专利名称：：含有效成分聚-γ-谷氨酸的透明质酸酶抑制剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种含有活性成分为聚-，谷氨酸(PGA)的透明质酸酶抑制剂，和一种用于保持皮肤弹性的化妆品混合物以及一种用于改善过敏性的混合物，其特征在于，每种混合物都含有作为活性成分的PGA。
背景技术：
：透明质酸酶属于透明质酸水解酶家族。它们是碳水化合物消化酶，其可以裂解碳水化合物的糖苷键，也叫"粘蛋白酶或扩散因子"。透明质酸酶的种类包括内切氨基己糖苷酶(endohexosaminidase)类型、内切葡萄糖醛酸酶(endoglucuronidase)类型、内切氨基己糖裂解酶(endohexosaminecleavage)类型以及内切氨基葡萄糖裂解酶(endoglucosaminecleavage)类型。这些透明质酸酶存在于高等动物的睾丸或精子、肝脏溶酶体、蛇毒液、肺炎克雷伯菌C脸Zw/e〃a/"e訓画'"eJ或者链球菌n，ococcw51)当中。同时，皮肤结缔组织包括胶原蛋白、透明质酸多糖等等。透明质酸酶是一种降解透明质酸的酶，并且透明质酸酶的活性化会导致皮肤结缔组织中透明质酸的降解，从而使皮肤结缔组织疏松并导致皮肤失去弹性和产生皱纹。在防止皮肤结缔组织疏松的现有技术中，其中有一种方法为用维生素A、C、E等处理皮肤以刺激胶原蛋白的合成并防止皮肤氧化。然而，该方法的缺点在于，所用维生素不仅价格昂贵而且其在外部环境中容易被降解且很难长期保存。也有提出直接用胶原蛋白处理皮肤或口服胶原蛋白，但该方法疗效没有得到证实。另有一种方法为用植物提取物处理皮肤，诸如槟榔、丹皮等，这种提取物具有透明质酸酶抑制作用。然而，该方法具有经济效益低的缺点，因为其不仅要培育植物而且要从培育的植物中提取活性成分。同时，PGA是一种由D、L-谷氨酸与，谷氨酰结合的粘液质聚合物，该聚合物从微生物中产生。尤其是从芽孢杆菌(gem/s5船7/w^菌株中产生，该菌株是从大豆酱(Chungkookjang采用稻草制备的韩国传统大豆发酵食品)、纳豆(Natto日本传统大豆发酵食品)、可尼玛(Kinema尼泊尔制造的大豆发酵食品)等中分离得到。由芽孢杆菌(gem^Sac///^)菌株所产生的PGA是一种具有可食用性、水溶性、带阴离子的且可生物降解的聚合物。该聚合物可用作湿润剂、保湿剂以及其它化妆品的原材料。近来，发达国家广泛开展了PGA用途的研究，如通过酯化反应发展PGA新材料来替代不可降解聚合物和耐热塑料的研究以及用PGA生产水溶性纤维及膜的研究。此外，关于PGA的研究报道包括锰离子对产生PGA的影响、通过超声降解法把PGA用作水溶性聚合物以及通过合成酯类衍生物法开发低水溶性塑料(Biosci.Biotechnol.Biochem.,60:1239,1996)。在关于PGA用途的现有专利中，日本专利特许公开文本平6-32742公开了利用枯草芽胞杆菌(^ac///^产生PGA的方法，以及该PGA在治疗骨质疏松症疗效的健康食品中应用，例如钙溶剂。欧洲专利838160公开了PGA具有通过降低水中磷的含量来降低水污染的功效。同样地，日本专利特许公开本文平10-251402、7-300522以及6-322358公开了通过放射物辐射利用PGA来制备的具有吸收性及生物降解性的树脂在卫生用品(例如尿布)、食品以及园艺中的应用，上述树脂具有具有高胶凝率和高吸水性。同样，通过溶解、沉淀和干燥利用PGA制备固化的生物可降解纤维、薄膜、或模型制品也已经公开了(日本专利特许公开文本平7-138364和5-117388)。