
9.根据权利要求3所述的模型在筛选氨基糖苷类双功能修饰酶稳定性抗生素和氨基糖苷类双功能修饰酶抑制剂中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种重组大肠埃希氏菌CGMCC1667及由其诱导表达得到的重组氨基糖苷类双功能修饰酶，还提供了一种重组氨基糖苷类双功能修饰酶的体外代谢模型，并公开了这种模型在筛选氨基糖苷类双功能修饰酶稳定性抗生素和氨基糖苷类双功能修饰酶抑制剂中的应用。本发明所述的模型可同时研究重组双功能修饰酶对抗生素的乙酰化和磷酸化两种修饰作用，具有方法简便、快速、准确、自动化程度高的特点，并可区分原型和代谢产物，既可用于高通量筛选对双功能修饰酶稳定的新氨基糖苷类抗生素和双功能修饰酶抑制剂，又可用于评价新药对双功能修饰酶的稳定性。
文档编号C12N15/54GK101078007SQ20061008150
公开日2007年11月28日 申请日期2006年5月24日 优先权日2006年5月24日
发明者游雪甫, 李聪然, 蒋建东, 杨信怡, 洪斌, 王跃明, 肖春玲, 孙承航 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所