专利名称：在阵列上对遗传修饰植物特异的核苷酸序列元件的鉴定和/或定量的制作方法
技术领域：
0001 本发明属于探测领域，涉及对可能存在于生物样品中的遗传修饰植物特异的核苷酸序列元件的鉴定和/或定量方法和手段，其中所述的核苷酸序列元件在不同的遗传修饰植物中可能是同源的。
0002 本发明特别适于属于相同属或者相同科的生物体的鉴定和/或定量，并且适用于经遗传修饰的生物体的检测和/或定量。
背景技术：
0003 生物芯片技术的发展可以使在给定检测中对多个核苷酸序列同时检测，这样可以对相应的生物体或该生物体的一部分进行鉴定。但是检测需要与PCR扩增联合进行，而对每一种生物进行一次PCR然后使用微阵列进行检测是没有什么优势的。因此，需要有一个检测大量生物体的策略，以降低PCR反应的数量，同时保留对多个生物体的鉴定。
背景技术：
0004 Affymetrix Inc.公司已经开发了通过在每步的处理中都使用掩蔽(mask)而在固相支持物上特定的位置直接合成寡聚核苷酸的方法。所述方法包括在不断生长的寡核苷酸中加入新的核苷酸，以在所需的位置得到所需的序列。该方法衍生自光刻技术(photolithographic technology)，与光保护基团的使用结合，光保护基团是在新核苷酸加入之前被释放(EP-A1-0476014，US-A-5,445,934，US-A-5,143,854和US-5,510,270)。但是在表面上只存在小的寡核苷酸，所以所述的方法主要应用于对应于结合在阵列上的每个特异寡聚核苷酸的阳性斑点型式的测序或鉴定。将这个型式与参照进行比较，得到对靶标序列的表征。所述的技术已经应用于结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)rpoB基因的鉴定(WO97/29212和WO98/28444)，其中捕获核苷酸序列包含少于30个核苷酸，并且来自对两个可能仅相差单个核苷酸的不同序列的分析(SNP的鉴定或基因定型)。优选小的捕获核苷酸序列(长度包含10到20个核苷酸之间)，原因是如果核苷酸的长度越短，则相差一个碱基的两个寡聚核苷酸之间的差异越高。
0005 该方法缺少敏感性，表现在它不能直接检测基因扩增(PCR)产生的扩增子。使用具有T3或T7序列的引物进行双扩增，然后用RNA聚合酶进行逆转录。这些RNA被切割为大约40个碱基的片段，然后在阵列上检测(WO97/29212的实施例1)。但是，长的DNA或RNA片段与表面上的捕获探针杂交非常缓慢。因此所述方法不适于检测同源序列，因为序列中同源性不同，这样片段的一部分可能与相同的捕获探针杂交。因此，应该在方法中加入解释结果的软件，对得到的数据进行解释。
0006 但是，对于基于mRNA的cDNA拷贝的基因表达阵列，在使用小的捕获探针阵列时会遇到相同的问题杂交率低。因此，将片段切割成更小的片段，该方法要求使用几个捕获核苷酸序列，以获得证明某个基因存在的信号型式(WO97/10364和WO97/27317)。所述的切割还降低了标记核苷酸的数目，这样降低了得到的信号。这时使用长的捕获核苷酸序列得到更好的检测敏感性。在许多基因表达应用中，如果待检测的cDNA来自具有不同序列的基因，则使用长的捕获探针不是问题，因为它们之间没有交叉反应。长的捕获核苷酸序列提供了所需的敏感性，但是它们会与其他同源序列杂交。
0007 阵列非常适宜进行多参数检测，但是因为生物样品中的材料含量很低，所以需要有一个策略，使PCR和阵列的组合有效。对被检测的样品中可能存在的每一个可能的生物体都进行PCR然后分别检测和/或鉴定扩增的序列不是非常有效的，并且是本领域的一部分。如果在样品中可能存在多个生物体，必须对要使用的引物的数目进行限制，因为如果在不同试管中进行的话，这有可能导致大量数目的PCR；或者如果进行多重引物PCR的话，会导致非特异扩增；因此，需要简化PCR，开发出组合PCR和阵列设计的策略。
0008 在对生物样品中遗传修饰(GM)的植物或生物体(GMO)进行检测和/或鉴定时就存在这样的情况。
GMO由一个独特的转化事件确定，该事件通常是指向受体生物体中插入异源基因构建体。整合基因构建体由几个元件组成，通常至少有一个目的基因，作为起始信号起作用的启动子以及作为停止信号的终止子，用于调控基因表达。此外，构建体可以被来自克隆载体的DNA序列包围。大部分遗传修饰的植物用含有花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子(P-35S)和/或CaMV 35S终止子(T-35S)或者根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合酶终止子(T-Nos)的构建体转化。最常用的克隆载体是含有编码氨苄青霉素抗生素抗性基因(bla)的pBR322，或者含有编码新霉素/卡那霉素抗生素抗性基因(nptII)的载体。
0009 有一些国家对GMO和来自GM的食品有强制的标注规定。特别地，欧洲的规定对由遗传修饰生物组成或含有遗传修饰生物(GMO)比例高于食物成分0.9％的食品和饲料，强制要求标注(EC规定No.1829/203)。这个0.9％的标注限度导致0.1％或者甚至更低的检测限度，目的是考虑到检测的变异性。这个限度相应于样品中含有几百或者更少的基因组拷贝。
0010 为了遵守那些规定中的要求，并且通过准确的信息保证消费者可以进行自由选择，已经描述了几个GMO分析方法，这些方法目前在欧洲执行实验室中使用。由于实验室得到的用于进行分析的产品经常是加工过或者是精制过的，目标被分析物的质和量经常对任何检测方法的敏感性提出挑战。在现有的方法中，PCR然后进行电泳，一般被认为是在常规应用中检测GM来源物质最敏感可靠的方法。
0011 GMO检测可能限于简单的筛选PCR。但是对DNA来源的GMO进行特异鉴定，或者对GMO来源的DNA进行可靠定量迅速增加了成本，特别是要检测的GMO的数目持续增加的情况下。
0012 由于需要达到的敏感性，来自样品的遗传物质在检测前首先通过PCR扩增。根据特异性的水平，基于PCR的GMO检测可以划分为至少四类。每一类对应的是在PCR中扩增的DNA片段组合物筛选靶标、基因特异靶标、构建体特异和事件特异的靶标。
0013 第一类PCR方法以P-35S、T-35S、T-Nos、bla或者nptII遗传元件作为靶标，在筛选遗传修饰物质时有广泛应用(Matsuoka等，2002，J.Agric.Food Chem.9335-38)。但是，这些筛选方法不能用于鉴定GMO，因为一个筛选靶标的存在并不一定表明GMO来源的DNA的存在。P-35S或者T-35S的来源可能是天然存在的CaMV(Wolf等2000，Eur.Food Res Technol.210367-372)。
0014 第二类PCR方法，以目标基因(例如CryIA(b)基因)为靶标，比筛选方法更为特异(Va tilingom等，1999，J.Agric.Food Chem.475261-5266)。对已有基因的选择大于对已有启动子和终止子的选择。通常对特定基因扩增的阳性信号表明存在来自GM的DNA，许多情况下可以确定该DNA来自哪种GMO。
0015 第三类PCR方法以基因构建体(特异构建体)相邻元件的连接为靶标，例如在启动子和目标基因之间的连接(例如Mon810玉米P-35S-hsp70内含子I)(Zimmerman等，1998，Lebensm-Wissu Technol.31664-667)。使用这些方法时只有存在来自GMO的物质才会出现阳性信号。但是，全部的基因构建体可能已经被转化到一个以上的GMO中，或者可能用于以后的转化中。
在目前技术的限制条件下，转化事件唯一的独特标记是受体基因组和插入DNA之间的整合基因座处的连接。这个连接是第四类PCR方法的靶标。不幸的是，即使是事件特异的方法也有它们的局限性。当两种GMO杂交时(例如两种不同的GM玉米例如T25和Mon810)，产生的杂种后代可能含有包括两个事件的标记的遗传修饰，这样在PCR检测中不能与它的两个亲本区别开来。这种检测的一个重要限制是对于每一个要鉴定的GMO需要一个特异的引物对。
0016 这些检测中的一些基于常规PCR，可以对给定样品中的GMO进行定性测定。其他检测例如实时PCR(Hernández等，2003，Transgenic Research 12179-189)可以对样品中的GMO定量。
0017 基于PCR的对来自GMO的DNA检测的主要局限在于获得关于可以使用的PCR引物的信息以及获得适宜用于可靠分析的DNA。尽管已经开发和公布了用于GMO分析的一些PCR引物对，但是这些引物中许多只有有限的应用范围(例如只适于筛选或者鉴定一种GMO的引物)。
0018 食品加工例如研磨、加热、酸处理和其他加工迅速使DNA降解为大约200-400bp的小片段，而且精制可以有效除去DNA。因此，许多产物几乎没有来自GMO的DNA，而且这样的DNA经常被片段化。所以，为了能够检测加工后的食品中的GMO，引物对应该靶向小的片段(100-200bp)。
