γ-聚谷氨酸产生菌及生产γ-聚谷氨酸有机肥的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株γ-聚谷氨酸产生菌，具体涉及一种γ-聚谷氨酸产生菌和一种 纤维素降解菌及利用该菌株混合发酵生产保水保肥有机肥的方法，属于微生物发酵工程领 域。
【背景技术】
[0002] 我国是农业大国，又是水资源缺乏的国家，干旱、半干旱地区约占国土面积的一半 以上，干旱是限制我国农业增收的重要因子，由此造成的损失位于各种自然灾害之首。为保 证我国农业丰收，需要进行适当地灌溉，但是我国水资源严重不足，而且分布不均，南多北 少，夏多冬少。目前多采用漫灌的方式，浪费严重；灌溉之后，大部分水及肥料蒸发或流失， 不能起到预期的作用；同时大量肥料流失必然导致施肥过量问题，既加剧了农业面源污染， 又浪费了大量资源；过度施肥还导致了农田生态系统遭到破坏，土壤有机质下降，团粒结构 性能降低，土壤板结现象加剧，保肥保水能力降低，大量微生物死亡，土壤微生物群落结构 发生变化，许多有益微生物从优势种群变为次要种群，作物易发生各类病害，同时肥料的利 用率较低，农产品品质下降，生产成本增加。
[0003] 多年来，为了提高肥料和水分的利用效率，人们对肥料和水分的增效因子进行了 大量的研究。其中具有水溶性高、吸附性强、生物相容性好，无毒、无害、无残留，能促进作 物养分吸收的保水保肥剂受到国内外学者的重视，已研制出上百种保水保肥剂。在土壤中 添加一定量的保水保肥剂，不仅可以改善土壤的保水性能，节约灌溉用水，同时保水保肥剂 与土壤混合可以改善土壤的团粒结构，使土壤变得松软透气，并能与土壤中的氮、磷、钾等 营养元素和各种微量元素结合，减少养分流失，减少化肥使用量，增强农作物的抗病能力。 γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamicacid，γ-PGA)是由D-谷氨酸或L-谷氨酸通过α-氨基 和γ-羧基间的酰胺键结合而成的，是某些杆菌（Bacillus)合成的一种胞外水溶性的高分 子氨基酸聚合物。γ-PGA具有优良的水溶性、超强的吸附性和生物可降解性，降解产物为天 然无公害的谷氨酸，是一种优良的环保型高分子材料，γ-聚谷氨酸既可以进一步增加作物 的产量，还可以对肥料和水分起到很好的缓释作用，具有显著的保水保肥、增产节肥效果。
[0004] 目前γ-PGA的制备主要是生物发酵法，即通过培养生产聚谷氨酸的菌种 得到产品。目前国内外用于研究γ-聚谷氨酸生产的典型菌株主要是Bacillus licheniformisATCC9945a和BacillussubtilisIF03335 等，发酵生产工艺通常有液体发 酵和固体发酵两种。目前，γ-聚谷氨酸发酵工艺以液体深层发酵为主，但是仍然存在生产 周期较长，生产效率低下，生产成本较高的等问题。如李培培等（公开号CN104017760Α) 分离得到一株地衣芽孢杆菌BacilluslicheniformisDou-6,其底物谷氨酸转化率仅为 60%。相比较于液体发酵而言，固体发酵拥有耗能低、设备简易、成本低、产生废弃物少、原 料来源广泛等优势，故常用于有机肥、饲料、酿酒等微生物发酵工业生产当中。另一方面， 规模化养殖产生畜禽粪便以及农业种植产生的秸杆等农业废弃物随地弃置，不仅引起了严 重的面源污染，也极大浪费了大量的养分资源（C、N、P、K、S及微量元素）。目前，以农业 废弃物固态发酵生产γ-聚谷氨酸有机肥的研究也有陆续报道，如CN102674986公开了 一种"具有保水保肥作用的生物有机肥及其制备方法"，该方法是利用单一芽孢杆菌菌株 以人畜粪便、生活垃圾或植物秸杆中进行γ-聚谷氨酸有机肥生产。CN101417894公开了 "一种含γ-聚谷氨酸的肥料添加剂的生产方法"，该方法用单一枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)PGA-7CCTCCΜ206102为发酵菌株，以氨基酸发酵废液、豆柏、花生饼粉、麸皮、稻 草粉等为主要发酵基料进行固体发酵生产含γ-聚谷氨酸的肥料添加剂。
[0005] 综上所述，γ-聚谷氨酸有机肥生产大都停留在以γ-聚谷氨酸单菌株发酵为主， 且γ-聚谷氨酸的产率较低，因此亟需开发一种γ-聚谷氨酸的产率高的新菌株和利用此 菌株高产生产γ-聚谷氨酸有机肥的方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一株γ-聚谷氨酸产生菌，经鉴定为芽孢杆菌（Bacillus sp.)J3CGMCCNo. 11582,该菌株能够在谷氨酸底物浓度较低条件下单独或与一株纤维素降 解菌混合发酵高产γ-PGA。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0008] 从土壤样品中筛选得到一株芽孢杆菌（Bacillussp. )J3,该菌株保藏于中国微生 物菌种保藏委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为：CGMCCNo. 11582,保藏日期为： 2015年11月5日。该菌性状特征如下：
