一种利用微小核糖核酸提高牛克隆效率的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用微小核糖核酸提高牛克隆效率的方法，在体细胞核移植的电融合液中加入bta?miR?125b mimic，可以有效地导入到胚胎中，在避免产生转染的二次损伤的同时，还能有效地减弱体细胞克隆胚在合子激活时期的组蛋白H3K9me3表观遗传修饰水平，显著提高牛体细胞克隆囊胚的发育率和质量。
【专利说明】
一种利用微小核糖核酸提高牛克隆效率的方法
技术领域
[0001 ]本发明属于动物体细胞克隆技术领域，涉及一种基于体细胞核移植构建的牛体细 胞克隆胚的处理方法，具体涉及一种利用微小核糖核酸减弱克隆胚中组蛋白甲基化水平来 提尚牛克隆效率的方法。
【背景技术】
[0002] 体细胞克隆是一项具有巨大研究和商用价值的技术，可应用到治疗性克隆、疾病 模型、人类器官移植、动物转基因研究、频临灭绝动物品种保护以及优良家畜品种扩增等方 面。但至今体细胞克隆效率仍然不高，显著制约着此技术的广泛应用。
[0003] 目前认为，克隆效率低下的主要原因是供体体细胞核没有被受体卵胞质完全的重 编程，即重编程失败或不完全。此重编程过程中没有涉及基因序列的变化，主要是表观遗传 修饰的变化。表观遗传修饰主要包括组蛋白甲基化和DNA甲基化两方面。
[0004] 研究发现组蛋白H3赖氨酸K9的3甲基化(H3K9me3)是体细胞重编程过程中主要的 表观修饰障碍。已经有报道在肝癌细胞和平滑肌细胞中发现miR-125b能够降低组蛋白H3赖 氨酸K9的3甲基化（[l]"Fan DN，Tsang FH，Tam AH，Au SL，Wong CC，Wei L，Lee JM，He X，Ng IO1Wong CM.Histone lysine methyltransferase , suppressor of variegation 3-9homolog I,promotes hepatocellular carcinoma progression and is negatively regulated by microRNA-125b.Hepatology 2013;57:637-647." 以及[2] "Villeneuve LM, Kato M1Reddy MA1Wang M1Lanting L,Natarajan R.Enhanced levels of microRNA-125b in vascular smooth muscle cells of diabetic db/db mice lead to increased inflammatory gene expression by targeting the histone methyltransferase Suv39hl. Diabetes 2010; 59:2904-2915."）。但是到目前为止，尚未见到利用减弱克隆胚中 组蛋白甲基化水平的方法提高牛克隆效率的相关报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种利用微小核糖核酸提高牛克隆效率的方法。
[0006] 为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0007] 该提高牛克隆效率的方法，包括以下步骤:将牛体细胞注入去核卵母细胞，然后利 用所述牛体细胞和去核卵母细胞通过电融合形成胚胎的过程，使预先加入至电融合液的 miR-125b或miR-125b mimic转染入所述胚胎中，从而降低所述胚胎中的H3K9me3,并提高牛 体细胞克隆囊胚的发育率和质量。
[0008] 所述去核卵母细胞由具有极体的牛卵母细胞制备得到。
[0009] 所述牛体细胞为直径15~20μπι的牛胎儿成纤维细胞。
[0010] 所述提高牛克隆效率的方法，具体包括以下步骤：
[0011 ] 1)电融合前在50yL电融合液中加入bta_miR-125b mimic，使bta_miR-125b mimic 在电融合液中的终浓度为200~500nM;将牛体细胞注入到去核卵母细胞得重构体，将重构 体置于加入有bta-miR-125b mimic的电融合液中进行电融合；
[0012] 2)在电融合后对融合得到的牛体细胞克隆胚进行激活处理，激活处理后进行胚胎 培养。