0019 需要扩大对在单一检测中检测出的GMO的数目。还需要能够轻易升级包括新GMO的方法。多重引物PCR在理论上允许同时检测几个GMO。但是，这种检测不易实施，因为一些小的扩增产物通过电泳不容易区别。而且，多个PCR与单一扩增相比通常灵敏度更低，这对GMO检测是一个重要缺陷。
0020 专利申请US-20030198943A1描述了使用共有引物在生物芯片上对PCR扩增的GMO进行检测的方法。如实施例15中描述的扩增子的大小包含约1000到约3000bp。所以该方法只适于新鲜叶片或者种子，因为通过研磨、加热或酸处理获得的加工过的食品使DNA降解为大约200-400bp的小片段。在不同的遗传元件中选择正向和反向共有引物(例如启动子35S中的有义引物，SEQ ID No192和终止子35S中的反义引物，SEQ ID No193)或者一个位于遗传元件中，另一个位于植物基因组中边界区域中(例如章鱼碱左边界中的有义引物，SEQ IDNo198和EPSPS中的反义引物，SEQ ID No199)。引物的序列在实施例15中给出。捕获探针选自由通常在遗传元件(例如CTP1、CTP2、EPSPS、Cry1ab、hsp70内含子、Pat)中的共有引物确定的序列。GMO通过对应于阵列中的一个斑点信号的捕获探针鉴定。但是很难得到明确的鉴定，因为许多GMO含有相同的遗传元件。
0021 这个现有技术方法的第一个限制是能够被鉴定的GMO数量少，而且很难得到明确的鉴定，因为许多GMO含有相同的遗传元件。
0022 这个现有技术方法的第二个限制是其不能在通过研磨、加热、酸处理和其他加工过程加工的食品上实施，这些加工过程使DNA迅速降解为大约200-400bp的小片段。所以许多产物含有少量的来自GMO的DNA，并且回收的DNA序列通常是片段化的。而且，该方法只适于新鲜叶片或者种子。该PCR基于使用不同的遗传元件中的共有引物(例如启动子35S中的有义引物，SEQ ID No192和终止子35S中的反义引物，SEQ ID No193)或者一个位于遗传元件中，另一个位于植物基因组边界区域中(例如章鱼碱左边界中的有义引物，SEQ ID No198和EPSPS中的反义引物，SEQ ID No199)。引物的序列在实施例15中给出(第22列)。
发明目的0023 本发明的目的是提供新方法(和装置)以改善微阵列和生物芯片技术，使大量生物体或者生物体的部分(它们的部分核苷酸序列同源)的鉴定(检测和/或定量)变得容易。
0024 本发明的另一个目的是提供这种基于简化技术的方法(和装置)，需要在扩增步骤中使用有限数目的引物，通过检测和/或记录所述的微阵列上的单一斑点信号从而鉴定(检测和/或定量)特异的扩增靶标序列，所述的信号由靶标序列与其相应的捕获序列的特异结合产生。
0025 本发明的另一个目的是鉴定其序列的一些部分相同或者高度同源的生物体，特别是遗传修饰植物(GM植物)或者生物体(GMO)的检测。
0026 本发明的最后一个目的是提出了方法，该方法简化了对生物样品(特别是获得遗传修饰植物的生物样品)中存在的遗传物质的来源鉴定。
定义0027 术语“核酸、寡核苷酸、阵列、探针、靶标核酸、基本结合、与......特异杂交、背景、定量”是在国际专利申请WO97/27317中描述的术语，在此引用作为参考。
0028 术语“核苷酸三磷酸，核苷酸、引物序列”是在文献WO00/72018和PCT/BE00/00123中描述的术语，在此引用作为参考。
0029 术语“同源的遗传序列”或者“同源的核苷酸序列元件”指的是在对应位置具有相同氨基酸或者核苷酸的百分比高于完全随机的比对。当它们显示最低同源性(或序列一致性)时，它们被认为是同源的，同源性定义为在考虑到要比较的两个序列中的一个中具有添加或者缺失(如缺口)对两个序列进行最佳比对后，在每一个位置发现的相同核苷酸或氨基酸占全部核苷酸或氨基酸的百分比。编码给定蛋白、但是存在于遗传上不同来源例如不同生物体中的基因，通常是同源的。在给定的生物体中，编码同一家族蛋白或酶(白细胞介素，细胞色素b，p.450)的基因也通常是同源的。由于同源序列可以只在一部分、几个部分或者全部序列同源，所以同源的程度(或者序列一致性)可以有很大差异。序列中相同的序列的同源部分是完全同源的，也被称为保守或者相同的。用于细胞转染的遗传构建可能含有相同或者同源部分，例如此后定义为核苷酸序列元件的序列部分。
0030 这些核苷酸序列元件包括调控序列，例如终止子、启动子或者掺入到植物基因组中的目标基因(抗生素标记)或者涉及目标分子产生的序列或者这些序列的部分。这些核苷酸序列元件还可能是重复序列和/或编码特异酶活性的序列或者这些序列的部分。呈现保守三维结构的蛋白质结构域通常由同源序列编码，更经常由独特外显子编码。
0031 在序列中显示高度恒定性的序列被称为高度保守的，并且它们具有高度同源性。
“遗传图”是这些各种不同核苷酸序列元件在生物体基因组中，优选在植物基因组中的组织。
0032 “生物样品”指的是可以包含不同和多个遗传修饰植物特异的或具有遗传修饰植物来源的核苷酸序列元件的任何介质。
0033 例如，这种生物样品可以是食品、食品组分或者食品添加剂。
0034 生物样品还可以是可能被遗传修饰植物污染的固体或液体提取物。可以对生物样品进行这些遗传修饰植物特异的核苷酸序列元件的提取步骤。
0035 术语“遗传修饰植物”指的是所有类型的经过一定遗传修饰的植物，特别是向植物中插入了包含对于该植物为外源元件(包围目标基因和/或遗传标记的启动子和终止子序列)的盒序列。
发明概述0036 本发明涉及对生物样品中不同的多种核苷酸序列元件进行鉴定和/或定量的方法，该序列元件是遗传修饰植物特异的，方法包括以下步骤a.可能从生物样品中提取核苷酸序列元件；b.使用能够扩增所述核苷酸序列元件的引物对将核苷酸序列元件扩增或者复制成靶标核苷酸序列，所述的核苷酸序列元件与存在于至少两种不同的遗传修饰植物中的核苷酸序列元件是同源的；c.可能对获得的靶标核苷酸序列进行标记；d.将获得的靶标核苷酸序列与通过共价连接结合在固相支持物表面上特定位置的不溶性固体支持物的单链捕获核苷酸序列接触；e.通过检测所述靶标核苷酸序列与其位于特定位置的相应的捕获序列互补碱基配对杂交产生的信号，检测所述靶标核苷酸序列的结合，其中捕获核苷酸序列被结合在不溶性固相支持物上根据阵列(阵列的密度是每cm2固相支持表面4个不同的结合单链捕获核苷酸序列)的特定位置上，其中的捕获核苷酸序列包含的序列具有10到200个碱基，优选在10到49个碱基，这使捕获核苷酸与待检测的和/或定量的靶标核苷酸之间发生特异杂交；f.对于第二个、第三个、第四个或者更多所述遗传修饰植物特异的不同核苷酸序列元件，重复步骤b)到e)；g.通过生物样品中这些不同和多个核苷酸序列元件的存在或者不存在，确定遗传修饰的植物。
0037 本发明的发明者发现对于一些应用可以通过使用特殊扩增与微阵列检测相组合的策略确定生物体的遗传图而大幅度简化对可能存在于具有同源序列的分析样品中的其他许多生物体中的一种或者几种生物体的鉴定。该方法组合了使用共存引物对进行有限数目扩增的步骤以及检测、定量和/或记录阵列上与靶标核苷酸序列存在相对应的单一信号(捕获核苷酸序列及其对应的靶标核苷酸序列之间的结合)，以及将所检测的核苷酸序列的存在与进行检测和/或定量的生物样品中这些(微)生物体特异核苷酸序列元件(存在或者不存在)的鉴定相互联系起来。
0038 根据本发明的方法和装置使得可以从其他同源序列元件中，容易地鉴定/检测生物体特异的核苷酸序列元件，也可能使其容易地定量(对在生物样品中的这些生物体的拷贝或者存在的数目进行表征)。
0039 在与支持物或者基质上存在的特异捕获核苷酸序列(优选以阵列的形式)结合之后，获得鉴定。在洗掉可能的污染物(未结合的序列)之后，通过检测和可能记录一个靶标序列、在一个特定位置的单一斑点信号(其中对应的捕获核苷酸序列是以前结合上的)，直接获得对靶标序列的鉴定，但是其中靶标序列的确定不是对微阵列上复杂斑点型式分析的结果，并且其中不需要扩增的靶标序列的片段化。
0040 通过使用结合的捕获核苷酸序列(至少由两部分组成，一是通过单一并且便利地是预先确定的(确定的)连接与固相支持物表面结合的间隔物，优选是无孔的支持物；另一部分是能够通过与扩增的核苷酸靶标序列互补碱基配对而特异杂交的特异核苷酸序列)，可以以高敏感性在阵列上将单链甚至是双链靶标序列有利地与其他同源序列区别开来。
0041 而且，如果高浓度的捕获核苷酸序列结合在固相支持物表面，则该检测被极大地增加。
0042 本发明涉及将对于生物体或者其部分(可能存在于生物样品中)特异的核苷酸序列元件，从其他不同的生物体或者变种中获得的至少4种同源(或者相同)核苷酸序列中鉴定出来，所述的其他生物体可能存在于同一生物样品中并且具有与样品中待检测和/或定量的元件同源或者相同的核苷酸序列元件。