[0009] (1)形态特征
[0010] 在蛋白胨琼脂培养基上营养细胞为0. 6~1.OX1. 2~2. 5μπι大小的杆菌，37°C培养3~5天形成芽孢，芽孢大小0. 6~0. 9X1. 0~1. 5μm，为长圆形或圆柱形。
[0011] ⑵培养性质
[0012] 牛肉膏、葡萄糖、琼脂培养基平板培养：30~40°C培养1天可大量生长，菌落表面 凸起，光滑无褶皱，菌落透明，边缘呈规则圆形，菌落粘性大，挑起有丝状。
[0013] -株纤维素降解菌--高温单孢菌属（Thermomonosporasp. )GC，从猜杆堆肥样 品中分离筛选得到，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏单位 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编 号为：CGMCCNo. 1364,保藏日期为：2005年4月28日。
[0014] 本发明的另一个目的是提供一种生产γ-聚谷氨酸的方法以及利用农业废弃物 进行固态混合发酵生产γ-聚谷氨酸保水保肥有机肥的方法，即以农业废弃物为基质，利 用γ-聚谷氨酸产生菌和纤维素降解菌混合发酵生产保水保肥有机肥的方法，利用该有机 肥可提高土壤对水分和肥料的吸附性能，提升土壤持水能力及水肥利用率，减少施肥量和 灌溉量，减轻农业面源污染，降低农业生产成本，以达到农业的可持续发展。制备方法如 下：
[0015] (1)所用菌株为芽孢杆菌J3和高温单孢菌GC，高温单孢菌GC从中国微生物菌种 保藏委员会普通微生物中心购买获得；
[0016] ⑵培养基
[0017] 1)活化培养基
[0018] 芽孢杆菌J3活化培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g，琼脂 18 ~20g，补水至 1000mL，pH7· 0 ~7· 4;
[0019] 高温单孢菌GC活化培养基（高氏一号培养基）：可溶性淀粉20g、酵母粉2g、葡萄 糖 5g、KN03lg、Κ2ΗΡ040· 5g、MgS04 · 7H20 0· 5g、NaCl0· 5g、FeS04 · 7H20 0·Olg、琼脂 18 ~ 2〇g、补水至l〇〇〇mL，ρΗ7· 2 ~7· 6 ;
[0020] 将芽孢杆菌J3和高温单孢菌GC分别接入灭菌（121°C，30min)处理的牛肉膏蛋白 胨和高氏一号斜面培养基中活化备用；
[0021] 2)液体培养
[0022] 将牛肉膏蛋白胨液体培养基和高氏一号液体培养基高温灭菌（121°C，30min)处 理后，将步骤1)活化好的芽孢杆菌J3和高温单孢菌GC分别接入牛肉膏蛋白胨液体培养基 和高氏一号液体培养基中，35°C、150r/min振荡培养28h和50h;
[0023] 3)固体混合发酵培养基：向农业废弃物发酵基质中添加尿素或者调整基质中秸 杆与粪便比例，使基质中碳氮的摩尔比为15~35 :1;再按质量比添加谷氨酸钠0.5~ 2. 0%，葡萄糖或蔗糖1~3%，Κ2ΗΡ040· 1~1%，MgS04 · 7H20 0· 01~0· 1%，将谷氨酸钠、 葡萄糖或蔗糖、K2HP04、MgS04 · 7H20混合溶于水中喷洒于上述基质中，调节发酵基质含水率 为50~65%，pH值7. 0~8. 0,并搅拌均匀配成固体混合发酵培养基；
[0024] (3)混合菌接种体积比
[0025] 芽孢杆菌J3 :高温单孢菌GC= 1~3 :5~10;
[0026] (4)将步骤（3)得到的混合菌种子液按照固体培养基总质量的0.1~2%的接 种量接入灭菌固体混合发酵培养基中，30~37 °C通气培养20~40d，停止发酵，即得含 γ-PGA保水保肥有机肥。
[0027] 本发明对液体培养基进行了改进，改进后的牛肉膏蛋白胨液体培养基和高氏 一号液体培养基的配方分别为：改进后的牛肉膏蛋白胨液体培养基配方：牛肉膏5g、蛋 白胨10g、葡萄糖5g、NaCl5g，补水至1000mL，pH7. 0~7. 4;改进后的高氏一号液体 培养基配方：可溶性淀粉15g、酵母粉2g、葡萄糖10g、KN03lg、KH2P040 . 5g、K2HP040 . 5g、 MgS04 · 7H200. 5g、NaCl0· 5g、FeS0