一种双微生物发酵制备γ-聚谷氨酸有机肥的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种双微生物发酵制备丫-聚谷氨酸有机肥的方法，属于有机肥生产
技术领域。
【背景技术】
[0002] 目前，我国传统肥料需求进入瓶颈期，开发新型肥料一直是行业内的热点。聚谷氨 酸肥料是一种新兴功能性肥料，据研究报道，丫-聚谷氨酸对小白菜、玉米、烟叶的种植与栽 培同样产量时肥料使用量减少10%W上，或在同样施肥量前提下提高作物产量10%W上。 T-聚谷氨酸是一种多聚氨基酸，它具有高絮凝活性，对上壤的金属离子有良好的吸附性， 可有效改善±壤的重金属污染，同时提高锋、铁等离子对作物的有效性；聚谷氨酸与±壤结 合还可W改善±壤结构，增加±壤保水、保肥性能，因此通过添加聚谷氨酸制备各种肥料的 发明也有不少公开。例如，CN104003783A(CN201410261189)公开了一种功能性颗粒状大 量元素水溶肥，其原料组分重量份是：尿素345~350份、硝酸钟210~220份、憐酸二氨 钟240~250份、硫酸钟20~30份、憐酸一锭110~115份、棚酸11~11. 6份、EDTA馨 合锋6~6. 6份、邸TA馨合铁7~7. 7份、邸TA馨合儘3~3. 9份、屯钢酸锭0. 1~0. 2 份、聚谷氨酸5~10份。该肥料具有保水、抗旱，肥料利用率高，改良、修复±壤等功能； CN103936521A提供一种新型高效复混肥料及其制备方法，该肥料组成是：生物增效剂2~5 份、硫酸锋20~30份、硫酸儀20~30份、腐植酸15~25份、硫酸棚10~20份、硫酸儘 5~15份、钢酸锭1~4份，其中，生物增效剂组分及重量份数为：聚天冬氨酸65~85份 和聚谷氨酸15~35份。
[0003] W上所述现有技术中的各种肥料都是复配的组合物，所添加的是提纯的聚谷氨 酸，而提纯工序会大量增加成本，不利于农业生产大量使用。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术的不足，本发明提供一种双微生物发酵制备丫-聚谷氨酸有机肥的 方法，也即，利用两种微生物先后进行固体发酵生产含有丫-聚谷氨酸的有机肥的制备方 法。
[0005] 本发明还提供制备的丫-聚谷氨酸有机肥的应用及施用方法。
[0006] 术语说明：
[0007] PDA斜面培养基，是对马铃馨葡萄糖琼脂培养基的简称，配方：马铃馨200份，葡 萄糖20份，琼脂15~20份，自来水1000份。
[0008] 食用菌培养料废渣，是栽培食用菌后废弃的培养料，培养料主要成分有棉巧壳、棉 绒、玉米忍、银末、作物賴杆、麦教、菌丝体等。
[0009] 慷醒渣，是W玉米忍、玉米杆、稻壳、棉巧壳等为原料生产慷醒（巧喃甲醒）过程中 的废渣，作为一种生物质类废弃物含有大量的纤维素、半纤维素、木质素等。
[0010] 丫-聚谷氨酸是水溶性多聚氨基酸，分子量分布在lOOkDa到lOOOOkDa之间。 阳011] 本发明的技术方案如下：
[0012] 一种双微生物发酵制备丫-聚谷氨酸有机肥的方法，包括如下步骤：
[0013] (1)制备谷氨酸棒杆菌种子液
[0014]a、用PDA斜面培养基将谷氨酸棒杆菌菌种活化；
[0015] b、按质量份，取葡萄糖30份，玉米粉60份，蛋白腺2份，酵母粉2份，憐酸二氨钟 1. 5份，硫酸儀1份，氯化钢2份，水1000份，抑值7. 0,0. 11兆帕压力下灭菌30分钟，制成 液体培养基A;将步骤a活化后的谷氨酸棒杆菌接入制成的液体培养基A中，于28~32 °C、 150转/分钟的摇瓶中培养16~20小时；得谷氨酸棒杆菌种子液刺子液菌活1Xl〇s个/ 克~5Xl〇s个/克；备用；