0043 所述的鉴定(在样品中存在或者不存在这些元件)是如下得到的，即首先通过几个共有引物对对核苷酸序列元件遗传扩增，然后(在洗涤之后)对来自这些扩增步骤的可能不同的扩增靶标序列进行区别。该区别通过在结合在固相支持物表面给定(特异和预先确定的)位置的捕获核苷酸序列的阵列上进行杂交而便利地获得。
0044 通过对这些靶标序列与它们位于预期位置的对应捕获核苷酸序列特异结合后产生的信号(对于特定靶标序列结合特异的单一位置信号)进行检测和可能的记录，不同靶标核苷酸序列的存在和/或不存在使得可以对样品中不同特异核苷酸序列元件的存在和/或不存在进行确定。
0045 根据本发明的方法还包括将样品中核苷酸序列元件的存在和/或不存在与下列各项的存在和/或鉴定联系起来-特异的生物体，-遗传修饰的生物体(GMO)，特别是遗传修饰的植物，-序列中的遗传特征(突变、缺失、插入)，-遗传疾病探测的诱因或发展(监测)，包括生物样品来源的患者(包括人)的癌症。
0046 该方法特别适于在生物样品中检测和筛选GMO或者其他生物体或者其部分，这些生物样品的基因组序列一些部分(元件)相同或者高度同源(优选具有80％以上甚至90％以上的同源性)，一些部分不同，由于这个原因样品中可能存在大量这些生物体。
0047 本发明使得可以在一次单一检测中在阵列上对核苷酸序列元件进行鉴定(在它们扩增为靶标核苷酸序列之后)，在检测后确定存在和不存在。所述检测优选与确定这些生物体遗传图相当。
0048 实际上，被检测元件的一些或者全部在生物体不同遗传图中存在或者不存在使得可以对存在于生物样品中的特异生物体进行鉴定。还可以将这些元件存在或者不存在与数据库或者表格相关联，数据库或者表格包含被查询元件的所有遗传图，用于对数据库中存在的每一种生物体进行正确鉴定。
0049 在特定的实施方案中，该方法还提供了检测和/或鉴定属于一个家族(family)一部分的生物体的手段，该生物体具有特定的遗传元件，但是被分类为不属于具有每一个被检测生物体遗传图的数据库的一部分。
0050 在优选的实施方案中，该方法还提供了计算机程序形式的用于对从不同元件的检测和/或鉴定以及生物体的鉴定中获得的试验结果进行分析的手段。该程序还优选地提供了数据库，该数据库具有可能的可检测的生物体的元件组成。
0051 在优选的实施方案中，不同生物体遗传图的元件排列成为表格，检测的结果逐一与表格的数据比较。
0052 在另一个实施方案中，本发明适于对具有一个或者几个被查询的元件的生物体进行确定，但是不适于确定被查询生物体的所有特征性元件。然后该生物体被引用称为未知生物体。
0053 本发明优选需要包括所述元件的表格以及从实验数据中分选出生物体鉴定的方法。
0054 在特定的实施方案中，使用相同的引物对来自不同生物体的序列进行全部或者部分扩增，得到的靶标序列在通用的(common)捕获序列上进行检测。
0055 在另一个实施方案中，使用相同的引物对来自不同生物体的靶标序列进行全部或者部分扩增，但是在特异的捕获序列上检测。
0056 在另一个优选的实施方案中，阵列含有对不同生物体的相同(扩增的)靶标核苷酸序列特异的捕获序列以及对来自不同生物体的相同(扩增的)靶标核苷酸序列通用的捕获序列。
0057 特别优选的实施方案中，本发明对插入了如表I和II所示的外源核苷酸序列元件的GMO植物实施。GMO的元件根据本发明提供的方法进行检测。在特定的应用中，6个元件(或者它们的部分)分别是P35s、T-nos、nptII、pat、Cry1Ab、EPSPS，使用实施例2中提供的6个引物对在3个不同试管中对上述6个元件进行扩增。该方法有利地包括了检测CaMV可能存在以及鉴定植物物种的适宜对照。
0058 在特定的实施方案中，本发明提供了鉴定数目多于(扩增的)靶标核苷酸靶标序列数目的生物体的方法，能够被检测的生物体数目是扩增的数目加上至少2，较好加上5，更好加上10。
0059 本方法应用于(表1的)9个GMO检测和/或鉴定，以及应用于(表2的)21个GMO的检测和/或鉴定。
0060 在实施例3中通过两两比较要检测的遗传元件对GMO生物体进行鉴定的实例在表3中给出。在该实施例中以及给定的在微阵列上检测的特定元件中，除了3个与另外一个生物体具有相同作图的生物体以外，遗传图对每个GMO都是特异的。表4中显示的结果显示GMO可以被定量，并且检测水平低于样品中存在的0.1％ GMO。该方法特别适于在生物样品中低浓度存在的生物体进行多重和综合分析。
0061 根据本发明，遗传扩增的优选方法是使用两个反平行引物进行的PCR，引物对于要被扩增的特定序列而言是共有的。
0062 要被检测和/或被定量的生物体可能存在于任何生物材料中，包括获得的遗传物质(病毒、真菌、细菌、植物或者动物细胞包括人)。生物样品也可以是任何培养基，其中也存在微生物体、异生物(xenobiotic)或者污染物，以及这些来自植物或者动物(包括人)器官、组织、细胞或生物体液(血液、血清、尿等等)的这些提取物。
0063 根据本发明的试剂盒或者装置也可以掺入各种不同培养基或装置，用于实施根据本发明的方法。所述的试剂盒(或装置)也可以包括在自动化的装备中，例如用于检测和/或定量待分析生物样品中存在的多个核苷酸序列的高通量筛选设备。所述的试剂盒或设备可以进行调整，用于进行根据本发明方法的全部步骤或者只进行几个特定的步骤。
0064 本发明的探测和/或定量试剂盒可以包含用于进行本发明的手段和介质，优选是不溶性固相支持物，在其上结合单链捕获核苷酸序列，所述的单链捕获核苷酸序列含有大约10到大约200个碱基的序列，这些序列对待检测和/或定量的总长度在大约30和大约600个碱基之间的P35s、T-nos、nptII、pat、Cry1Ab、EPSPS核苷酸序列中的至少三个是特异的，所述单链捕获核苷酸序列置于根据阵列的固相支持物表面，密度至少是每cm2固相支持物表面4个单链捕获核苷酸序列。
0065 可以使用特异鉴定(探测和/或定量)试剂盒或装置实施根据本发明的方法，试剂盒或装置至少包含不溶性固相支持物，其上以阵列结合一些单链捕获核苷酸序列(优选地是通过直接共价结合或者通过间隔物的结合至固体支持物表面)，密度至少是每cm2不溶性固相支持物表面4，优选至少是10、16、20、50、100、1000、4000、10000或者更多不同的捕获核苷酸序列，所述的捕获核苷酸序列有利地具有的长度包含大约30和大约600个碱基(包括间隔物)并且含有大约10到大约60个碱基的序列，所述的序列对靶标是特异的(这表示所述序列的所述碱基能够通过互补杂交，与它们在靶标序列上的互补碱基形成结合)。优选地，所述杂交在严谨条件下获得(在本领域内技术人员熟知的条件下)。
0066 在根据本发明的该方法、(试剂盒(装置)或者设备)，与靶标互补的捕获核苷酸序列的部分(或者部分)包含大约10到大约60个碱基，优选大约15到大约40个碱基，更优选大约20到大约30个碱基。这些碱基优选地为位于靶标核苷酸序列末端或者靠近末端的连续序列。该序列被认为是对检测特异的序列。在本发明的优选形式中，位于特异捕获核苷酸序列和支持物之间的序列是非特异的序列。
0067 在根据本发明的该方法、(试剂盒(装置)或者设备)中，捕获核苷酸序列是具有16到600个碱基数目、优选30到300个碱基、更优选40到150个碱基的序列，且间隔物是至少6.8nm长(至少4个碳链)的化学链，是20个碱基以上、优选50到150个碱基长的核苷酸序列，或者是核苷酸的衍生物例如PMA。
0068 在本发明的优选实施方案中，捕获核苷酸序列通过化学合成为单链。它们是多聚核苷酸，或者是短于100个碱基的寡聚核苷酸或者是长于100个碱基，在设定好程序的自动合成仪上，单链很容易合成。这些序列可以具有官能基团例如硫化物的胺，用于以高浓度共价结合在支持物上。
0069 通常大于100或者甚至大于150个核苷酸的长捕获核苷酸序列优选地通过PCR扩增(掺入到含有该捕获核苷酸序列的特异部分和非特异部分(间隔物)的质粒中的序列)合成。
0070 根据本发明的方法、(试剂盒(装置)或者设备)，适于对由DNA或RNA组成的核苷酸序列(包括与其全长部分或者完全同源的序列)进行检测和/或定量。
0071 在根据本发明的该方法、(试剂盒(装置)或者装备)中，捕获核苷酸序列有利地共价结合(或固定)在不溶性固相支持物上，优选地通过它们的一端，如后面的描述。
0072 根据本发明的方法给出显著的结果，使对溶液中浓度低于大约10nM，低于大约1nM，优选地低于大约0.1nM，更为优选地低于大约0.01nM(＝1 fmole/100μl)的扩增子进行鉴定(检测和定量)。
0073 本发明的另一个重要方面是在表面上使用浓度非常高的捕获核苷酸序列。使用自动化机器点样制备阵列，点样的溶液体积非常小，在0.1到1n1的量级，斑点的面积大约是直径0.2到0.4nm。如果太低的话，结合的产量迅速降低并且不能被检测。在点样溶液中优选的捕获核苷酸序列浓度为大约600到大约3000nM。但是浓度低至100nM在有利的情况下(当共价固定的产量高或者待检测的靶标是单链并且以高浓度存在)，仍然可以给出阳性结果。这种低的点样浓度可以给出密度低至20fmole每cm2的捕获核苷酸序列。另一方面，较高的密度在检测中只受到捕获溶液浓度的限制，但是高于3000nM的浓度给出良好的结果。