[0013] 所述电融合具体包括以下步骤:将重构体在加入有bta-miR-125b mimic的电融合 液中预平衡2~5min;然后采用微电极法进行融合，融合参数为：电压为32V、脉冲时长为20μ s、2次脉冲间隔为10ms。
[0014] 所述激活处理具体包括以下步骤:将牛体细胞克隆胚于2~5ymol/L离子霉素的 mSOF溶液中室温孵育4min，然后在38.5°C、5%⑶2以及饱和湿度条件下于1~2mmol/L6-DMAP的mSOF溶液中培养4h。
[0015] 所述胚胎培养具体包括以下步骤：将进行激活处理后的牛体细胞克隆胚转移到 Gl. 5培养液中，在38.5°C、5%⑶2以及饱和湿度条件下培养4h，再用Gl. 5培养液清洗该牛体 细胞克隆胚3~5次，继续在Gl. 5培养液中培养56h;然后将该牛体细胞克隆胚转移到G2.5培 养液中继续在38.5 °C、5 % CO2以及饱和湿度条件下培养4~5天。
[0016] 作为培养基的Gl. 5以及G2.5培养液上覆盖有石蜡油，并预先在38.5 °C、5 % CO2以 及饱和湿度条件下平衡至少2h，然后将牛体细胞克隆胚移入Gl. 5或G2.5培养液液滴中，开 始培养。
[0017] 所述Gl. 5以及G2.5培养液液滴中放置18~20枚牛体细胞克隆胚，Gl. 5以及G2.5培 养液液滴的体积为120~150yL。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0019] 本发明在核移植同时借助电融合成功转染microRNA(例如bta-miR_125b mimic)， 利用转染的microRNA有效降低和控制核移植中牛Suv39hl表达水平，从而有效减弱和控制 体细胞克隆胚在合子激活时期的组蛋白H3K9me3表观遗传修饰水平。不仅避免了将 microRNA转染体细胞或注入胚胎所引起的二次损伤，而且显著提高牛体细胞克隆囊胚的发 育率和质量，从而提高了牛克隆效率。
【附图说明】
[0020] 图1为bta-miR_125b mimic处理胚胎以及核移植示意图；
[0021 ]图2为在50yL电融合液中加入IyL 20μΜ的control mimic或bta_miR-125b mimic 后胚胎在2-细胞时期（即卵裂)的miR-125b的相对表达量(Relative Expression);
[0022] 图3为牛体细胞克隆胚2-细胞时期Western Blot检测的H3K9me3修饰水平；
[0023]图4为牛体细胞克隆胚2-细胞时期免疫荧光检测的H3K9me3修饰水平；
[0024]图5为利用本发明制备的牛体细胞克隆胚胎(Bta-miR-125b mimic)与对照组的牛 体细胞克隆胚胎(Control mimic)第7d的显微视图。
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限 定。
[0026] miR-125b是早期胚胎中富含的一种microRNA，能够抑制组蛋白甲基化转移酶 Suv39hl，从而有效去除组蛋白H3赖氨酸K9的3甲基化(H3K9me3)表观遗传修饰。通过转染 miR-125b，可有效降低克隆胚在合子激活时期的组蛋白H3K9me3表观遗传修饰水平，达到促 进体细胞克隆胚正常发育的目的。据此，本发明在牛体细胞核移植的电融合液中加入bta-miR_125b mimic，可以将bta-miR_125b mimic有效地导入到牛体细胞克隆胚中，实现对克 隆胚转染miR-125b。从而降低牛体细胞克隆胚在合子激活时期的组蛋白H3K9me3表观遗传 修饰水平，显著提高牛体细胞克隆囊胚的发育率和质量。
[0027] 本发明进一步的研究发现，特定电融合参数下，bta-miR-125b mimic在电融合液 中的浓度水平对能否提高牛体细胞克隆囊胚的发育率和质量具有重要影响。
[0028]所述bta-miR-125b mimic的序列为5'-UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA-3' (序列表中 SEQ.ID.N0.1)〇
[0029](一)具体的操作过程
[0030] 1)首先给出试剂和培养液/处理液的来源或制备：