[0016] (2)制备枯草芽抱杆菌种子液
[0017]a、用PDA斜面培养基将枯草芽抱杆菌菌种活化；
[001引 b、按质量份，取葡萄糖20份，玉米粉30份，蛋白腺5份，酵母粉5份，憐酸二氨钟1 份，硫酸儀1份，氯化钢2份，水1000份，抑值7. 0,在0. 11兆帕压力下灭菌30分钟，制成 液体培养基B;将步骤a活化后的枯草芽抱杆菌接入制成的液体培养基B中，于28~3(TC、 150转/分钟的摇瓶中培养20~24小时；得枯草芽抱杆菌种子液刺子液菌活1Xl0s个/ 克~5Xl0s个/克；备用；
[0019] (3)制备发酵有机物料
[0020] 按质量份，取食用菌培养料废渣30~45份，粉碎的作物賴杆15~30份，慷醒渣 18~50份，堆置发酵30~40天，加入±豆粉5~10份，常规灭菌，得发酵有机物料；备 用；
[0021] (4)谷氨酸棒杆菌的固体发酵
[0022] 按质量份，取步骤（3)制备的发酵有机物料，按5~lOwt%的接种量接入步骤（1) 制备的谷氨酸棒杆菌种子液，混匀，调整混合物的含水量至58%~60%，于28~35°C条件 下堆置发酵28~40小时，中间翻堆一次，得谷氨酸棒杆菌发酵物；
[002引 妨取步骤（4)制备的谷氨酸棒杆菌发酵物，按6~15wt%的接种量接入步骤似 制备的枯草芽抱杆菌种子液，混匀，于25~35°C条件下堆置发酵25~35小时，中间翻堆一 次，发酵结束后烘干或凉干；得双微生物发酵的丫-聚谷氨酸有机肥。
[0024] 所述谷氨酸棒杆菌选用谷氨酸棒杆菌III型（Corynebacteriumglutamicum)，优选 中国工业微生物菌种保藏管理中屯、（化inaCenterofIndustrialQiltureCollection英文缩写CICC)的CICC10111、CICC10112、CICC10113或CICC10114。谷氨酸棒杆菌种子液 的制备也可按现有技术，本发明提供步骤（1)的方法是优选的。
[00巧]所述枯草芽抱杆菌选用枯草芽抱杆菌枯草亚种度acillussubtilissubsp.Subtilis)，优选中国工业微生物菌种保藏管理中屯、（化inaCenterofIn化strial 化ItureCollection英文缩写CICC)的CICC20643。枯草芽抱杆菌种子液的制备也可按现 有技术，本发明提供步骤（2)的方法是优选的。
[00%] 根据本发明，上述步骤（3)中所述作物賴杆选用玉米、小麦、水稻、花生等作物賴 杆。
[0027] 根据本发明，优选的，上述步骤（3)中所述作物賴杆为玉米賴杆，粉碎至长度2厘 米W下。
[0028]根据本发明，优选的，上述步骤（3)中所述食用菌培养料废渣为栽培杏鲍茹或平 茹的培养料废弃菌棒，粉碎至颗粒粒径0. 5厘米W下。其中优选食用菌培养料废渣为栽培 杏鲍茹的培养料废弃菌棒。
[0029]根据本发明，优选的，上述步骤（3)为：取栽培杏鲍茹的培养料废渣35份，粉碎的 玉米賴杆20份，慷醒渣37份，堆置发酵35天，加入±豆粉8份；
[0030] 根据本发明，优选的，上述步骤（4)谷氨酸棒杆菌种子液的接种量为6wt%，33°C条件下堆置发酵30小时；
[0031] 根据本发明，优选的，上述步骤（5)枯草芽抱杆菌种子液的接种量为12wt%，30°C 条件下堆置发酵28小时。
[0032] 上述制备方法中未详细限定的均按现有技术。
[0033]本发明方法制备的发酵有机肥产品中丫-聚谷氨酸的含量在l%wt.左右，该 丫-聚谷氨酸有机肥适用于蔬菜、果树、草本水果等作物。