0074 使用这些非常高浓度和长的探针是本发明的两个不可预见的特征。DNA杂交理论提出溶液中两个DNA互补序列之间的杂交速率与DNA长度的平方根成正比，其中较小的DNA是限制因素(Wetmur，J.G.和Davidson，N.1968.J.Mol.Biol.3，584)。为了获得所需的特异性，捕获核苷酸序列的特异序列与靶标相比应当小。而且，靶标核苷酸序列在PCR扩增后获得，是双链的，所以它们在溶液中的重新结合要比与固定在固相支持物上的小序列的杂交快得多，在固相支持物上扩散很慢所以使反应的速率进一步降低。观察到与相同的短特异序列的杂交产量有如此大的增加，这是不可预见的。
0075 与存在的捕获核苷酸序列的量相比，与斑点“结合”的靶标核苷酸序列的量是非常小的。因此捕获核苷酸序列大大过量，并且如果存在更多的捕获核苷酸序列没有理由得到结合。
0076 可以在扩增或复制之后对全长序列进行检测，当通过掺入标记的核苷酸进行标记时，在杂交的靶标上存在较多的标记，这样使检测变得敏感。
0077 根据本发明的该方法、(试剂盒和设备)，可以包含使用其他结合的捕获核苷酸序列，它们与前面的捕获核苷酸可能具有相同的性质，可以用于从另一组同源序列中鉴定靶标序列(优选地通过共同引物扩增)。
0078 对其他序列的检测可以有利地在相同的阵列上进行(即与用于定量的标准核苷酸序列进行杂交)，使用对相同靶标的共有捕获核苷酸序列。所述的其他捕获核苷酸序列(可能)具有长于10到60个碱基的特异序列，总长度可达600个碱基，并且也结合在不溶性固相支持物上(优选地在使用与本发明相关的另一个结合的捕获核苷酸序列制备的阵列中)。长的捕获核苷酸序列也可以在阵列上存在，作为共有捕获核苷酸序列，用于与给定遗传元件的所有序列杂交，这样提供了在生物样品中某一家族的生物体是否存在的信息。
0079 根据本发明的固相支持物是使用选自以下各项的材料制备的凝胶层、玻璃、电子装置、硅或者塑料支持物、多聚物、光盘、金属支持物或者上述的混和物(参见EP 0 535 242，US 5,736,257，WO99/35499，US 5,552,270等等)。有利地，所述的固相支持物是单一玻片，它可能包含其他的工具(条码、标记等)或者基质用于改善根据本发明的方法。
0080 在根据本发明的方法中使用的扩增步骤有利地通过众所周知的扩增实验方案进行，优选地选自由PCR、RT-PCR、LCR、CPT、NASBA、ICR或Avalanche DNA技术。
0081 有利地，待鉴定的靶标核苷酸序列在其与单链捕获核苷酸序列杂交之前进行标记。所述的标记(使用对本领域人员已知的技术)优选地还在变性之前(如果该方法包括扩增步骤)，在扩增的靶标核苷酸序列上获得。
0082 有利地，靶标核苷酸序列长度的选择为有限长度，优选为50和800个碱基，优选为100和400个碱基，更优选为100和200个碱基。这个优选的需要取决于找到用于扩增样品中可能存在的所需序列的共有引物的可能性。过长的核苷酸序列靶标可能会更快地重新分配并且形成在捕获核苷酸序列上固定的二级结构。
0083 基因的检测也是本发明的优选应用。如本发明中描述的，通过首先对mRNA进行逆转录然后使用共有引物进行扩增，获得对同源基因的检测。
0084 根据本发明的另一方面，根据本发明的方法、(试剂盒(装置)或者设备)有利地用于在生物样品中共同或者分别存在的不同GMO的鉴定，所述的鉴定是通过对掺入到植物或动物或细菌或酵母中的核苷酸序列元件(通过它们的基因组的遗传修饰)的检测而获得的。
0085 优选地，引物和待扩增和检测的所述GMO序列的特异部分在实施例2和3中给出。这些引物扩增以下核苷酸序列元件(如果存在与样品中)中至少3个的部分或者全部序列P35s、T-nos、nptII、pat、Cry1Ab和EPSPS，然后在阵列上检测。
0086 根据本发明的另一个方面，根据本发明的方法、(试剂盒(装置)或者设备)有利地用于鉴定至少4个以下的GMO植物BT11，BT176，Ga21，Mon810，RRS，T25，T45，Topas 19/2，Starlink，NK603，GT73，Liberator L62，Falcon GS 40/90，MS1-RF1，MS1-RF2，MS8-RF3，1445，531，Mon 863，Mon810×Mon863，TC1507和Maisgard/RR。
0087 根据本发明检测9个植物GMO在表1和实施例2和3中给出。在
图1中给出进行检测和鉴定的阵列。在表2中给出对21个植物GMO的检测，对GMO进行单独鉴定的数据库在表3中给出。在数据库如BATS(http//www.gmo-watch.org/gmo-watch/GVO-report140703.pdf)和AgBios(http//www.agbios.com/dbase.php)中给出了GMO的清单。
0088 数据库还提供了在GMO中存在的核苷酸序列元件的清单。已知和未知的概念通常与在食物中(谷物或动物饲料中)被接受的或者未被接受的GMO有关。被接受的GMO是众所周知的，且已知它们的遗传图中遗传元件的存在。未被接受的GMO是未知的。本发明在对未知GMO的身份进行预测或者不进行预测的情况下检测未知GMO的存在。
0089 在阵列上杂交之后，靶标核苷酸序列可以通过现有的技术进行检测。不进行标记，优选的方法是通过现已适合于阵列的质谱方法(US-A-5,821,060)或者使用嵌入物质之后用荧光检测(WO97/27329或者Fodor等，Nature 364，p.555(1993))对靶标的鉴定。
0090 标记关联的检测有多个。在WO 97/27317中给出了不同标记分子的综述。通过使用已经标记的引物或者在复制或者扩增步骤中掺入标记的核苷酸，获得这些标记的分子。还可以通过将可以被检测的部分与待测的RNA或DNA连接获得标记(使用连结酶将标记的寡聚核苷酸连接在序列的末端)。RNA或DNA的片段也可以在其5′OH或者3′OH末端使用激酶、转移酶或者类似的酶，掺入标记的核苷酸。
0091 最经常使用和优选的标记是荧光色素例如Cy3、Cy5和Cy7，适于使用商品化可获得的扫描仪(General Scanning，GeneticMicrosystem，......)对阵列进行分析。
0092 使用小分子进行放射性标记、冷标记或者间接标记也是常见的方法，所述的小分子被特异的配基(链亲和素或者抗体)识别。得到的靶标固定在阵列上的信号是荧光的、比色的、扩散、电发光的、生物或化学发光的、磁的、电的如阻抗的或者电压的(US-A-5,312,527)。优选的方法基于使用金标记结合的靶标以获得沉淀，或者使用然后很容易被扫描仪检测和定量的银染色。
0093 定量不仅需要考虑到杂交产量和阵列上的检测比例(对于靶标核苷酸序列和参考序列是相同的)，而且要考虑提取、扩增(或者复制)和标记的步骤。
0094 根据本发明的方法还可以包括使用以已知浓度加入的标准核苷酸序列(外部或者内部标准)获得靶标核苷酸序列定量的手段。捕获核苷酸序列也存在于阵列上，这样以与靶标核苷酸序列相同的条件固定标准(可能在扩增或者复制之后)；该方法包括对来自捕获核苷酸序列和标准之间互补碱基配对形成的双链核苷酸序列产生的信号进行定量的步骤，以及对来自双链核苷酸序列形成产生的信号与来自捕获核苷酸序列和靶标之间互补碱基配对形成的双链核苷酸序列产生的信号之间相关性分析的步骤，目的是定量在生物样品中要被检测的和/或定量的核苷酸序列元件的存在。
0095 有利地，标准加入到生物样品中或者在提取步骤之后加入，并且用相同的引物进行扩增或复制，和/或标准的长度和GC含量与靶标核苷酸序列相同或者相差不超过20％。更优选地，将标准设计为竞争性内部标准，具有在文件WO98/11253中给出的内部标准的特点。该内部标准的序列的一部分与靶标相同，另外还有一个不同的特异部分。它还在其两个末端或者靠近末端具有与用于扩增或复制靶标核苷酸序列的两个引物互补的序列，以及相似的GC含量(WO98/11253)。
0096 在本发明的优选实施方案中，标准和靶标核苷酸序列的共同部分指的是与由相同引物扩增出的所有靶标核苷酸序列同源的核苷酸序列(即核苷酸属于要定量的相同家族或生物体)。
0097 优选地，通过这个特异序列的标准的杂交产量同靶标序列的杂交产量相同或者相差不超过20％，根据WO98/11253的描述进行定量。
0098 在试剂盒(装置)或者设备中也有利地包括标准核苷酸序列外部和/或内部标准，有可能包括进行根据本发明不同步骤的所有介质和手段(杂交和培养介质、聚合酶和其他酶、标准序列、标记分子等等)。
0099 有利地，生物芯片还含有用于特异检测一些由特异引物对扩增的特异扩增靶标核苷酸序列的斑点。优选地加入这些斑点用于对一个生物体鉴定的确证或者区分两个非常同源或者相同的核苷酸序列元件。