[0031 ] bta-miR_125b mimic由Ribobio公司合成(合成时间2014年1月），碱性成纤维细胞 生长因子bFGF、青霉素、链霉素、无机盐、石蜡油为s i gma公司产品，DMEM液体培养基和Opt i -MEM液体培养基、PBS、细胞消化液和特级胎牛血清（FBS)为Gibco产品，胚胎培养液Gl. 5、 G2.5均购买于vitrolife公司。H3K9me3的抗体购自Abcam公司，货号ab8898。其他未标明的 均为sigma公司产品。
[0032] a、卵母细胞体外成熟培养液
[0033] 该成熟培养液为TCM199液中添加2.2mg/mL NaHC03、0.075IU/mL HMG、lyg/mL170-E2、0.33mM丙酮酸钠、2mML-谷氨酰胺以及100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
[0034] b、mS0F
[0035] mSOF是以SOF培养液作为基础培养基，还包含有体积分数2%的BME、体积分数I % 的MEM、体积分数1%的ITS、lmmol/L的谷氨酰胺、80mg/mL的BSA、100IU/mL的青霉素和 0 · lmg/mL的链霉素。
[0036](：、电融合液的配方为：0.3111〇1/1^甘露醇、0.05111〇1/1^氯化|丐、0.1111〇1/1^硫酸镁、 0.27111〇1/1组氨酸以及0.1%85八。
[0037] 2)下面给出体细胞核移植技术生产牛克隆胚胎的过程
[0038] a.牛胎儿成纤维细胞(体细胞，Somatic Cell)培养
[0039] 牛皮肤成纤维细胞来源于一月龄荷斯坦母牛(采集自杨凌科元克隆股份有限公司 牛场，2014年1月至2016年3月）。用剪刀剪一块耳部皮肤组织，放入PBS中，带回实验室。用无 菌的生理盐水洗3遍，放入70%的酒精中浸泡5min，再用生理盐水洗3遍，之后用灭菌剪刀剪 成碎块（1~2mm 3)，组织块用含青霉素(3001U/mL)、链霉素(300yg/mL)的PBS洗涤多次后，均 匀放置在培养皿(60 X 15mm)中，每小块组织间距大约0.5cm。然后将培养皿倒置，在38.5 °C、 5%⑶2、饱和湿度培养箱中培养40min左右，使组织块贴附于培养皿表面。然后再加入微量 培养液，以刚刚漫过组织块为好，继续在培养箱中培养，培养液为DMEM+10 % FCS。24h后，加 入约2mL的DMEM液体培养基继续培养，以后每3d全量换液(DMEM液体培养基）。有细胞单层形 成时去掉组织块，当细胞长至90 %汇合时传代，3~5代细胞作为核供体，于核移植前在含 0.5%FCS DMEM液体培养基中饥饿处理3~5d，诱导细胞进入GO期，然后用0.25%胰酶-EDTA 消化，1500rpm5min离心洗涤3次，然后将100~200个细胞悬浮于注核液微滴备用。
[0040] b.卵母细胞的成熟培养
[0041 ]牛卵巢采自陕西省西安市三桥定点屠宰场(采集时间2014年1月至2016年3月），卵 巢取自当天屠宰的牛，将卵巢置于装有含青、链霉素的20~25°C的生理盐水的保温瓶中，5h 以内运回试验室。卵巢运回后，用灭菌剪刀剪除卵巢表面的结缔组织、脂肪和附着的输卵 管，在高压灭菌过的无菌生理盐水中清洗三次，用装有12G针头的IOmL注射器抽取卵巢表面 2~8mm卵泡中的细胞，放入6cm玻璃皿中，在实体显微镜下收集卵丘-卵母细胞复合体 (cumulus-oocyte complexes，COCs)。收集后在含5~15%血清(FBS)的PBS中清洗三遍。选 择形态正常的A、B级COCs用于体外成熟培养。A级COCs:胞质均匀、卵丘细胞致密、最少有5层 卵丘细胞完全包裹卵母细胞;B级COCs:卵丘细胞为2~4层，基本上包裹卵母细胞。
[0042]将采集的COCs在成熟液(卵母细胞体外成熟培养液）中洗两遍，然后移入装有3毫 升成熟液(卵母细胞体外成熟培养液)的3cm平皿中（提前在培养箱平衡一小时），在38.5 °C、 5 % CO2、饱和湿度条件下培养24~26h。将培养成熟的COCs用I3BS液清洗3次，放入含0.1 %透 明质酸酶的无 Ca2+、Mg2+PBS中消化1~2min，并用1000 mL移液枪反复吹打COCs，以除去卵母 细胞外扩散的卵丘细胞。吹打干净后，在PBS中洗3次，然后在实体视显微镜下，以异物针拨 动卵母细胞，挑选有极体的卵母细胞(成熟卵母细胞，Matured Oocyte)待用。