此外，把PGA用作药物载体的聚合物也已经公开了(日本专利特许公开文本平6-92870和6-256220)。同时，本发明人获得了一项关于生产PGA方法的发明专利，该发明利用枯草芽胞杆菌变种大豆酱(Sad〃Mw6"/"ww:c/zw"gbo^wg)产生高分子量的PGA(韩国专利注册号500,796)。我们也获得了关于含有PGA的抗癌混合物、免疫佐剂和免疫强化剂的专利(韩国专利注册号496,606;517,114和475,406)。此外，我们已在进行PGA其它用途的研究。由此，本发明人已经作了大量努力来寻找具有上述各种作用PGA的其它用途，结果，发现PGA可对降解透明质酸的透明质酸酶产生抑制作用。由于透明质酸是皮肤结缔组织的组成成分，所以PGA不仅有助于保持皮肤弹性，而且PGA本身具有良好的保湿性和加湿性能以及优良的皮肤接受性，由此才产生了本发明。
发明内容本发明的主要目的在于提供一种含有活性成分PGA的透明质酸酶抑制剂。本发明的另一目的在于提供一种能够保持皮肤弹性的化妆品混合物，该混合物含作为活性成分的PGA。本发明的又一目的在于提供一种改善过敏性的混合物，该混合物含有作为活性成分的PGA。通过下列详细描述和附图将更清楚地理解本发明的其它特征和实施方式。图1显示PGA的透明质酸酶抑制活性的示意图。具体实施例方式一方面，本发明提供一种含有活性成分PGA的透明质酸酶抑制剂。本发明中的PGA不仅能抑制透明质酸酶来防止皮肤结缔组织变松散，并且它本身具有良好的皮肤适应性、保湿及加湿性。另一方面，本发明提供了一种用于保持皮肤弹性的功能性化妆品混合物，其含有作为活性成分的PGA。本发明中的化妆品混合物可以是选自下列物质中的任一种保湿剂、乳液、精华素和洁面乳。本发明中的PGA能通过抑制透明质酸酶的活性来减轻过敏症状，其随着皮肤炎症发展而被活性化从而分解皮肤组织结构并提高炎症细胞通透性。另一方面，本发明提供一种用于改善过敏性的混合物，混合物中含有作为活性成分的PGA。本发明用于改善过敏性的混合物可以从下列物质组中任一种选择保湿剂、乳液、精华素、洁面乳、洗发水、沐浴露，以及沐浴治疗品。本发明中，已经发现分子量为50kDa、2000kDa和4000kDa的PGA都具有很高的透明质酸酶抑制活性，并在各种浓度下对透明质酸酶显示出相似的抑制模型。这说明分子量在50kDa和4000kDa之间的PGA都具有相似的透明质酸酶抑制活性，抑制效果并不受其分子量的影响。因此，本和发明中所用PGA的分子量在lkDa和10000kDa之间。本发明中所用的PGA是通过化学合成或微生物发酵的方法来产生的，优选通过微生物发酵法，其中更优选通过枯草芽胞杆菌变种大豆酱swZ)〃7/sc/w"gA:oo^/awgJ发酵法。实施例下文将通过具体实施例对本发明作详细描述。然而对于本领域技术人员来说，很明显这些实施例仅仅用于说明性的目的而并非用来限制本发明的范围。实施例hPGA的生产1%的枯草芽胞杆菌变种大豆酱(5ac/〃wsswZ)〃fcvar.c/nmg^o&'flwgKCTC0697BP)培养液接种到3L用于生产PGA的基本培养基中(含5%L-谷氨酸的GS培养基5%葡萄糖、1%(NH4)2S04、0.27%KH2P04、0.42%Na2HP04'12H20、0.05%NaCl、0.3%MgS04'7H20、lml/1维生素溶液、pH6.8)，然后在搅拌速度为150rpm、通气量为lwm及温度37°C下培养72小时。然后，向培养基中加入2N硫酸溶液直到pH为3，从而获得含PGA的样品溶液。含PGA的样品溶液在4。C中保持IO小时以除去发酵液中的多糖，加入发酵液体积2倍的乙醇并充分混合。