0100 有利地，生物芯片还含有具有多种不同(即4)浓度的被标记的捕获核苷酸序列的斑点。这些标记的捕获核苷酸序列从已知浓度的溶液点样，并且它们的信号可以将杂交的结果转化为绝对的量。它们还使得可以对检测的重复性进行测试。
0101 固相支持物(生物芯片)可以插入到一个支持物中，其通过基于微流体技术的液体溶液的控制与另一个小室和自动化机器相连。通过插入这样一个微型实验室系统中，其可以被自动孵育、加热、洗涤和标记，甚至是对于前面的步骤(象DNA提取、PCR扩增)或者接下来的步骤(标记和检测)。所有这些步骤可以在相同的固定支持物上进行。
0102 有利地，生物芯片还含有用于检测和/或鉴定和/或定量植物物种的捕获核苷酸序列。在特定的实施方案中，植物物种的鉴定还用于对某植物物种特异的特定GMO的鉴定。
0103 在特定的实施方案中，植物或生物体的特异核苷酸序列元件，用于植物或生物体的鉴定，在特殊的实施方案中用于GMO的鉴定。
0104 优选地对生物体中存在的遗传元件的信号进行定量，而对该生物体定量。
0105 在另一个实施方案中，一个生物体相对于其家族定量，通过比较该生物体特异的靶标核苷酸序列的量与该家族特异的靶标核苷酸序列的量进行。更为具体的是，通过将样品中存在的特异GMO元件的量与植物标记进行比较，对GMO进行定量。二者之比可以计算在样品中一种植物物种的GMO的百分比。
0106 有利地，通过比较生物体的特异的靶标数量与在被分析的溶液中加入的给定数量的标准品拷贝对样品中特定生物体的拷贝数进行定量。在优选的实施方案中，对遗传修饰植物特异的核苷酸序列元件的定量与以已知拷贝数掺入到检测方法中的标准序列的定量进行比较。在另一个实施方案中，对遗传修饰植物特异的核苷酸序列元件的定量与该植物未转化部分的基因或者序列的定量进行比较。
0107 在特定的实施方案中，在使用加尾引物然后再用与该尾巴相同或者互补的第二组引物对靶标核苷酸序列和标准PCR之后，进行定量。第一组加尾引物具有相同的尾巴，针对的是特异元件和标准或者植物标记，如Knut等，Nucleic Acids Res.2003 Jun 1；31e62的描述。首先使用加尾引物进行5到20个循环的扩增，然后破坏加尾引物，加入(第二组)引物进行5到40个循环。
0108 在优选的实施方案中，在加尾引物和第二组尾巴引物在扩增开始时就同时存在而对第一组引物没有任何破坏的情况下进行扩增，加尾引物和通用尾巴引物之间的适当比例是，至少低5倍，优选低10倍。
0109 有利地，对于GMO的定量和检测方法进行的范围是与非GMO植物相比，样品中存在0.1到5％GMO。通常标准化的标准曲线包含的GMO样品为在非GMO物种中0.1，0.5，1，2和5％的GMO。已知含有GMO的样品中标记的和/或检测的调控范围在0.9％和0.5％之间。未知的GMO是没有被识别作为被接受用于商业流通的GMO，因此在样品中不能找到。需要检测方法检测样品中低至0.1％的这种未知GMO。
0110 在以下的非限制性实施例中参考所附的图片对本发明进行详细描述。
附图简述0111 图1表示了用于检测GMO不同元件以及用于实施例3中所述的筛选和鉴定的阵列的设计。
0112 图2给出了对根据本发明中提供的阵列，对2个GMO分析结果的实例。
0113 图3给出了对根据本发明中提供的阵列，对2个GMO分析结果的实例。
0114 图4表示了根据本发明中提供的阵列对不同浓度的几个GMO进行分析的总体结果。
实施例1在阵列上检测靶标序列捕获核苷酸序列和靶标的制备0115 使用以下的实验方案通过PCR获得靶标核苷酸序列。
0116 PCR在含有下列各项的终体积25μl中进行1×BufferBiotools包括2mM MgCl2，0.2μM每个引物，其中一个引物生物素化，200μM每种dATP、dCTP、dGTP和400μM dUTP，1.25U Taq DNA聚合酶Biotools，0.5U UNG。样品首先在22℃孵育10分钟，然后在94℃变性5min。然后进行由以下组成的35个循环扩增94℃ 30秒，5640秒和72℃ 1分钟，最终的延伸步骤是72℃ 10分钟。与UNG在20℃下孵育10min然后95℃ 10min失活。使用水对照作为扩增的阴性对照。捕获核苷酸的序列是单链核苷酸。
0117 生物芯片还含有阳性对照，它们是已经与其对应的捕获核苷酸序列杂交的生物素化的C2b2基因多聚核苷酸，以及阴性对照，它们是捕获非特异的核苷酸序列。
捕获核苷酸序列的固定化0118 根据Schena等的实验方案(Proc.Natl.Acad.Sci.USA93，10614(1996))将胺化的DNA移植到醛衍生化的玻璃上。从浓度范围在150到3000nM的溶液中点样胺化的捕获核苷酸序列。使用自制的自动化装置，将捕获核苷酸序列印制在硅烷化的显微镜载玻片上(来自Genetix(UK)的250μm针，硅烷化(醛化)的显微镜载玻片来自Cell associates(Houston，USA))。斑点的直径是400μm，分配的体积是大约0.5nl。载玻片在室温下干燥，储存于4℃直至使用。
杂交0119 用杂交框(frame)覆盖阵列，根据生产商(Eppendorf AG，Hamburg，Germany)的建议对阵列进行处理。向50μl杂交溶液(Genomic HybriBuffer，Eppendorf，AG)中加入45μl含有扩增子、封闭杂交溶液、阳性杂交对照和一些水的溶液。根据所需的检测水平和要掺入的扩增子溶液的数目调整扩增的靶标核苷酸序列的体积。通常的实验使用4个扩增子溶液每种9μl进行。将最终的溶液加到被杂交小室包围的阵列上。对于阳性对照我们向溶液中加入2nM生物素化的27bp C2b2探针；它们对应的捕获核苷酸序列点样于阵列上。阵列事先与0.5N NaOH孵育进行预变性。杂交在60℃进行1h。使用洗涤缓冲液洗涤载玻片4次。
比色检测0120 玻璃样品在室温下与800μl用封闭缓冲液1000×稀释的胶体金标记的链亲和素共同孵育45min。使用洗涤缓冲液洗涤5次以后，金的存在用于银还原的催化作用，其使用染色显示溶液(Silverquant reagent，Eppendorf，Hamburg，Germany)。载玻片与Silverquant A和B溶液的显示混合物孵育1次5min，然后用水润洗，干燥并使用微阵列阅读仪进行分析。然后用特殊的定量软件对每个阵列(载玻片)进行定量。
荧光检测0121 玻璃样品在室温下与Cyanin 3或者Cyanin 5标记的链亲和素孵育45分钟。载玻片洗涤后干燥，室温储存。在阵列扫描仪GSM418中进行检测(Genetic Microsystem，Woburn，MA，USA)。然后用特殊的定量软件对每个阵列(载玻片)进行定量。
实施例2 在阵列上检测GMO靶标序列GMO遗传元件的分析0122 根据实施例1进行实验。进行三个PCR，扩增以下的元件PCR1对于Nos终止子TTGAATCCTGTTGCCGGTCTT和CGCTATATTTTGTTTTCTATCGCG35S启动子CGTCTTCAAAGCAAGTGGATTG和TCTTGCGAAGGATAGTGGGATTnptIICTCGACGTTGTCACTGAAG和GATGGATACTTTCTCGGCAGPCR对照CCACCTGCTGACCCCGTC和GGGACCCTCGCCCAGAAACPCR2CaMV GTTGTTCTATTAGTTGCTCTT和ATGGCTAATCTTAATCAGATCCPnos-nptII CCTCGGTATCCAATTAGAGTC和TTGTCTGTTGTGCCCAGTCATPCR3PatGAGGCGCAAGGTTTTAAGTCT和CATCATGCCATCCACCATGCCry1AbCMCWCAGAACAACAAYGTGC和GWGCWCKGATGATGCTCACGEPSPSCAAGTCGMTYTCCMACCGG和CCTTGCCCGTATTGATGACG和GTCAAGGACCGCATTGCGA在捕获核苷酸序列中存在以下的特异序列，用于待测的不同元件P35SGTCATCCCTTACGTCAGTGGAGATATTnosGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCnptIIAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAgut(PCR对照)GGGACTGGCTGCTATTGGGCGAApat1CTGTGTATCCCAAAGCCTCATGCAAcry1CAGACGGTGGCTGAAGCCCTGTCGcry2GAGCCTGTGGGAAAAACCCTGCCT