[0043] c.牛体细胞克隆胚的构建(参见图1)
[0044] i去核（Enucleation):
[0045] 去核前卵母细胞先在含7.5yg/mL细胞松弛素 B、10yg/mL Hoechst 33342和体积浓 度10%FBS的PBS中孵育15min。在显微操作仪下，用内径为20μπι的去核管吸取第一极体及其 周围的部分卵胞质，紫外光照射吸出的卵胞质团检查去核情况。完全去除第一极体及染色 体的卵母细胞(简称去核的卵母细胞)被用于核移植。
[0046] ? 注核和电融合(Electrofusion):
[0047]注核时挑选直径为15~20μπι的待移植的牛体细胞注入去核的卵母细胞透明带下。 注核后形成的重构体采用微电极法进行融合。融合前在50yL电融合液中加入IyL的20μΜ的 bta-miR-125b mimic(参见序列表中SEQ.ID.N0.1)，使其在电融合液的终浓度为400ηΜ，并 将重构体在加入有bta-miR-125b mimic的电融合液中预平衡3min(静置3分钟，室温）。电融 合在150倍的显微操作仪下进行，用于融合操作的两根"Z"字形微电极顶端直径为15μπι，后 端连于显微操作仪上，使供体、受体细胞膜接触面与两电极的连线垂直，融合参数为：电压 为32V、脉冲时长20ys、2次脉冲间隔10ms，融合需要2次脉冲。融合后Ih在显微镜下观察融合 情况。
[0048] d、牛体细胞克隆胚的激活与培养(In vitro culture)
[0049] 在电融合之后lh，挑选成功融合的牛体细胞克隆胚进行以下激活处理（用离子霉 素 Ionomycin联合6-DMAP激活）：首先在5ymol/L离子霉素的mSOF溶液中室温孵育4min，然后 在2mmo 1/L6-DMAP的mSOF溶液中，在38.5 °C、5 % CO2、饱和湿度条件下培养4h。
[0050] 牛体细胞克隆胚在进行激活处理后转移到Gl.5培养液中，在38.5°C、5%⑶2、饱和 湿度条件下培养4h，再用Gl. 5培养液清洗3~5次，继续在Gl. 5培养液中培养至60h。然后将 牛体细胞克隆胚转移到G2.5培养液中继续在38.5°C、5%⑶2、饱和湿度条件下培养至第7d (G2.5培养108h左右）。第7d记录囊胚发育情况，如图5所示。
[0051] 作为培养基的Gl. 5培养液上还覆盖有石蜡油(Sigma, M8410)，并预先在⑶2培养箱 中平衡至少21UG1.5培养液液滴大小为120~150yL，每个液滴中放18~20枚牛体细胞克隆 胚。G2.5培养液参照Gl. 5培养液也需要覆盖石蜡油，另外，G2.5培养液也是按照Gl. 5培养液 的液滴大小和放置枚数来培养胚胎的。
[0052](二)对比分析结果
[0053] 1)牛体细胞克隆胚中H3K9me 3的修饰水平
[0054] 胚胎培养48h后收集转染bta-miR_125b mimic与对照组(转染control mimic)的 2-细胞期胚胎，定量PCR确认bta-miR-125b mimic转染的胚胎中miR-125b丰度上升（图2)。 免疫印迹检测胚胎H3K9me3的修饰水平，参见图3,图3中GAPDH基因为内参。图3显示出转染 bta-miR-125b mimic后的牛体细胞克隆胚的H3K9me3表观修饰的去除率相对于对照组显著 的降低。图4(a)中DAPI为细胞核染色结果（蓝色），H3K9me3为胚胎免疫染色结果（绿色）， Merged为二者数据的重叠效果，图4(b)所示点状图为相对焚光强度(Relative abundance) 比较，从图4可以看出在转染bta-miR-125b mimic后克隆胚的H3K9me3丰度相对于对照组显 著降低(P〈〇.〇5)。
[0055] 2)牛体细胞克隆囊胚的发育率
[0056] 如表1所示，转染bta-miR-125b mimic对牛体细胞克隆胚胎发育产生影响，可以看 出在电融合时加入bta-miR-125b mimic，可显著提高克隆胚胎囊胚的发育率（36.16 土 1.83Vs30.77±1.35，P〈0.05)