该混合液在4°C中保持10小时，随后通过离心收集PGA沉淀物。所收集的沉淀物溶解在蒸馏水中并向其中加入100ug/ml蛋白酶。所得的PGA样品在37°C的孵化器中放置6小时以降解存在于PGA样品中的胞外蛋白质。所得样品在足够量的蒸馏水中透析以除去游离的谷氨酸并随后浓縮以获得纯PGA。利用GPC(凝胶渗透柱)测定所得PGA的分子量并根据分子量进行分离，收集分子量分别为50kDa、2000kDa和4000kDa的PGAs。分析所收集的PGAs对透明质酸酶的抑制作用。实施例2:PGAs的透明质酸酶抑制活性根据实施例1所获得的分子量为50kDa、2000kDa和4000kDa的每种PGAs溶解成浓度为1%。添加400单位/ml透明质酸酶，将每种PGA溶液加调成PGA浓度为0.002%、0.003%、0.004%、0.006%及0.008%，随后在37°C下与透明质酸酶反应20分钟。然后，向与PGA反应的透明质酸酶溶液中添加0.1mg/ml作为活性化剂的化合物48/80、2.5mMCaCl2禾P0.15MNaCl，该混合物在37°C下反应20分钟。向反应溶液中添加0.4mg/ml的透明质酸并在37。C下反应20分钟。然后，通过添加0.4NNaOH终止反应。向反应溶液中添加3mllX的p-DABA(p-二甲氨基苯甲醛)并在37°C下反应20分钟。然后，在吸光度585nm下，利用摩尔根-埃尔森法(Moegan-Elson)测定反应溶液的酶活性。PGA对透明质酸酶活性的抑制作用百分数通过计算和PGA反应的透明质酸酶溶液酶活性与未和PGA反应的透明质酸溶液酶活性的比率来确定(NakoiFujitani，J.Appl.Phycol.,13:489，2001)。抑制百分数(％)={1-(与PGA反应的透明质酸酶溶液的吸光度-与PGA反应的透明质酸酶溶液的空白吸光度/未与PGA反应的透明质酸酶溶液的吸光度-未与PGA反应的透明质酸酶溶液的空白吸光度)》X100。结果，如图1所示，分子量为50-4000kDa的PGAs具有相似的透明质酸酶抑制活性，而不受其分子量大小的影响。此外，它们的IC5o值显示为0.0025%而在浓度为0.008%的PGA溶液中抑制活性显示为100%。配方在下文中，将描述本发明关于保湿剂(皮肤)、洗液(乳液)和洗发水的配方，但包含创造性化妆品混合物在内的配方并不限于此。配方1:含PGA保湿剂混合物的制备0.05g聚吡咯垸酮、O.lg油醇、0.2g聚氧乙烯单油酸酯、0.2g香精、O.lg羟基苯甲酸甲酯和少量抗氧化剂混合并在8g95%乙醇中溶解。将该混合溶液与含0.4g50kDaPGA和5g甘油溶液溶解于85.33g纯水中，并充分混合和搅拌，由此制备能改善皮肤弹性的保湿剂。配方2:含PGA洗液(乳液)的制备1.2g乙醇、10g海鲛油、2g凡士林、0.2g羟基苯甲酸乙酯、lg单硬脂酸甘油酯、lg聚氧乙烯(20M)单油酸酯和0.1g香精混合并在70。C下加热溶解。在70°C下加热溶解0.4g2000kDaPGA、5g二丙二醇、2g聚乙二醇1500、0.2g三乙醇胺和76,2g纯水。混合这两种溶液，并冷却所得乳状液，由此制备具有改善皮肤弹性的水包油洗液。配方3:含PGA洗发水的制备15g月桂基硫酸钠、10g十二醇硫酸钠、5g椰油酰胺丙基三甲铵乙内酯(cocamidopropylenebetaine)、0.lg乙二胺四乙酸钠和3g三甲铵乙内酯混合。向混合液中加入0.4g4000kDaPGA和66.5g纯水并溶解，由此制备具有改善过敏性的洗发水。