cry3CAACCTGTGGGAGAATCCTTGCCTepsps7CTCCTACTCGCCGCCCTGTCCGAepsps8TTCATGTTCGGCGGTCTCGCGAGnptIIhCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCCaMVCGHTTTCATGGATTTTTGGTCACTG0123 捕获核苷酸序列cry1对BT176是特异的；cry2对Mon 8110是特异的；cry3对BT11是特异的。捕获核苷酸序列EPSPS7对GA1是特异的；EPSPS2对RRS是特异的。
0124 生物芯片还包括了植物物种的检测。扩增在分开的试管中进行。
0125 用于扩增Rubisco活化酶和蔗糖合酶的共有引物是引物 序列Rubisco活化酶基因Pra1正向 5′-ACAACCAGATGGTBAACGC-3′Pra2反向 5′-GCCCAGTAYAARTTCTCCA-3′蔗糖合酶基因 Pss1正向 5′-GGTTTGGAGARRGGNTGGGG-3′Pss2反向 5′-TCCAADATGTAVACAACCTG-3′用于检测植物物种的捕获核苷酸序列如下用于特异鉴定六个植物物种的捕获探针捕获探针名称 序列(5′-3′) 植物识别的区域TPss8 AGAGGAGGTGGATAGTCTCCTGTG 玉米蔗糖合酶基因TPss9 AGAGAAGTTGAATTGACTCAAGGA 大豆蔗糖合酶基因TPss7 GAAGCAAGTGGATGGTGTCAAGCA 水稻蔗糖合酶基因OTRco12 TGATGGGAACACGTGCGTTTTCTT 油菜Rubisco活化酶基因PTRtom4 GTACCCTGGCGTTCTCTTGCTTGT 番茄Rubisco活化酶基因PTRbett2 TGATGGGTACACGAGCATTGTCCT 甜菜Rubisco活化酶基因实施例3在阵列上检测GMO靶标序列，包括特异的植物鉴定
0126 使用如实施例2中描述的3个PCR和捕获探针进行GMO的检测。在以下的实施例中，加入第四个PCR，用于分析植物物种-PCR4·植物凝集素(大豆)CATTACCTATGATGCCTCCACC和AAGCACGTCATGCGATTCC·cruciferin(油菜籽)AGAGACGAAGGAAGCGAAGGand TGACCCATCTAATGCTGACG·蔗糖转化酶(玉米)GCGCTCTGTACAAGCGTGC和GCAAAGTGTTGTGCTTGGACC·rDNA(番茄)GTTTCAAAAGTAACACGGCAA和GGCTTGATAAATGAACTCAACT·Rbc1(植物共同的)AGYCTTGATCGTTACAAAGG和AGGTCTAADGGRTAAGCTAC在捕获探针中存在以下的特异序列对于大豆凝集素CTGCCACGGGACTCGACATACCT对于油菜籽cruciferinTTCAGAGTGCTGATGTAACCGAGCT对于玉米转化酶TTAGACGGGAAAACGAGAGGAAGC对于番茄rDNACTCGCAATGGGGCTCAGAACGCA对于普遍的植物ATAAGCAATATATTGATTTTCTTCTCCAGCAACGGGCTCGATGTGGTAGCATCGC
表I不同GMO遗传图的理论分析，针对特异元件存在或者不存在
表II不同GMO遗传图的理论分析，针对特异元件存在或者不存在
表III根据实施例3中提供的阵列对整体型式差异的分析，针对特异元件存在或者不存在以下GMO
表IV根据本发明中提供的阵列对几个GMO的分析。特定捕获探针的强度平均值(S-B)对所检测的GMO百分比的函数。
序列表<110>Eppendorf Array Technologies SA<120>在阵列上对遗传修饰植物特异的核苷酸序列元件的鉴定和/或定量<130>BP.EATE.007A/EP<160>56<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向Tnos引物<400>1ttgaatcctg ttgccggtct t21<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向Tnos引物<400>2cgctatattt tgttttctat cgcg 24<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向P35S引物
<400>3cgtcttcaaa gcaagtggat tg 22<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向P35S引物<400>4tcttgcgaag gatagtggga tt 22<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向nptII引物<400>5ctcgacgttg tcactgaag 19<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向nptII引物<400>6gatggatact ttctcggcag 20<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>PCR对照正向引物<400>7ccacctgctg accccgtc18<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR对照反向引物<400>8gggaccctcg cccagaaac 19<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向CaMV引物<400>9gttgttctat tagttgctct t21<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向CaMV引物<400>10atggctaatc ttaatcagat cc 22
<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向Pnos-nptII引物<400>11cctcggtatc caattagagt c21<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向Pnos-nptII引物<400>12ttgtctgttg tgcccagtca t21<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向Pat引物<400>13gaggcgcaag gttttaagtc t21<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向Pat引物
<400>14catcatgcca tccaccatgc 20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向Cry1Ab引物<400>15cmcwcagaac aacaaygtgc 20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向Cry1Ab引物<400>16gwgcwckgat gatgctcacg 20<210>17<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>EPSPS引物1<400>17caagtcgmty tccmaccgg 19<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>EPSPS引物2<400>18ccttgcccgt attgatgacg 20<210>19<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>EPSPS引物3<400>19gtcaaggacc gcattgcga 19<210>20<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>P35S捕获核苷酸序列<400>20gtcatccctt acgtcagtgg agatat 26<210>21<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Tnos捕获核苷酸序列<400>21gagatgggtt tttatgatta gagtcc 26
<210>22<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>nptIIA捕获核苷酸序列<400>22gggactggct gctattgggc gaa 23<210>23<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>gut(PCR对照)捕获核苷酸序列<400>23gggactggct gctattgggc gaa 23<210>24<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Pat1捕获核苷酸序列<400>24ctgtgtatcc caaagcctca tgcaa25<210>25<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>cry1捕获核苷酸序列