[0057] 表1.转染bta-miR-125b mimic对牛体细胞克隆胚胎体外发育时的影响 luuou」 衣1:「西可|a」的双乃汉肖'竿
;，兄哩肚服双乃二认里反头掘的肚服品 数。4-细胞期胚胎、8-细胞期胚胎、桑椹胚和囊胚的发育率分别在胚胎培养72h、96h、144h和 第七天时检测(Oh代表胚胎激活后转入Gl.5的时刻）。*表示差异显著(P〈0.05)。
[0061 ] 如图5所示，bta-miR-125b mimic处理后得到的牛体细胞克隆囊胚发育质量明显 优于对照组。
[0062] 总之，转染bta-miR-125b mimic的牛体细胞克隆胚胎抑制蛋白Suv39hl，从而有效 减弱体细胞克隆胚在合子激活时期的组蛋白H3K9me3表观遗传修饰水平。牛体细胞克隆胚 胎在合子激活时期的组蛋白H3K9me3表观遗传修饰水平显著低于对照组(P〈0.05)。与对照 组相比，利用bta-miR-125b mimic处理(转染)核移植胚胎之后，可以显著提高牛体细胞克 隆囊胚的发育率和质量，从而可体外高效生产牛体细胞克隆胚胎。
【主权项】
1 · 一种利用微小核糖核酸提尚牛克隆效率的方法，其特征在于:该提尚牛克隆效率的 方法，包括以下步骤:将牛体细胞注入去核卵母细胞，然后利用所述牛体细胞和去核卵母细 胞通过电融合形成胚胎的过程，使预先加入至电融合液的miR-125b或miR-125bmimic转染 入所述胚胎中，从而降低所述胚胎中的H3K9me3,并提高牛体细胞克隆囊胚的发育率和质 量。2. 根据权利要求1所述一种利用微小核糖核酸提高牛克隆效率的方法，其特征在于:所 述去核卵母细胞由具有极体的牛卵母细胞制备得到。3. 根据权利要求1所述一种利用微小核糖核酸提高牛克隆效率的方法，其特征在于:所 述牛体细胞为直径15~20μπι的牛胎儿成纤维细胞。4. 根据权利要求1所述一种利用微小核糖核酸提高牛克隆效率的方法，其特征在于:所 述提高牛克隆效率的方法，具体包括以下步骤： 1) 电融合前在50yL电融合液中加入btaniR-125b mimic，使btaniR-125b mimic在电 融合液中的终浓度为200~500nM;将牛体细胞注入到去核卵母细胞得重构体，将重构体置 于加入有bta-miR-125b mimic的电融合液中进行电融合； 2) 在电融合后对融合得到的牛体细胞克隆胚进行激活处理，激活处理后进行胚胎培 养。5. 根据权利要求4所述一种利用微小核糖核酸提高牛克隆效率的方法，其特征在于:所 述电融合具体包括以下步骤:将重构体在加入有bta-miR-125b mimic的电融合液中预平衡 2~5min;然后采用微电极法进行融合，融合参数为：电压为32V、脉冲时长为20ys、2次脉冲 间隔为l〇ms。6. 根据权利要求4所述一种利用微小核糖核酸提高牛克隆效率的方法，其特征在于:所 述激活处理具体包括以下步骤:将牛体细胞克隆胚于2~5ymol/L离子霉素的mSOF溶液中室 温孵育4min，然后在38.5°C、5%⑶ 2以及饱和湿度条件下于1~2mmol/L6-DMAP的mSOF溶液 中培养4h。7. 根据权利要求4所述一种利用微小核糖核酸提高牛克隆效率的方法，其特征在于:所 述胚胎培养具体包括以下步骤:将进行激活处理后的牛体细胞克隆胚转移到G1.5培养液 中，在38.5°C、5 %C02以及饱和湿度条件下培养4h，再用G1.5培养液清洗该牛体细胞克隆胚 3~5次，继续在G1.5培养液中培养56h;然后将该牛体细胞克隆胚转移到G2.5培养液中继续 在38.5°C、5%C0 2以及饱和湿度条件下培养4~5天。8. 根据权利要求7所述一种利用微小核糖核酸提高牛克隆效率的方法，其特征在于:作 为培养基的G1.5以及G2.5培养液上覆盖有石蜡油，并预先在38.5°C、5 %⑶2以及饱和湿度 条件下平衡至少2h。9. 根据权利要求8所述一种利用微小核糖核酸提高牛克隆效率的方法，其特征在于:所 述G1.5以及G2.5培养液液滴中放置18~20枚牛体细胞克隆胚，G1.5以及G2.5培养液液滴的 体积为120~150yL。
【文档编号】C12N15/877GK106086080SQ201610537461
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月8日
【发明人】张景程, 张涌, 屈鹏翔, 王勇胜
【申请人】西北农林科技大学