实施例3:含PGA的化妆品和混合物用于改善过敏性的敏感性测试(1)皮肤弹性的提高1.测试方法(i)测试对象50名30-50岁妇女(对照组25个人；配方1和2测试组25人)。(ii)所测试的混合物测试组使用配方1和2的保湿剂和洗液，对照组使用具有和配方1和2相同组成成分但不含PGA的保湿剂和洗液。(iii)测试时期2个月(2005年5月到2005年6月)2.结果测试含PGA混合物的测试组的25个人中，有22人皮肤情况得到了改善。表1:含PGA混合物的功能性测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(2)过敏性的改善1.测试方法(i)测试对象:30名患异位性皮肤炎症的小孩(年纪小于13岁)。对照组15人；测试配方3的测试组15人。(ii)所测试的混合物测试组使用配方3所配制的洗发水，对照组使用具有和配方3相同组成成分但不含PGA的混合物。(iii)测试时间2个月(2005年5月-2005年6月)2.结果测试含洗发水的测试组中15人中的8人的多种症状都有了效果，例如痒感减轻等。表2:含PGA洗发水的功能性测试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>虽然上文已对本发明的特定实施方式作了具体描述，但是本领域技术人员可知这些描述仅仅是为了给出优选实施方式而并不解释为对本发明范围的限定。相应地，本发明的实质性范围由所附权利要求及其等同实施方式来限定。工业实用性如上所述，本发明提供含有效成分为PGA的透明质酸酶抑制剂、保持皮肤弹性的混合物和改善过敏性的混合物，其特征在于，每种混合物都含有效成分PGA。含PGA的独创混合物通过抑制透明质酸酶的活性从而有效保持皮肤湿润和皮肤弹性，所述透明质酸酶为降解皮肤真皮组织中透明质酸的酶。同样，该混合物也能够通过抑制炎症细胞的通透性从而减轻过敏症状。权利要求1、一种含有活性成分聚-γ-谷氨酸(PGA)的透明质酸酶抑制剂。2、根据权利要求1所述的透明质酸酶抑制剂，其特征在于，PGA的分子量为l-10,000kDa。3、一种用于保持皮肤弹性的功能性化妆品混合物，其特征在于，含有作为活性成分的聚-Y-谷氨酸(PGA)。4、根据权利要求3所述的用于保持皮肤弹性的功能性化妆品混合物，其特征在于，PGA的分子量为l-10,000kDa。5、根据权利要求3所述的用于保持皮肤弹性的功能性化妆品混合物，其特征在于，可以是选自如下组中的任一种保湿剂、乳液、精华素和洁面乳。6、一种用于改善过敏性的混合物，其特征在于，含有作为活性成分的聚-Y-谷氨酸(PGA)。7、根据权利要求6所述的用于改善过敏性的混合物，其特征在于，PGA的分子量为l-10,000kDa。8、根据权利要求6所述的用于改善过敏性的混合物，其特征在于，可以是选自如下组中的任一种保湿剂、乳液、精华素、洁面乳、洗发水、沐浴露、以及(沐浴治疗品)。全文摘要本发明涉及一种含有效成分聚-γ-谷氨酸(PGA)的透明质酸酶抑制剂，一种用于保持皮肤弹性的混合物以及一种用于改善过敏性的混合物，其特征在于，每种混合物都含有作为有效成分的PGA。该含有PGA的独创性混合物可以通过抑制透明质酸酶的活性来有效保持皮肤湿润和皮肤弹性，其中所述透明质酸酶是降解存在于皮肤真皮层中的透明质酸的酶。同样，该混合物也能够通过抑制炎症细胞的通透性来减轻过敏症状。文档编号A61K8/00GK101304724SQ200580051876公开日2008年11月12日申请日期2005年10月31日优先权日2005年10月20日发明者宇山浩,崔在喆,成文喜,清朴,朴昭林申请人:生物领先公司