<400>25cagacggtgg ctgaagccct gtcg 24<210>26<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>cry2捕获核苷酸序列<400>26gagcctgtgg gaaaaaccct gcct 24<210>27<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>cry3捕获核苷酸序列<400>27caacctgtgg gagaatcctt gcct 24<210>28<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>epsps7捕获核苷酸序列<400>28ctcctactcg ccgccctgtc cga 23<210>29<211>23<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>epsps8捕获核苷酸序列<400>29ttcatgttcg gcggtctcgc gag 23<210>30<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>nptIIh捕获核苷酸序列<400>30ccgcttgggt ggagaggcta ttc 23<210>31<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CaMV捕获核苷酸序列<400>31cghtttcatg gatttttggt cactg25<210>32<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向rubisco活化酶基因引物Pra1<400>32acaaccagat ggtbaacgc 19
<210>33<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向rubisco活化酶基因引物Pra2<400>33gcccagtaya arttctcca 19<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向蔗糖合酶基因引物Pss1<220>
<221>misc_特征<222>(15)..(15)<223>n is a，c，g，ort<400>34ggtttggaga rrggntgggg 20<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向蔗糖合酶基因引物Pss2<400>35tccaadatgt avacaacctg 20<210>36<211>24
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>玉米TPss8捕获核苷酸序列<400>36agaggaggtg gatagtctcc tgtg 24<210>37<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>大豆TPss9捕获核苷酸序列<400>37agagaagttg aattgactca agga 24<210>38<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>稻TPss7捕获核苷酸序列<400>38gaagcaagtg gatggtgtca agca 24<210>39<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>油菜籽OTRcol2捕获核苷酸序列<400>39tgatgggaac acgtgcgttt tctt 24
<210>40<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>番茄PTRtom4捕获核苷酸序列<400>40gtaccctggc gttctcttgc ttgt 24<210>41<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>甜菜PTRbett2捕获核苷酸序列<400>41tgatgggtac acgagcattg tcct 24<210>42<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向大豆凝集素引物<400>42cattacctat gatgcctcca cc 22<210>43<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向大豆凝集素引物<400>43aagcacgtca tgcgattcc 19<210>44<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向油菜籽cruciferin引物<400>44agagacgaag gaagcgaagg 20<210>45<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向油菜籽cruciferin引物<400>45tgacccatct aatgctgacg 20<210>46<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向玉米转化酶引物<400>46gcgctctgta caagcgtgc 19<210>47<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向玉米转化酶引物<400>47gcaaagtgtt gtgcttggac c21<210>48<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向番茄rDNA引物<400>48gtttcaaaag taacacggca a21<210>49<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向番茄rDNA引物<400>49ggcttgataa atgaactcaa ct 22<210>50<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向植物通用Rbc1引物<400>50agycttgatc gttacaaagg 20
<210>51<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向植物通用Rbc1引物<400>51aggtctaadg grtaagctac 20<210>52<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>大豆凝集素捕获核苷酸序列<400>52ctgccacggg actcgacata cct 23<210>53<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>油菜籽cruciferin捕获核苷酸序列<400>53ttcagagtgc tgatgtaacc gagct25<210>54<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>玉米转化酶捕获核苷酸序列<400>54ttagacggga aaacgagagg aagc 24<210>55<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>番茄rDNA捕获核苷酸序列<400>55ctcgcaatgg ggctcagaac gca 23<210>56<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>通用植物捕获核苷酸序列<400>56ataagcaata tattgatttt cttctccagc aacgggctcg atgtggtagc atcgc5权利要求