[0034]本发明方法制备的丫-聚谷氨酸有机肥，施用方法如下：
[0035]将本发明的丫 -聚谷氨酸有机肥在作物种植前均匀撒施于±壤表面翻耕入±，或 者施于栽植穴内，与±混合后在其上移栽幼苗。所述丫-聚谷氨酸有机肥的用量如下：蔬菜 作物和草本水果每亩500~800公斤，果树每亩300~600公斤。
[0036]本发明首先利用谷氨酸棒杆菌发酵固体有机物产生富含k谷氨酸的有机物料， 再用枯草芽抱杆菌对含有k谷氨酸的有机物料继续发酵产生含有y-聚谷氨酸的有机肥。 该肥料经过大田试验，取得了良好的作物增产效果。
[0037]本发明的优良效果如下：
[0038] 1.采用双微生物发酵工艺，避免了直接加入k谷氨酸
[0039] 丫-聚谷氨酸主要W微生物发酵法合成制得，而合成聚谷氨酸的微生物主要是 k谷氨酸依赖型微生物，即在培养过程中需要加入培养基中k谷氨酸才能合成丫-聚谷氨 酸。本发明首先利用谷氨酸棒杆菌发酵固体有机物产生富含心谷氨酸的有机物料，再用枯 草芽抱杆菌对含有k谷氨酸的有机物料继续发酵产生含有丫-聚谷氨酸的有机肥，避免直 接加入心谷氨酸。
[0040] 2.降低肥料成本
[0041] 目前，含有聚谷氨酸的肥料主要是添加纯的聚谷氨酸，而聚谷氨酸的纯化是一个 复杂的工艺过程，因此聚谷氨酸价格较贵，用其生产有机肥成本较高。本发明首先利用谷氨 酸棒杆菌发酵固体有机物产生富含k谷氨酸的有机物料，避免直接加入纯心谷氨酸；对含 有k谷氨酸的有机物料继续发酵产生含有丫 -聚谷氨酸的有机肥，也避免直接加入纯聚谷 氨酸，减少了提纯过程，降低了肥料成本。 阳0创 3、肥料增产效果好
[0043]本发明利用两种作物进行的田间试验显示，与应用相同的有机物原料和现有发酵 技术生产的有机肥相比，本发明肥料在大棚西红柿的增产率为6. 9%~10. 3%，白菜增产 8. 4%~12. 5%。
【具体实施方式】
[0044] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。实施例中的原料用量份数 均为质量份，所有的百分比均为质量百分比（Wt% )。
[0045] 谷氨酸棒杆菌选用谷氨酸棒杆菌III型（Corynebacteriumglutami州m)CICC10111 和CICC10112、中国工业微生物菌种保藏管理中屯、购得，其中实施例1-2用CICClOlll，实施 例 3-4 用CICC10112。 柳46] 枯草芽抱杆菌选用枯草芽抱杆菌枯草亚种度acillus subtilis subsp. Subtilis)CICC20643,中国工业微生物菌种保藏管理中屯、购得。
[0047] 玉米賴杆和花生賴杆粉碎至过2毫米孔筛，食用菌培养料废渣粉碎至粒径小于 0. 5厘米，±豆粉碎过20目筛。食用菌培养料废渣为栽培杏鲍茹和平茹的废弃菌棒，其中实 施例1-2用栽培杏鲍茹的培养料废渣，实施例3-4用栽培平茹的培养料废渣。葡萄糖、玉米 粉、蛋白腺等均为市售产品。
[0048] 实施例中的含量％均为质量百分比。 W例实施例1 :一种双微生物发酵制备含丫-聚谷氨酸有机肥的方法，步骤如下：
[0050] (1)制备谷氨酸棒杆菌种子液
[0051]a、用PDA斜面培养基将谷氨酸棒杆菌CICC10111菌种活化；
[0052]b、取葡萄糖30克，玉米粉60克，蛋白腺2克，酵母粉2克，憐酸二氨钟1.5克，硫酸 儀1克，氯化钢2克，水1000克，调抑值至7. 0,在0. 11兆帕压力下灭菌30分钟，制成液体 培养基；将步骤a活化后的谷氨酸棒杆菌（CICC10111)接入液体培养基中，于30°C、150转 /分钟的摇瓶中