1.通过鉴定和/或定量不同的多个核苷酸序列元件鉴定遗传修饰植物的方法，所述核苷酸序列元件对应于整合到所述遗传修饰植物基因组中的外源核苷酸序列的至少一部分，其中所述的元件存在于生物样品中，并且其中该方法包括以下步骤a.可能从生物样品中提取核苷酸序列元件；b.将核苷酸序列元件或其部分扩增或者复制成靶标核苷酸序列，使用能够扩增所述核苷酸序列元件的引物，所述的核苷酸序列元件与在至少两种不同的遗传修饰植物中的核苷酸序列元件是同源的，其中所述的核苷酸序列元件选自由以下启动子、终止子和/或标记物序列组成的组P35s、T-nos、nptII、pat、Cry1Ab和EPSPS，其中靶标核苷酸序列的长度包含大约100到大约200个碱基；c.可能对获得的靶标核苷酸序列进行标记；d.将获得的靶标核苷酸序列与通过共价连接结合在固相支持物表面上特定位置的不溶性固体支持物的单链捕获核苷酸序列接触；e.通过检测所述靶标核苷酸序列与其位于特定位置的相应的捕获核苷酸序列互补碱基配对杂交产生的信号，检测所述靶标核苷酸序列的结合，其中捕获核苷酸序列被结合在阵列的特定位置的不溶性固相支持物上，所述阵列的密度是每cm2固相支持表面至少4个不同的结合单链捕获核苷酸序列，其中的捕获核苷酸序列包含具有10到200个碱基的序列，这允许捕获核苷酸与待检测的和/或定量的靶标核苷酸特异杂交；f.对于第二个、第三个、第四个或者更多所述遗传修饰植物特异的不同核苷酸序列元件重复步骤b)到e)；g.基于这些不同的多个核苷酸序列元件的存在或者不存在构建遗传图；以及h.基于所述遗传图确定遗传修饰的植物。
2.根据权利要求1的方法，其中核苷酸序列元件具有的长度在大约100到大约800个核苷酸之间，更优选地在大约100和大约200个核苷酸之间，核苷酸序列元件对应于整合到遗传修饰植物基因组中的外源核苷酸序列的至少一部分。
3.根据权利要求1或2的方法，其中能够与其对应的靶标核苷酸序列杂交的捕获核苷酸序列通过至少为6.8nm的间隔物与固相支持物表面隔开。
4.根据权利要求1或2的方法，其中的捕获核苷酸序列包含了具有10到49个碱基的序列，这样允许与待检测和/或定量的靶标核苷酸序列的特异杂交。
5.根据权利要求3的方法，其中整合到植物基因组中的外源核苷酸序列选自由下列各项组成的组抗生素抗性基因，调控序列，重复序列和/或编码特异酶活性的基因。
6.根据前面任何一项权利要求的方法，其中的遗传修饰植物选自由下列各品种组成的组BT11，BT176，Ga21，Mon 810，RRS，T25，T45，Topas 19/2，Starlink，NK603，GT73，Liberator L62，Falcon GS 40/90，MS1-RF1，MS1-RF2，MS8-RF3，1445，531，Mon 863，Mon810×MON863，TC1507，Maisgard/RR。
7.根据前面任何一项权利要求的方法，其中的核苷酸序列元件通过共有引物被扩增成靶标核苷酸序列。
8.根据前面任何一项权利要求的方法，其中的核苷酸序列元件是用相同的引物对逆转录为cDNA的mRNA序列。
9.根据前面任何一项权利要求的方法，其中与不同遗传修饰植物特异的核苷酸序列元件相对应的靶标核苷酸序列在相同的捕获核苷酸序列上检测。
10.根据前面任何一项权利要求的方法，其中与不同遗传修饰植物特异的核苷酸序列元件相对应的靶标核苷酸序列在不同的捕获核苷酸序列上检测。
11.根据前面任何一项权利要求的方法，其中步骤b)扩增和/或复制对不同遗传修饰植物特异的不同的核苷酸序列元件在同时进行。
12.根据前面任何一项权利要求的方法，其中步骤c)到e)检测和/或定量与不同遗传修饰植物特异的核苷酸序列元件相对应的靶标核苷酸序列在同时进行。
13.根据前面任何一项权利要求的鉴定方法，其中的间隔物是包含大约20到大约150个碱基的核苷酸序列。
14.根据前面任何一项权利要求的方法，其中在特定位置结合在固相支持物表面的捕获核苷酸序列的密度高于每cm2固相支持物表面10fmole，优选高于每cm2固相支持物表面100fmole。
15.根据前面任何一项权利要求的定量方法，其中使用第一加尾的引物和与该尾巴相同或互补的第二引物进行PCR扩增，将核苷酸序列元件扩增成靶标核苷酸序列。
16.根据权利要求15的定量方法，其中在使用第二引物扩增之前，首先破坏加尾的引物。
17.根据权利要求15或16的定量方法，其中从第一个扩增步骤开始，第一加尾引物和第二尾巴引物同时存在，加尾的引物浓度比尾巴引物的浓度至少低5倍。
18.根据前面权利要求15到17中任何一项的定量方法，进一步包括对其它核苷酸序列而非核苷酸序列元件的扩增，使用与核苷酸序列元件的扩增和/或复制步骤中使用的引物不同的引物对。
19.根据权利要求17的定量方法，其中进行另一扩增步骤的其它核苷酸序列是植物物种、植物属或者植物科检测特异的核苷酸序列。
20.根据前面权利要求15到19中任何一项的定量方法，其中对遗传修饰植物特异的核苷酸序列元件的定量与植物非转化部分的基因或者序列的定量相比较。
21.根据前面权利要求15到20中任何一项的定量方法，其中对遗传修饰植物特异的核苷酸序列元件的定量与以已知拷贝数掺入到检测方法中的标准序列的定量相比较。
22.根据前面任何一项权利要求的方法，其中的不溶性固相支持物选自由下列各项组成的组玻璃、电子装置、硅支持物、塑料支持物、光盘、滤膜、凝胶层、金属支持物或者它们的混合物。
23.根据前面任何一项权利要求的方法，其中的核苷酸序列元件是使用了共有引物以及可能使用了终止序列进行3′或5′末端逆转录的RNA序列。
24.根据前面任何一项权利要求的方法，其中的固相支持物携带捕获核苷酸序列，用于与同源的靶标核苷酸序列结合，还携带共有序列，用于对与存在于不同遗传修饰植物中的相同核苷酸序列元件相对应的所有同源或者相同靶标序列进行共同检测。
25.根据前面任何一项权利要求的方法，其中的方法还包括对至少一个标准进行扩增，其信号用于对样品中的不同的多个核苷酸序列元件的量进行定量。
26.根据前面任何一项权利要求的方法，其中的方法还包括对至少一个标准进行扩增，其信号用于对样品中的不同的多个核苷酸序列元件的量的拷贝数进行定量。
27.根据前面任何一项权利要求的方法，其中对来自相同科或者相同种的样品中的不同的多个核苷酸序列元件的特异量的定量，通过比较植物特异元件的量与在同一科或者同一种的所有成员中都存在的元件的量进行。
28.探测和/或定量试剂盒，包含实施根据前面任何一项权利要求的方法的手段和介质、单链捕获核苷酸结合于其上的不溶性固相支持物，所述的单链捕获核苷酸序列含有大约10到大约200个碱基的序列，对于下列中的至少四个是特异的待测和/或待定量的、总长度包含大约30-大约600个碱基的P35s、T-nos、nptII、pat、Cry1Ab和EPSPS核苷酸序列元件，所述的单链捕获核苷酸序列被置于根据阵列的固相支持物的表面，密度为每cm2固相支持物表面至少4个单链捕获核苷酸序列。
29.根据权利要求28的探测试剂盒，其中的捕获核苷酸序列含有对待测和/或待定量的P35s、T-nos、nptII、pat、Cry1Ab和EPSPS核苷酸序列元件特异的以下序列GTCATCCCTTACGTCAGTGGAGATAT(P35s)；GAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCC(T-nos)；GGGACTGGCTGCTATTGGGCGAA(nptIIA)；CCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTC(nptIIh)；CTGTGTATCCCAAAGCCTCATGCAA(pat)；CAGACGGTGGCTGAAGCCCTGTCG(Cry1Ab-1)；GAGCCTGTGGGAAAAACCCTGCCT(Cry1Ab-2)；CAACCTGTGGGAGAATCCTTGCCT(Cry1Ab-3)；CTCCTACTCGCCGCCCTGTCCGA(EPSPS7)；TTCATGTTCGGCGGTCTCGCGAG(EPSPS8)，其中的捕获核苷酸序列Cry1Ab-1对BT176特异，Cry1Ab-2对Mon 8110特异以及Cry1Ab-3对BT11特异，且其中的捕获核苷酸序列EPSPS7对GA1特异，EPSPS8对RRS特异。
30.根据权利要求28的探测试剂盒，包括以计算机程序形式的手段，用于分析在检测和/或鉴定不同遗传元件中以及在鉴定生物体中获得的实验结果。
31.根据权利要求28的探测试剂盒，包括具有可能可以被检测出的生物体的遗传元件组成的数据库。
全文摘要
本发明涉及从待分析的样品中可能存在的具有同源序列的许多其他生物体中，通过确定生物体的遗传图，鉴定和/或定量几种生物体的方法。该方法组合了以下各项使用共同引物对进行有限数目的靶标序列的扩增；在阵列上记录对捕获序列和它们的对应靶标序列之间的结合产生的单一信号的存在；以及将所述的被检测的靶标序列的存在与所述(微)生物的一些遗传特异序列(被称为遗传元件)的鉴定联系起来；由此获得对生物体的鉴定。根据本发明的方法和装置使得可以容易地从其他同源序列中鉴定/检测出某生物体特异的序列，并且可能对其定量。
文档编号C12Q1/68GK1876844SQ200610082430
公开日2006年12月13日 申请日期2006年5月16日 优先权日2005年5月17日
发明者J·雷马克, S·哈默尔斯 申请人:埃佩多夫阵列技术股份有限公司